种子资源分子技术

药用植物种质资源鉴定中的分子技术内容目的意义分子标记技术药用植物种质鉴定常用的分子标记技术展望概念

种质资源是育种学中的概念，在遗传育种领域中把一切具有一定种质或基因，可用于育种、栽培及其他生物学研究的各种生物类型总称为种质资源。

药用植物的种质资源则是泛指一切可用于药物开发的植物遗传资源，是所有药用植物物种的总和。种质的优劣对中药的产量和质量具有决定性的作用,因此药用植物种质资源的鉴定是准确确定原植物、确保药效、合理保存利用现有种质、寻找开发新的药用植物等研究工作的基础,在药用植物种质资源研究中具有重要意义。作为种质资源的鉴定方法,早期有形态学标记、细胞学标记与生化标记。然而,早期的鉴定手段都是针对基因的表达产物进行的,受环境影响较大,因此,如何从分子水平揭示种质间差异成为种质资源研究者十分关心的问题。目的意义分子标记技术

20世纪90年代分子标记技术被引入药用植物种质资源鉴定的研究中，极大地促进了该领域的发展，分子标记技术也越来越多的应用于各种属的药用植物的种质资源鉴定。根据其技术特点大致可以分为三类：电泳技术和分子杂交技术为核心的分子标记技术,其代表性技术为RFLP；电泳技术和PCR技术为核心的分子标记技术,其代表性技术有RAPD和AFLP；DNA序列为核心的分子标记技术,其代表性技术有ITS测序分析技术。

限制性片段长度多态性(RFLP)随即扩增多态性DNA(RAPD)扩增片断长度多态性(AFLP)药用植物种质资源鉴定中

常用的分子标记技术

1限制性片段长度多态性(RFLP)

限制性片段长度多态性(RFLP)

是指用限制性内切酶切割不同个体基因组DNA后,含同源序列的酶切片段在长度上的差异。Botsten等于1980年首先提出用RFLP构建遗传连锁图,其基本原理是将不同生物个体的基因组DNA分子采用适当的限制性内切酶切割,将酶切片断电泳后利用探针杂交并放射自显影,就可以得到与探针高度同源的DNA带型。由于植物不同种、属间甚至品种间同源序列的限制性内切酶识别位点各不相同,因此通过比较RFLP片段的多态性,就可以揭示种、属间甚至品种间的差异及相关性。

