实验室HBV DNA定量检测的临床意义北京大学

1博士，北京大学基础医学院病原生物学系副教授，硕士研究生导师

SCI期刊《JournalofGastroenterologyandHepatology》、《ArchivesofVirology》和《ImmunologicalInvestigations》和《中国病毒病杂志》、《中华微生物学和免疫学》的长期审稿人

主要研究课题

艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治科技重大专项“十二五”课题“乙型和丙型病毒性肝炎诊断及临床监测的研究”子课题“新研制及优化试剂的质量评价”（批准号：2012ZX10002005-004）；科技部863课题“高灵敏检测试剂及基于基因组的诊疗技术”（批准号：2012AA022605）“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项“十一五”课题“丙型肝炎的临床转归及难治性丙肝的机制和治疗方案优化”（批准号：2008ZX10002-013）。

国家自然科学基金面上项目“HCV慢性感染者和病毒自发清除者外周血单核细胞介导的固有免疫应答特征研究”（批准号：81271826）。沈弢北京大学病原生物学系2013-06-022“十一五”重大传染病专项计划病毒性肝炎重大研究专项启动(2009年)

核心电子器件、高端通用芯片及基础软件新产品极大规模集成电路制造装备与成套工艺新一代宽带无线移动通信网高档数控机床与基础制造装备大型油气田及煤层气开发大型先进压水堆及高温气冷堆核电站水体污染控制与治理转基因生物新品种培育重大新药创制艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治大型飞机高分辨率对地观测系统载人航天与探月工程表1、国家中长期科技发展规划纲要（2006~2020年）确定的重大科技专项Hepatology,2009JHepatol,2012●2012：为了避免乙肝复发，HBVDNA需控制在实时荧光PCR检测不到的水平（＜10-15IU/ml）。HBVDNA的监测是检测治疗失败的关键。●2009：目前，HBVDNA实时荧光定量PCR的灵敏度以达到5-10IU/ml，检测上限以达到8-9log10，用高灵敏度的定量检测试剂准确检测血清HBV-DNA是乙肝抗病毒治疗过程中疗效观察和治疗终点判定的关键因素。超敏感（Hypersensitivity）—乙肝检测灵敏度应达到10-15IU/ml，丙肝检测灵敏度达到50IU/ml，从而帮助医生确定治疗终点，同时及时监测耐药的发生。宽线性范围（widerdynamicrange）—试剂盒线性定量范围应为1-9log10IU/ml，以帮助医生准确测定病毒感染的基线水平，并有效评估抗病毒治疗的效果，为患者提供最优治疗方案。高特异性（Highspecificity）—试剂盒应能够检测肝病毒各基因亚型，有效避免假阴性及漏检情况的发生。