EGCG对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及炎症因子调控的影响

EGCG对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及炎症因子调控的影响【摘要】目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯对高糖诱导的大鼠系膜细胞增殖及炎症因子分泌的影响。方法通过体外培养的大鼠系膜细胞进行研究。设立低糖对照组和高糖组，分别培养12、24、48h。CCK细胞计数法检测不同浓度EGCG作用下大鼠系膜细胞的OD值，判断细胞增殖情况。采用ELISA方法检测培养细胞上清中MCP1和ICAM1蛋白浓度。结果EGCG能抑制高糖时系膜细胞的增殖活性，其抑制作用呈剂量和时间依赖的方式。系膜细胞处于高糖环境时，MCP1和ICAM1蛋白表达上调，低浓度的EGCG对MCP1和ICAM1蛋白的抑制效果不明显，高浓度的EGCG能明显抑制MCP1和ICAM1的分泌。结论在体外高糖条件下，大鼠系膜细胞在48h内以增殖为主，一定浓度的EGCG可抑制其增殖。EGCG可在蛋白水平抑制高糖刺激的大鼠系膜细胞MCP1和ICAM1的分泌。

【关键词】糖尿病肾病；系膜细胞；单核细胞趋化蛋白1；细胞间粘附分子1；表没食子儿茶素没食子酸酯

ABSTRACT：ObjectiveToexploretheeffectsofepigallocatechin3gallate(EGCG)onproliferationofmesangialcellsandthecontentsofMonocytechemoattractantprotein1(MCP1)andintercellularadhesionmolecule1(ICAM1)inhighglucoseculturedratmesangialcells.MethodsRatmesangialcellsweredividedintocontrolgroup(lowglucosemmol·L-1withoutEGCG)andexperimentgroups(highglucose25mmol·L-1withEGCG(0,100,200,400μg·L-1),eachgroupwasincubatedfor12,24,48hours.ThegrowthinhibitingeffectofEGCGonmesangialcellswasmeasuredbyCCK8methods.ThelevelsofMCP1andICAM1insupernatantweredeterminedbyenzymelinkedimmunosorbantassay(ELISA).ResultsTheresultsshowedthathyperglycemiastimulatedmesangialcellproliferationandreleaseofMCP1andICAM1.EGCGcouldinhibitcellgrowthinadoseandtimedependentmanner.Inaddition,highconcentrationsofEGCGcouldalsodecreasethelevelsofMCP1andICAM1insupernatant.ConclusionEGCGcansignificantlyinhibitproliferationandsecretionofMCP1andICAM1inhighglucoseinducedratmesangialcells.

KEYWORDS:Diabeticnephropathy;Mesangialcell;Monocytechemoattractantprotein1;Intercellularadhesionmolecule1;Epigallocatechin3gallate

糖尿病肾病是糖尿病特有的慢性微血管并发症，其病变周围常有大量单核/巨噬细胞浸润，后者与细胞粘附分子及化学趋化因子有关。SassyPrigent等[1]证实在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中，肾小球表达过量的细胞间粘附分子1(ICAM1)、VCAM1及单核细胞趋化蛋白1(MCP1)等细胞因子，导致单核巨噬细胞浸润，随后出现IV型胶原链mRNA增加，系膜细胞面积增加及肾小球肥大。说明糖尿病状态下肾组织中粘附分子、趋化因子导致早期单核/巨噬细胞浸润在致肾小球硬化中起着重要作用。

表没食子儿茶素没食子酸酯为绿茶中的一种有效成分。茶多酚具有清除自由基、抗脂质过氧化、抗突变、抗肿瘤、抗炎、抗病毒和增强机体免疫功能等多种生物学效应，对肥胖、糖尿病、肿瘤等多种疾病均有明显的药理作用。本实验采用高糖环境下培养的大鼠肾小球系膜细胞，探讨EGCG干预后对系膜细胞增殖及炎症因子ICAM1和MCP1蛋白影响，初步探索EGCG对糖尿病肾病的保护机制。