RFLP标记优缺点RFLP标记具有共显性、可以区别纯合和杂合基因型、稳定、重复性强等优点。目前在某些生物体中开发的RFLP的探针已经遍及整个基因组。然而由于RFLP具有种属特异性，技术复杂，对DNA需要量大、纯度要求高且所需的放射性探针对人体危害大，所以使其应用受到很大限制，此技术在医学上有所发展外，在植物学研究上已经极少使用,在中药上的应用前景也不被看好。RFLP标记的应用2006年,高晓霞等利用真核生物通用引物扩增rDNAITS序列并对扩增产物进行RFLP分析,其ITS-RFLP酶切图谱显示可以对佛手和香橼基缘植物进行分子鉴定。2005年,张婷等对束花石斛、流苏石斛及其形态相似种进行研究,通过PCR-RFLP方法获得ITS片段的限制性图谱。结果显示根据所得的PCR-RFLP图谱,可以鉴别药用植物束花石斛、流苏石斛及它们的形态相似种。并用这种方法鉴定了市场上收集的25件商品束花石斛、流苏石斛新鲜药材的原植物。2004年,赵宣等人用PCR-RFLP方法成功的分析了牡丹组植物种间的关系,并获得了相应的分子证据。另外,苍术属、甘草属、北沙参、柴胡等也有应用RFLP进行资源分析的报道。2随机沿扩增奴多态闭性DN效A洒(R间AP下D)随机摇扩增猫多态富性DN弱A(强RA稻PD楼)是利象用一煮系列(通常压是数模百个)不同蹄的碱必基随测机排樱列的吴寡聚允核苷匙酸(通常抵为9~米10个碱眠基)单链虚作为界引物涉对所东研究纸的基灰因组DN疤A进行PC铅R扩增浇。扩尸增产浙物通迁过电梨泳分役离、螺溴乙盼锭(领EB卖)显色狂来检录测扩分增DN稠A片段躲的多舞态性,这些啊扩增债的DN棒A片段乌的多冠态性每反映毙了基有因组慢相应穗区域酱的DN值A多态番性。RA容PD技术驻的优爬缺点相对燃于RF舟LP来说,驴RA紫PD技术婚具有市技术即简便者易行躲、成选本低摸、DN星A用量漏少、皂引物废无种舒属特朴异性改以及嫁不使托用放河射性杨同位丑素等盾优点,其缺费点则唇主要棉表现排在稳领定性嗓差、界易受六外界侮条件感影响膝、不歼能鉴蛇定杂乏合子跨、结漠果分病析较貌困难霉。RA寇PD技术绒发展阵极为盖迅速,广泛在应用弓于各透属种雷的种吹质资府源鉴造定研汗究之雾中,是目誓前种创质资轿源鉴立定中攀应用秒最多论的分使子标借记技黑术。由于RA角PD稳定系性差,因此,在应竭用RA即PD进行柔研究它时,应积射极摸主索最悼佳反步应条奥件以购及各坚影响置因子扬对反粮应结象果的椅影响温情况,以便沾于对赤研究撇结果注进行递比较,并为雄其应扩用于效生产涝打下判基础毁。RA为PD技术铺的应旋用20危07年,李明泡军等副研究识了山细药基丈因组DN袄A的提混取方虽法并梁对Mg泊2+浓度宋、dN咳TP嫩s浓度飘、引筋物浓排度和Ta奋q酶用诊量进唇行了嗓优化,且声星称建酒立了锤山药RA叹PD技术炎体系,得到侦了29个山反药品郑种的RA何PD指纹罢图谱,在分辈子水戚平上胖为山铸药种议质资创源的君品种棵分类凶、质灭量评扰价以遍及核振心种裁质的滚构建台提供劈燕了依羞据。同年,严奉奇坤等饺建立押了一率种适翁于分显析的茄快速吴提取芝枸杞技叶片衡基因钉组的格方法,并利织用筛齿选出柱的2个随穴机引务物对10份枸华杞材惊料基衔因组疲进行瘦了RA育PD扩增,构建侄了枸五杞属饮基因傍组指划纹图阀谱,为运况用RA撑PD技术祥对枸膏杞基低因组让进行避指纹访图谱床分析淹从而暂进行歌道地狗品种霞的鉴互别、振遗传哭多样帆性及氏亲缘缴关系砖的研旁究提婆供了训参考犬。其程他如净三七馅、山肢东瓜蹲蒌、膝广藿谷香、纪天麻拴、冬捞凌草进、贝惯母、倚巴戟娃天、锄苦叶止七等束药用茫植物测也都质有应愚用RA葱PD技术您进行塌种质伍资源呢鉴定欧研究益的报漠道。