可重复性好（Repeatability）—试剂盒操作过程要简单，以最大程度上减少操作误差，同时检测结果的重复性要好，以保证肝病治疗过程中监测指标的准确性和有效性。国际指南对HBVDNA检测的要求我国曾是世界上HBV感染流行最高的地区之一WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2:HepatitisB9.75%1/49300万慢性HBV感染者1/32千万~3千万慢性乙肝患者>1/2~30万肝癌患者全国13亿人口，5-6亿曾感染HBV,占全国总人口近40%1~59岁人群血清HBsAg流行率7.18%(2006)FMLu,etal.J.ofViralHepatitis2009FMLu&HZhuang.ChinessJ.ofMedicineX.Liang,etal.J.ofInfectiousDisease,2009X.Liang,etal.Vaccine,2009（一鉴）竟慢性尚乙型嘱肝炎（二它）曲乙型筐肝炎钻肝硬潜化（三旦）请携带秘者（四已）妄隐匿姓性慢游性乙研型肝永炎慢性牲乙型那肝炎平临床兆诊断芳类型临床花诊断临床叛症状蹈、疾味病史实验较室诊笨断生化妻学检架查HB汪V血清汗学检坡测（抗盆原/抗体竹系统灭）HB彼V乡丰DN圆A（基弹因型洗、亚汤型和都变异柜检测咱）病理喘学诊侵断影像区学诊梯断诊断挣依据慢性HB横V感染酒临床驳诊断HB揭V携带症者(H佩BV健D仿NA仅+)携带点者慢性研乙肝HB朗eA仗g-慢乙醒肝乙肝肝硬杆化乙肝笨相关述肝癌隐匿辜性慢乔性乙贩肝非活变动性HB度sA蒸g携带姜者(H直BV旱D管NA－)轻、雄中、沸重活动糊期和躁静止表期代偿室期失代泉偿期HB筹eA墓g+慢乙融肝医药夸科技刺的进被步已剩经使范慢性想乙型季肝炎低已成幅为可嘱以治描疗的己慢性犬疾病20祖05年我闪国制厦定了灾第一匠部《慢性只乙型径病毒僚性肝岛炎防改治指掀南》规范家的抗座病毒微治疗敲可以懒有效哑地阻储断或抵减缓眼疾病截进展巡寿、减驾少终伟末期识肝病冷的发替生免疫摸耐受稿期HB贸eA挺g+滤H烟Be寒Ag牢-/猪an牺ti宫-H愉Be任+策(p确reC/c厌or售e荷pr捆om维ot何er驴m巩ut淡an妇ts孩)HB陷V附DN京A<朴20起00掌I嘉U/废mL>似20斜00毒I恰U/板mL>2旦x抖107IU滔/m鸭L>2艘x则104IU缩慧/m戴L(H刑Be先Ag逮+究CH路B)(I恒na岸ct苦iv物e-纽奉ca梯rr秒ie占r做st喇at首e)(H让Be擦Ag靠-猴CH刑B)AL砍TNo离rm块al周/mi宣ni鉴ma托l跃ch再an匹ge甲/mi扶ld董C韵HMo斑de衣ra柏te拘/s消ev押er泉e舅CHMo腰de僵ra普te角/s岸ev脾er摇e成CHNo荷rm滑al宝/m米il唉d扣CHmo修de位ra亡te或f帆ib告ro霉si测sCi冻rr吩ho厘si赏sCi输rr校ho记si停sIn睡ac万ti香ve旋c坦ir绪rh丙os怠is2-敲6%馅/y拥r8-气10%/管yr20钥-3撑0%Mo先di背fi块ed添f健ro言m坏Lo沈k行et敞a征l.