1材料和方法

材料

大鼠肾系膜细胞株HBZY1，培养于含10％胎牛血清的正常糖DMEM中，常规置于37℃、5％CO2培养箱中孵育，用％胰蛋白酶消化传代，每周传代2～3次。EGCG购自Sigma公司，纯度98%；正常葡萄糖及高糖DMEM培养液购自美国Gibco公司；FCS购自天津正江科技有限公司；CCK试剂购自上海同仁化学研究所；大鼠MCP1和ICAM1试剂盒购自美国TPI公司。酶标仪为美国产品；细胞分析仪/CASY细胞计数仪为德国CASY公司产品。

方法

CCK8法检测细胞增殖活力

取对数生长期系膜细胞，以2000个/孔铺于96孔板，待细胞贴壁后，吸去原有DMEM培养液，换为1%FCS培养液，培养24h使所有细胞的生长同步化。随即分5组：①NG组，②HG组，③E100组，HG＋EGCG，④E200组，HG＋EGCG，⑤E400组，HG＋EGCG。空白对照组只加低糖培养基而不加细胞。各组分别培养12、24、48h，终止前2h在每个孔内加入10μl的CCK8试剂。应用SpectrafluorPlus光度仪在450nm处测定吸光度。以空白对照组调零，每组设3个复孔。吸光度的改变反应细胞活力的变化。

检测细胞上清中MCP1和ICAM1含量

双抗体夹心酶联免疫吸附法检测细胞上清中MCP1和ICAM1含量，按试剂盒说明书操作。每项指标设6孔，根据标准品的标准曲线求出相应的含量，为排除细胞数目对上清中MCP1和ICAM1含量的影响，对每孔细胞数目进行校正，按每孔细胞数为1×106个来校正所得数据。

统计学处理

采用统计软件包进行统计学处理，率的比较用χ2检验，计量数据采用均数±标准差(±s)，进行方差分析和Studentt检验，以为显着性标准。

2结果

CCK8法检测的各组细胞增殖活力比较

培养48h以内，高糖可促进系膜细胞的增殖(与对照组相比，)。作用早期(12h)EGCG对细胞生长的抑制作用不显着；随作用时间的延长(24h及48h)，各浓度组EGCG的抑制作用明显增强。对于同一浓度的EGCG而言，随着作用时间的延长抑制率升高；对于同一时间而言(24h及48h)随EGCG浓度的升高，抑制作用加强。说明EGCG对细胞生长的抑制作用具有时间、剂量依赖效应。见表1。表1不同浓度、时间的EGCG作用于各组大鼠系膜细胞的OD值比较与NG组比较，*、**；与HG组比较，△、△△

ELISA法检测细胞培养上清液MCP1的含量比较

本研究显示，在实验的48h内高糖可刺激系膜细胞MCP1的合成，在24h时高糖刺激下系膜细胞MCP1的合成达高峰，培养至48hMCP1的分泌已无明显增加。低浓度的EGCG(100μg·L-1)对高糖诱导下系膜细胞MCP1的合成无明显抑制作用。而随着EGCG浓度的增加，400μg·L-1的EGCG干预组可明显抑制MCP1的活性。见表2。表2各组细胞培养上清液中MCP1的含量比较

ELISA法检测细胞培养上清液ICAM1蛋白的含量比较

高糖刺激24h时，HG组上清液中ICAM1的浓度较NG组明显升高()；400μg·L-1的EGCG干预组ICAM1的浓度明显低于HG组()。低浓度EGCG组与HG组相比差别无显着性。见表3。表3各组细胞培养上清液中ICAM1的含量比较与NG组比较，*、**；与HG组比较，△、△△

