环境工程仪器分析第四章荧光光度分析法

环境工程仪器分析第四章荧光光度分析法第一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一概述光致发光：有些物质收到光照射时，除吸收某种波长的光外，还会发出比原来吸收管的波长更长的光。荧光（fluorescence）:物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发出的光。分子荧光光谱法：又称荧光光谱法或荧光分析法,是以物质所发射的荧光强度与浓度之间的线性关系为依据进行定量分析,以荧光光谱的形状和荧光峰对应的波长进行定性分析。第三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一一种物质能否发射荧光取决于它的分子结构和它所处的环境第四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一发生荧光的必要条件

第五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一荧光法与紫外可见法的比较

第八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一

荧光分析的基本原理一荧光和磷光的产生

在光线照射下，一小部分的分子吸收了能量，跃迁至较高能级而成为激发态分子。这部分激发态分子不稳定，在很短的时间内，首先因撞击以热的形式损失去掉一部分能量，从所处的激发能级降至第一电子激发态的最低振动能级，然后再由这一能级下降至基态的任何振动能级。在后一过程中，激发分子以光的形式放出它们所吸收的能量，发出的光称为荧光。第九页，共五十三页，编辑于2023年，星期一激发态分子在下降至第一激发态的最低振动能级后，并不直接由此下降到基态的任何振动能级，而是转入亚稳态的三重态。在这里逗留的时间较长（有时长达1s以上），然后再由这里下降到基态的任何振动能级。从三重态降到基态所发出的光为磷光。因激发态分子在三重态逗留的时间稍长，有时在入射光光源关闭之后，还存在磷光。而荧光因激发态分子在很短的时间内便下降至基态，所以入射光源关闭后荧光立即消失第十页，共五十三页，编辑于2023年，星期一分子的激发态——单线激发态和三线激发态

第十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一“三线激发态”比“单线激发态”能量稍低。但由于电子自旋方向的改变在光谱学上一般是禁阻的，即跃迁几率非常小，只相当于单线态→单线态过程的10-6~10-7。

第十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一分子结构与荧光的关系发射荧光的两个条件

①强的紫外-可见吸收；②一定的荧光效率1.跃迁类型

第二十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第二十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一将一个高原子序数的原子引入，常常增强磷光而减弱荧光的，双取代和多取代较难预测，但若能增加分子的平面性，则荧光增强，反之荧光减弱第三十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第三十九页，共五十三页，编辑于2023年，星期一荧光光度计第四十页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第四十一页，共五十三页，编辑于2023年，星期一

荧光光度计及荧光测定方法I0ItF氙灯(或高压汞灯）（200-800nm)光电倍增管荧光光度计部件示意图第四十二页，共五十三页，编辑于2023年，星期一荧光仪部件激发光源:

能够在紫外-可见光区连续发光，常用氙灯、高压汞灯或激光光源.样品池:石英池,四壁透明.单色器:

两个光栅单色器,分置于样品池前后.检测器:

光电池或光电倍增管,

与激发光成直角的方向检测荧光.第四十三页，共五十三页，编辑于2023年，星期一

荧光光度法的应用

生物化学分析，生理医学研究，临床检测.直接测定能产生荧光的物质.

带苯环的氨基酸：色氨酸、酪氨酸、苯基丙氨酸.测定能与荧光试剂反应生成荧光化合物的物质.

荧光生色团标记蛋白质，研究蛋白质的结构；致癌物同核酸结合常引起显著的荧光；无机离子（Mg2+、Al3+、Zn2+、Be+等）可同试剂形成荧光络合物。荧光熄灭法测定猝灭剂

Ni2+对Al-PAN络合物有荧光猝灭作用，可测Ni2+（

6×10-5～6×10-3

g·mL-1）第四十四页，共五十三页，编辑于2023年，星期一NOHHOOHN=NHOSO3Na8－羟基喹啉(Al,Be等)茜素紫酱R(Al,F-等)用于测定无机离子的有机试剂CCOOHH安息香(B,Zn,Ge,Si等)黄酮醇(Zr,Sn等)OOHO第四十五页，共五十三页，编辑于2023年，星期一举例—痕量3,4-苯并芘的测定:

苯并芘萃取（环己酮或石油醚）→浓缩→层析→以H2SO4溶解苯并芘→荧光分析荧光测定：

ex=520nm

em=545nm第四十六页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第四十七页，共五十三页，编辑于2023年，星期一第四十八页，共五十三页，编辑于2023年，星期一测定方法—标准曲线法1.

确定ex和em(激发光谱和发射光谱)；2.确定适宜的条件:试剂浓度、pH、T、t

等；3.以标准溶液做工作曲线；4.

测未知