国H耗ep骄at棵ol淋og伙y佣20企07赏;4忧5:预50悔7-犹53交9Pu钻ng羊pa肝po批ng话e按t淘al糟.破Ma象yo南C隙li锈n直Pr队oc蹄2装00昆7;叙82私:9予67犬-9代75吗.免疫老清除肾期（免孟疫活耽动期带）免疫两控制投期(低病漂毒复匹制期)再活流动期侯金静林教废授惠比许抗病毒治疗抗病毒治疗临床什治疗至的进羽步对贡实验贸室检妨测提替出了梯新的锅要求慢性HB渐V感染拒分期虫及相盛关实声验室艘检测益指标鲁凤圈民，讽庄辉检，乙萍型肝沸炎实乒验室韵诊断乔研究腐进展20呢09慢性俭乙型飘肝炎与的诊剃断开展雪抗病仔毒治织疗的笛重要颈指标偏：HB话eA穗g阳性族慢乙材肝患冤者：HB洽V疫DN些A颗≥2君0弯00熟0葛IU遍/m稻L，伴息有肝今脏损最伤者(A削LT升高折，或怖肝活意检发厅现肝亭脏炎邪症)；HB惹eA浩g阴性殿慢乙邀肝患泛者：HB凳V白DN安A动≥2猜0划00陪I读U/容mL伴有亚肝脏猎损伤脉指标杨，即欺应开仅始抗川病毒推治疗蒙。代偿筐期肝恶硬化鸭患者斧：HB浮V决DN累A+HB墓V声DN诉A的定否量检线测已睬经成兽为临膀床治伴疗的逃关键闷指标HB邀V筋DN抱A的定进量检夏测已务经成头为临岭床治嘉疗的讨关键另指标判断并抗病握毒治执疗疗借效（RG备T）以治疗24周时姜血清HB那V沃DN鸦A绝对路水平翠判断缓：完全决病毒洪学应帜答：低先于60览I泡U/黑mL部分御应答：低于2鬼00衬0旷IU棵/m闷L应答欠不充忆分：60晃I拍U/贫mL～2勒00凑0塔IU站/m识L例如墙：HB厅V右DN叹A载量程检测之在治泊疗优疾化路熄线图碗中的盗作用例如企：HB腐V续DN哑A载量却检测溉在治贞疗优孙化路纽奉线图拘中的他作用HB酷V古DN泛A的定婆量检甚测已仰经成颠为临灵床治长疗的随关键藏指标在多厅个国宰家和骆地区额的慢锅乙肝跌防治按指南柱，均遍把用即灵敏且的PC毒R检测条方法的检测收不到HB城V裂DN弯A作为劝停药栏的重革要指昼证。Do拥me庆st难ic珍AAm表pl族lc匪or弓M念on邪lt污orCo牧ba田s押Ta科qM仓anRe棉al金Ar财t主HB舞V婶LC固P民CR(A沃rt缠us陡Bi档ot宅ec叮h)Ab豆bo情t评R皇ea讲l-鉴ti夜meHB距V叹(A槽bb陷ot墙t)Ve立rs朱an它t机HB黄V惕D锤NA锣1楼.0(k黄PC费R,垫Si涛em柄en鸣s)10102103104105106107108109(I羡U/扇mL虹)HB岩V抵DN寨A定量励检测怎试剂思及其舍检测欣灵敏顺度和龟线性疏范围Do希me确st些ic顺B以上台数据蓄来源真：各喉企业凑试剂社说明水书国产秩乙肝铲病毒DN灿A定量重试剂表在检旋测方丸法上械与进蜂口试块剂存石在明移显差莲别原因策分析一步怎法煮甲沸释省放HB陶V傍DN溜A+定量侵扩增自动追化提萌取制舱备HB振V阶DN倦A+扩增浇检测VS1u模l国产疾试剂闯的实耗际用弯于检寒测的规血清石量仅芽为1快ul20晨0u伤l国内幼现有恩核酸房诚检测棵技术泳流程PC冠R体系叨配置核酸衡提取荧光PC夹R仪器尊操作PC直R体系舌配置丧，核底酸提辅取，只荧光PC损R检测砖。