3讨论

文献报道体外高糖环境对大鼠系膜细胞的生长具有双重作用，在培养的24～48h内可刺激细胞增殖，培养72～96h则抑制细胞增殖，促使细胞发生肥大，这种现象的产生可能与细胞内葡萄糖代谢增加而细胞外渗透压未增加有关。我们将高糖(25mmol·L-1)作用于系膜细胞，发现在48h内高糖促进系膜细胞增殖。本实验中，EGCG和高糖共同培养系膜细胞12、24、48h后，发现EGCG对高糖诱导的系膜细胞增殖有明显的抑制作用，在一定范围内浓度越高，抑制作用越强。

DN早期表现为肾小球系膜细胞增生、小管间质扩张、肾小球系膜区和小管间质细胞外基质积聚。近年来的研究资料显示，细胞外基质的聚集与单核/巨噬细胞在肾组织的广泛浸润有关。而MCP1是单核/巨噬细胞特异性的趋化因子，MCP1介导的单核细胞在肾脏的聚集和活化对DN的发生、发展起重要的作用。有研究显示[4～6]，高糖有直接刺激肾小球系膜细胞MCP1mRNA表达和蛋白合成、分泌增高的作用。在DN发展过程中，ICAM1增强白细胞的粘附，造成相应毛细血管阻塞和内皮细胞损伤，渗出的白细胞和受损的内皮细胞分泌一些细胞因子使ICAM1的表达增多，加重内皮细胞的损伤，造成血管通透性增强，蛋白漏出，形成蛋白尿；漏出的蛋白又刺激细胞外基质的积聚，促进了肾小球硬化的发生。

EGCG在机体的生物学效应与抑制炎症因子是密不可分的[7～9]。因此，本实验探讨了炎症因子ICAM1和MCP1是否参与EGCG对糖尿病肾病的保护机制，发现在高糖环境下ICAM1和MCP1蛋白表达上调。而用EGCG进行干预后，均可抑制ICAM1和MCP1蛋白的分泌，其机制可能是[7～9]：①由于抑制IL6、IL1、TNFα等细胞因子活性，降低肾小球内皮细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞ICAM1和MCP1的表达;②通过抑制AP1途径，抑制细胞因子诱导肾脏细胞合成和分泌ICAM1和MCP1;③直接抑制巨噬细胞活性。综上所述，EGCG在抑制系膜细胞增殖的同时，直接作用于肾组织发挥保护作用，其保护作用至少部分是通过抑制ICAM1和MCP1的产生，从而减轻肾脏炎症反应实现的，这可能为DN的治疗提供了新的思路。同时也证实了炎症是DN发生发展中的一个重要因素，抑制ICAM1和MCP1的表达和活性则有望减轻肾脏损害，而EGCG作为茶叶中的一种有效成分，具有安全性高、副作用小等优点，用于阻断这一病理过程、延缓DN的发生发展将是值得研究的一个方向。

【参考文献】

[1]SassyPrigentC,HeudesD,MandetC,etglomerularmacrophagerecruitmentinstreptozotocininduceddiabeticrats[J].Diabetes,2000,49(3):466

Cosioofhighglucoseconcentrationsonhumanmesangialcellproliferation[J].JAmSocNephrol,1995,5(8):1600

WadaT,YokoyamaH,MatsushimaK,etchemoattractantprotein1:doesitplayaroleindiabeticnephropathy?[J].NephrolDialTransplant,2003,18(3):457

BanbaN,NakamuraT,MatsumuraM,etrelationshipofmonocytechemoattractantprotein1withdiabeticnephropathy[J].KidneyInt,2000,58(2):684

HaH,YuMR,ChoiYJ,etofhighglucoseinducednuclearfactorkappaBactivationinmonocytechemoattractantprotein41expressionbymesangialcells[J].JAmSocNephrol,2002,13(4):894

IhmCG,ParkJK,HongSP,ethighglucoseconcentrationstimulatestheexpressionofmonocytechemotacticpeptid