然而舰目前迎大部选分研劣究还危仅局蛛限于专探讨RA亚PD技术互在某济一种亏属药啄用植践物种舍质资姨源鉴躁定中洞应用失的可填能性剑上。3扩增得片断买长度馋多态苍性(A遥FL许P)AF阿LP是在RF并LP和PC歇R的基敲础上赤发展根起来丛的,其基说本原治理是瓶通过惠选择钉性扩臣增基孟因组DN烟A的酶严切片沾段来呜获得编不同DN柱A样品非之间半的遗脉传差丧异。生物袋基因劣组DN川A经限烧制性恩内切亚酶酶塑切后,产生糠分子捉量大培小不烤同的感限制警性片根段。衬将特红定的协人工器合成碎的短使的双粘链接害头连乞在这累些片票段的揉两端,形成约一个皱带接且头的篇特异辜片段,通过妄接头铲序列姨和PC竹R引物3′-端选工择性划碱基得的识巡寿别,对特猴异性轿片段因进行梢选择验性扩不增。阿选择律性碱词基的捐种类准、数裤目和赚顺序贩决定捕了扩裹增片受段的宾特殊占性,只有遭那些翅限制飞性位裹点侧案翼的曾核苷帖酸与霜引物挑的选输择性投碱基顿相匹暮配的驶限制起性片辨段才忆可被蒜扩增佣。扩漆增产爽物经兄凝胶唱电泳业分离欢检测,根据责扩增效片段韵长度炸的不呀同检据测出竖多态台性。AF湿LP标记搬优缺普点AF银LP技术橡兼有RF波LP技术敌的可嘉靠性石和PC胞R技术抱的高察效性,具有猎快速趋、灵半敏、成稳定它、所迫需DN争A量少搭、多溜态性激检出牙率高剩、重怒复性止好、叠适应访性广居等优惹点,虽然肆存在醋着费委用高买、操享作技势术难故度大移等缺苗点,但依炭然被烟人们渣认为欺是一装种十碗分理缺想的德、有冷效的帖、先留进的蜘、最贼有力影的分崇子标竖记。湖在药向用植禁物种镜质资失源鉴册定上煮展现光了广画阔的笔应用婚前景磨。AF小LP技术妇的应爬用20昨07年时,郝岗战平等西采用AF旺LP技术猴对山胶东产15个丹命参样既本进链行DN均A多态港性分添析,利用4对引旋物结央合构奋建了15个丹宿参样怨本的DN塌A指纹霜图谱,分析抢结果限表明AF桑LP技术尿可用跃于丹踏参道膝地性联鉴别饶。20凭06年,张瑞挨等通晨过对堂影响敲重楼AF生LP待-银染虫技术怪体系倍的关际键因失素作饥对比底研究,建立匆了一帮套优泊化的僵重楼AF略LP分子躲标记聚体系码。优底化的阿关键晌因素绞为:敲1)奋D目NA采用CT妄AB法从项幼叶膨中提驾取;摘2)酶切较时间嫌为9小时;指3)选择偶性扩箩增时刺退火通温度列为56℃;舌4)从15对引敲物中后筛选睛出4对进叙行选懒择性孤扩增,得到运扩增败条带27恶6条,其中爸多态还性带20霞1条(占72辞.8朗3%尿)。张阵却阵首崖次优韵化并蚂建立喉了红惜花基课因组织的AF备LP技术处体系,在64对引沸物中痒筛选宽出了哄条带练多且焰清晰够的适牢合红呜花AF财LP的48对引垫物组虾合,并通等过反武复的抚基因沿池筛爆选,选出酱了两语条具前有多效态性效的引迈物。息构建教某一纹种属谋植物恩的DN柱A指纹拆图谱肠是目惠前AF嘴LP在药舟用植虾物种卫质资勾源鉴茄定研吓究中啄的主魂要应愁用方行面。20战00年,罗志件勇等士就采扑用AF甚LP技术苹分析话了人公参、朝西洋猫参基表因组DN喷A多态丈性,并成袭功构爬建出龟多态惧性丰算富和饥重复买性好赖的人崭参、抢西洋妖参DN瘦A指纹它图谱,使AF央LP技术收有望舒成为伙一种妥独立君的切贵实可阀行的宝手段桑应用皱于人翅参、锻西洋艺参等犁药用稍植物阶的鉴渗定方犁面。其他究如石假斛属宫、缬犹草属晓、绞是股蓝辨、葱运及韭造等植筋物都脸有应厚用AF悉LP对其封种质事资源科进行纯分析焦的报黑道,为今放后进蛛一步阅应用AF的LP进行泼种质轧资源院鉴定废研究虚提供故了参撑考。理想昼