一站愿式全厅自动这检测患！国外继的全锻自动湿核酸跌检测居仪器国产电乙肝楚病毒DN龙A定量滔试剂词质量案的提俗高需熄向系炎统（绵试剂+体系镜）转跨换对策1：技军术进兼步，责全自著动的赤核酸绘提取蚂设备+基于袭开放仿设备芳的定刘量试梢剂√对策2：通岩过行躲政手窄段淘遗汰劣宝质试休剂；√对策3：由尤维价炎格论括→综昂合考婚虑质絮量与武价格√我们耽已经依完成钥配合威自动窜化仪埋器的抱磁珠颜核酸津提取站试剂粗，达圾到国熟外先虾进水剖平。圣湘圈公司螺磁珠砌法提煎取效奖果国外客著名C公司置提取郑效果圣湘畜公司径自主敏研发狠的核绵酸提允取试豆剂（叉磁珠注法）取，实胀现了DN岂A/纹RN惩A共提剧取。服效果殊等效王于国眨外著右名同露类试肢剂。HB哥V灵敏类度可闸达10条IU愈/m回l，HC脉V灵敏念度达20吊IU灿/m研l。10沸IU抄/m允l磁珠雹核酸恒提取谎试剂愁可在念各种辱不同拴仪器喉上进落行下返游检境测30定量毅检测HB弃V感染娃者血粉浆(清)平HB扑V帝DN熊A是了蔽解肝练内HB蔬V复制腔水平晕的可蕉靠指桃标，泼也是HB枯V感染骆诊断梨、疗醒效监血控和黎指导圣用药卫的重舅要指弦标。近年乌，国缓产试只剂的同质量尺得到辱很大惕改进什，但辰多数敌试剂吵的灵译敏度耍、准子确性筛及重敞复性合等与凑进口册优质局试剂暂相比题，仍揉存在盲较大甩差距河。尤丘其对京低病鼻毒载勉量或杏存在存干扰哨物质搭的临膛床标手本进刺行检彻测时荣，差王距更辆为明煮显。目前蜓我国庭市场奋上主宾流的浑国产HB威V恢DN炉A定量伍试剂榴盒多朱是基钩于即产将废答除的遇煮沸勒法核思酸提垒取方利法，昂检测伟下限将一般度为50膛0~怨10戏00折I删U/栗ml，不兔能满押足临需床诊朗断的恭需求术。在国兆家“圣十二.五”传染赛病防卷治重殃大专耐项“乙型庸病毒释性肝屿炎临赴床诊塌断及笋监测庙技术亮的研积究”的支拨持下阶，基属于磁呜珠法劝核酸勺提取耕的国枕产HB悲V巩DN誉A定量银试剂况盒已军成为定主流抽研发楼方向掀。31对国袖产湖欧南圣减湘乙铜型肝清炎病洲毒核月酸定席量检认测（PC征R-荧光爪探针豪法）孤试剂会盒的势可溯婚源性啊、准袖确度迷、精睬密度侵和临村床应虽用进寄行质芒量考足评。32用基修于磁柏珠法探自动碧化核膜酸提骑取平隆台的茫该国棵产HB酷V劲DN到A定量拌试剂愿盒和淡罗氏HB串V喇DN吨A定量令试剂趁盒对WH述O的HB或V课DN办A系列威稀释叶标准装品(5境0、20密0、20局00、20慢0抖00怜I赵U/敢ml林)进行勇溯源真性分罪析，火确定矮试剂班盒检灾测的馒可靠勒性。用这2种试滨剂盒引对HB任V例B和C基因伏型标爽准血挨浆(分别极稀释泰为25、50、20效0、2围00周0、20授0拒00、20甚0俘00胃0减IU巴/m渔l)分别递在三隙个不兴同检从测中遍心共屑进行21祸6次平类行检果测，闸比较绒其准籍确度螺和精木密度光。用2种方看法平卵行检运测5份HB两V笋DN准A阴性此血浆卷样本矛和37份不痛同病护毒载孔量的HB愚V痒DN置A阳性码临床它血浆门标本庭，并粉评价幅其相刚关性伶和符歌合率局。3334罗氏

COBAS罗氏COBASVersion2.0雅培RealtimeHBVDNA湖南圣湘新型HBVDNAkit样本用量850μl500μl200μl或500μl200μl核酸提取方法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法检测下限(LOD)12IU/mL(EDTA血浆)9IU/mL(EDTA血浆)或19IU/mL(血清)10IU/mL或15IU/mL(EDTA/ACD血浆、血清)10IU/mL(血清)线性范围54.5-1.1×108IU/mL20-1.7×108IU/mL10-1.0×109IU/mL(500μl)15-1.0×109IU/mL(200μl)20-2.0×109IU/mL临床特异性100%100%>99.5%100%适用基因型基因型

A-G基因型A-H,包括

pre-core突变基因型A-H基因型A-H储存条件2-8℃2-8℃-20℃orcolder核酸提取试剂2-8℃；扩增反应试剂-20±5℃。有效期18个月25个月12个月9个月35Ro端ch波e涛CO保BA熔SRo皇ch迎e盼CO趴BA璃S旁2.冒0湖南践圣湘滴定度结果报告结果NotdetectedHBV的Ct超出该检测试剂的界限之上或没有得到HBV的Ct值。报告“没有检测到HBVDNA”。<12IU/mL检测到HBVDNA，低于12IU/mL。≥12IU/mL和<54.5IU/mL所得结果低于该测试的线性范围下限，结果具有高度变异性，应谨慎解释。≥54.5IU/mL和≤1.10E+08IU/mL结果在线性范围以内。>1.10E+08IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果报告结果NotdetectedHBV的Ct超出该检测试剂的界限之上或没有得到HBV的Ct值。报告“没有检测到HBVDNA”。<20IU/mL检测到HBVDNA，低于20IU/mL。≥20IU/mL和≤1.70E+08IU/mL结果在线性范围以内。>1.70E+08IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果报告结果<10IU/mLHBVDNA含量低于试剂盒检测下限。≥10IU/mL和<20IU/mLHBV病毒载量低，测定值仅供参考。≥20IU/mL和≤2.0E+09IU/mL结果在线性范围以内。>2.0E+09IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果报告结果Notdetected未检测到目标(Targetnotdetected)<10IU/mL(500μl样本量)<15IU/mL(200μl样本量)检测到HBVDNA，低于线性范围下限。10-1.0E+09IU/mL(500μl样本量)15-1.0E+09IU/mL(200μl样本量)结果在线性范围以内。>1.0E+09IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。AB件BO师TT耍k瘦it36PrincipalInvestigator(负责人）Site（地点）Reproducibility(可重复性检测）Traceability（对WHO标准品的可溯源性分析）鲁凤民北京大学医学部微生物系╳╳谭德明长沙湘雅医院传染病科╳陈德喜首都医科大学附属佑安医院╳37购买垃获得WH著O攻HB百V-祖DN提A标准辈物质五，用施于评称价不凯同公哀司HB蔑V-途DN暖A定量价检测押方法菌的可愁溯源蓝性（tr食ac喜ea跪bi桥li道ty）。HB妹V标准第品将肥用HB冶V阴性ED荡TA抗凝跑血浆住进行孙稀释成。稀挥释浓开度初下步设偏定为50、20夫0、2,订00方0/燥20洗,0富00敢I豆U/克mL四个立临床侄治疗禾关键滑的节脉点浓趟度值被。每天叨每种边仪器恶检测兴上述权稀释田浓度挎样本透一个盲反应涂（含共对照醉管）理。共滨检测桶三天茎（即智每种捞浓度娱检测3次）棍。以上昌检测压均在看北京老大学兆医学保部微编生物降系进纽奉行。38WH杜O南ge枪no哨ty乘pe谷A寻2启P毯an峰elRo黄ch季e统CO属BA幕S马2.喊0Sa封ns乐ur糊eRe喊p杯1Re描p舞2Re拾p守3Re若p奇1Re盯p墨2Re矛p樱3Da蝇y条1:Da蹈y盈2:醉r脱ep持ea石t浑th如e赛ab嚷ov止e揭te竹st罚in枝g台pa逝tt刘er阿nDa驳y套3:含r就ep容ea蹦t激th器e琴ab静ov劈燕e帅te蜂st搬in蜜g谦pa克tt筹er粉nNI粒BS易C：英港国国腐家生农物标痛准与沟检定找所39试剂理论值(IU/ml)理论值(lgIU/ml)实测值(lgIU/ml)相对偏差(lgIU/ml)标准差(lg

IU/ml)圣湘(PCR-荧光探针法)501.6991.524-0.1760.2072002.3012.119-0.1820.20520003.3013.126-0.1750.095200004.3014.145-0.1560.103罗氏

(COBAS2.0)501.6991.579-0.1210.0292002.3012.056-0.2450.09220003.3013.030-0.2710.131200004.3014.135-0.1660.20240由第虾三方森提供荐高浓芝度的HB谊V弊B&雄C亚型怒标准丹血浆址。血蒜浆HB糊V病毒帅载量比须大溉于1,球00蛙0,泼00捎0。以上艰血浆稿用HB版V阴性ED厨TA抗凝悔血浆索进行贪稀释丝式。稀桨释浓蛾度设使定6个评袋价节自点：25、50、20它0、2,反00宾0、20凯,0纷00、20每0,慢00头0浪IU豪/m播L。每天凭每种中仪器树检测猛上述坟稀释答浓度侦样本铸一个争反应肌（含期对照型管）斥。共鸟检测敌三天冤（即舰每种踪蝶浓度皆检测3次）墓。准确叮度判砖断标储准为雀所有叶检测肝节点流上的盟的相易对偏美差均在±0列.3与l刺gIU韵/m咏l之内熟为可姿接受带范围风。精芳确度可判定垃依据披对同捷一检荐测节钱点平躁行检继测9次后俗的变渠异系满数，断变异俩系数博越小吧意味话精确毫度越度高。以上晋检测挑将在牵北京达大学小医学影部微赢生物慰系、衫首都梦医科馋大学娇附属饮佑安淘医院逝、湖染南湘梅雅医陆院传遣染病耻科三笋地多东中心启同时教进行道。HB焦V告B基因枣型标灶准血顷浆：袋卫生室部国脱家临懒检中劫心惠挨赠，妖编号GB移W0驴91婆50，浓墨度为1.扩2×喇106IU拣/m乖l。HB甜V裂C基因之型标排准血陈浆：斩中国仆药品优生物倾制品剖检定伴所惠此赠。巾浓度绝为2×号108IU树/m拒l。41Da倾y枯1:Da扫y畏2:朽r洽ep印ea纪t模th别e示ab恐ov蹲e余te拢st妹in暴g溪pa牙tt产er乓nRe旋p施1Re塞p鸽2Re无p挨3Re赤p改1Re距p遭2Re彼p厚3Sa近ns贴ur伏eGe狠no智ty选pe宣BPa羽ne矩lRo课ch开eRe缝p僵1Re奸p赚2Re围p摆3Re绢p知1Re缎p略2Re怕p意3Sa膛ns案ur猴eGe敬no易ty重pe教CPa调ne愿lRo贱ch弦eDa哈y标3:厨r签ep置ea雀t竞th哑e卖ab衡ov脆e乳te钱st网in笔g废pa信tt短er致n42HBV基因型评价试剂理论值

(IU/ml)理论值

(lg

IU/ml)检测次数实测值

(lg

IU/ml)实测值

(IU/ml)相对偏差(lg

IU/ml)方差（标准差）(lgIU/ml)Lognormal

CV%HBVB型湖南圣湘试剂(PCR-荧光探针法)251.39891.36223.7-0.0360.013(0.114)8.38501.69991.70452.50.0050.017(0.130)7.612002.30192.3412260.040.012(0.110)4.7420003.30193.36123500.060.009(0.097)2.70200004.30194.342226000.0410.012(0.108)2.492000005.30195.3282160000.0270.006(0.079)1.49罗氏试剂

(COBAS2.0)251.39891.64246.90.2440.027(0.167)10.17501.69991.94588.70.2460.003(0.054)2.802002.30192.4913170.190.011(0.106)4.2720003.30193.51833200.2170.003(0.056)1.59200004.30194.581384000.280.003(0.059)1.282000005.30195.3982510000.0970.002(0.048)0.89HBVC型湖南圣湘试剂(PCR-荧光探针法)251.39891.32522.8-0.0730.027(0.166)12.52501.69991.69352.6-0.0060.025(0.157)9.292002.30192.3482370.0470.024(0.155)6.5820003.30193.2952080-0.0060.023(0.153)4.53200004.30194.304204000.0030.006(0.077)1.802000005.30195.3292170000.0280.007(0.083)1.56罗氏试剂

(COBAS2.0)251.39891.540390.1420.049(0.222)14.41501.69991.78564.50.0860.024(0.156)8.752002.30192.277206-0.0240.035(0.188)8.2420003.30193.35123800.050.024(0.154)4.60200004.30194.371258000.070.035(0.188)4.302000005.30195.3252230000.0240.023(0.152)2.8543国产吐新型额试剂剪盒的始检测农结果粮较稳犁定，贺相对剃偏差红均在±0另.1亦lgIU娘/m浸L范围脖内。罗氏气试剂训盒的偶检测轨结果餐尽管期均在笼可接迷受范股围内巩，但雹针对B基因解型标攻准血辣清，捕相对精偏差俘基本泉位于0.龟2～0.装3详lgIU执/m雾l。442种试社剂盒或之间搏精密奥度的绢差异歉无统斑计学却意义斗。452种试过剂盒援对HB触V押DN获A低载妥量血茂浆样犬本检毫测的东变异惧系数畅均显芦著高税于高己载量驰血浆(B基因鼓型：P=0职.0凳03抬1；C基因报型：P=0梯.0挣00篮5)。46临床毙血清每盘：倾共42份,含5份HB皂V柴DN阿A阴性(H览Bs灶Ag和抗