微生物的生长量的测定方法课件

主讲：李少凤.一个微生物细胞合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用个体的生长原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，引起个体数目的增加。群体内各个个体的进一步生长群体的生长.群体生长=个体生长+个体繁殖个体生长→个体繁殖→群体生长微生物的生长量的测定方法很多，可以根据菌体细胞数量，菌体体积或质量作直接测定，也可以用某种细胞物质的含量或某个代谢活性的强度作间接测定。在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长，这一点与研究大型生物时有所不同。.描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需选用不同的测定指标。（一）微生物细胞数目的检测法直接法（血球计数板）间接法（平板菌落计数法、液体稀释法、滤膜过滤法、比浊法）（二）微生物生长量和生理指标测定法细胞干重法；总氮量测定法；其它生理指标测定法二、微生物纯培养生长的测定方法.原理：将1cm2×0.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出率，或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。（一）微生物细胞数目的检测法1、血球计数板直接计数法.血球计数板是一块特别的厚玻璃片，玻片上有四条沟和两条嵴。中央有一短横沟和两个平台，两嵴的表面比两个平台的表面高0.1mm，每个平台上刻有不同规格的格网，中央1mm2面积上刻有400个小方格(图A)。盖玻片计数室.在血球计数板上，刻有一些符号和数字(图A)，其含义是：XB-K-25为计数板的型号和规格，表示此计数板分25大格；0.1mm为盖上盖玻片后计数室的高；1/400mm2表示将计数室面积1mm2分400个小格，每小格面积是1/400mm2。.血球计数板有两种规格，一种是将1mm2面积分为25个大格，每大格再分为16个小格(25×16)；另一种是16个大格，每个大格再分为25个小格(16×25)。两者都是总共有400个小格。当专用盖玻片置于两条嵴上，从两个平台侧面加入菌液后，400个小方格(1mm2面积)计数室上形成0.1mm3的体积。通过对一定大格内微生物数量的统计，可计算出1mL菌液所含的菌体数（图B)。C两种不同刻度的计数板.计数区的结构原液所含菌体数（mL）=每小格平均菌体数×400×104×稀释倍数.平板菌落计数法2.间接计数法将待测样品进行适当稀释，取一定的菌悬液涂布平板，让微生物的单细胞一一分散在平板上，经适宜条件培养，每个活细胞就会形成单菌落，然后将形成的菌落数乘以稀释倍数，就可推算出样品的含菌数。.特点：简单，灵敏，适用于细菌、酵母菌、芽孢与真菌孢子等数量的测定。不适合测定样品中丝状体微生物，如放线菌、丝状真菌及丝状蓝细菌的营养体。样品中的稀释度控制在每个平板上菌落数在30～300个最好，过多难以计数，过少增大计数误差。平板菌落计数法.★技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（15～20min完成操作），严格无菌操作；★注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度；平板菌落计数法.液体稀释法将待测样品作一系列稀释，一直稀释到取少量该稀释液(如1mL)接种到新鲜培养基中没有出现生长繁殖为止。具体做法是取单细胞菌悬液在定量培养基中做系列稀释培养，在一定稀释度以前的培养基中接上菌，出现生长，而在这个稀释度以后的培养液中没有接上菌，不出现菌的生长，这最后一级出现菌生长的稀释度称为临界级数，从3～5次重复的临界级数求最大概率数(MPN)，就可得到较可靠的结果。2.间接计数法.例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下：稀释度10-310-410-510-610-710-8重复数555555出现生长的管数555410根据上述结果，其数量指标为“541”，查5次重复测数统计表，得近似值为17。乘以第一位数的稀释倍数（105），则原液中的活菌数=17×100000=1.7×106

...薄膜过滤计数法常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。2.间接计数法....在科研及生产中，及时了解微生物的生长情况，测定培养物中微生物的数量，便于适时控制培养条件，获得最佳培养物，比浊法是最常用的测定方法。是在浊度计或比色计上进行测定培养液中微生物的数量。某一波长的光线，通过浑浊的液体后，其光强度将被减弱。入射光一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。特点：快速、简便；但易受干扰。比浊法2.间接计数法.LogItIo—Kcd=It：透过光的强度；Io：入射光的强度；K：吸光系数；c：样品液的浊度；d：液层厚度；透光度LogIt

Io称消光系数，简称OD.当样品液厚度一定，则OD值与样品的浊度C有关，通过测定样品的OD值来代表培养液中的浊度即微生物量。.本法测定的是微生物的总量。适用于非丝状单细胞微生物，如细菌的测定。当待测菌液浓度太大时，要经过适当稀释。使OD值的读数在一定范围内最好。比浊法.将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤的方法分离出来,用清水反复洗涤菌体，直接称重，可得菌体湿重。再经常压或真空干燥，干燥温度可在105℃、100℃或80℃下至恒重，精确称重，即得微生物的干重。丝状真菌用滤纸过滤，细菌用醋酸纤维膜等过滤。在琼脂平板上培养的放线菌或丝状真菌经短时间高温待琼脂溶化后滤出菌丝，洗净、烘干后测干重。该法适合于含菌量，而且样品中不含非菌体的干物质。1、细胞干重法（二）细胞生物量的测定.内容：将青霉菌接种于适宜的液体培养基中。28℃震荡培养5～7d，取定量滤纸一张，在分析天平上称重a，取出青霉菌培养物放在滤纸上过滤，沥干，然后置于80℃干燥箱中烘干至恒重b。菌体的干重=b-a仪器：分析天平、定量滤纸、电热干燥箱菌种：青霉菌的振荡培养物举例：测定培养液中青霉菌的重量.2、总氮量测定法蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。一般细菌细胞干重的含氮量为12%～15%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.5%，因此只要用化学法分析法（凯氏定氮法）测定出待测样品的含氮量，就能推算出细胞的生物量。本法适用于在固体或液体培养条件下微生物总生物量的测定，但需充分洗涤菌体以除去含氮杂质，操作程序较复杂，一般很少采用。.微生物细胞中的DNA含量不高(如大肠杆菌约占3%～4%)，比较稳定，有人估算出每一个细菌细胞平均含DNA8.4×10-5ng，因而可以根据分离出样品中的DNA含量来计算微生物的生物量。3、其他方法DNA含量测定法.测定单位体积培养物在单位时间内消耗的营养物或O2的数量，或者测定微生物代谢过程中的产酸量或CO2量等，均可以在一定程度上反映微生物的生物量。本法系间接法，影响因素较多，误差也较大，仅在特定条件下作比较分析时使用。代谢活性法.Table2.SomeMethodsusedtomeasurebacterialgrowthMethodApplicationCommentsDirectmicroscopiccountEnumerationofbacteriain

milkorcellularvaccinesCannotdistinguishlivingfromnonlivingcellsViablecellcount(colony

counts)Enumerationofbacteriainmilk,foods,soil,water,laboratorycultures,etc.VerysensitiveifplatingconditionsareoptimalTurbiditymeasurementEstimationsoflargenumbersofbacteriainclearliquidmediaandbrothsFastandnondestructive,butcannotdetectcelldensitieslessthan107cellspermlMeasurementoftotalNorproteinMeasurementoftotalcellyieldfromcultures

verydenseonlypracticalapplicationisintheresearchlaboratoryMeasurementofBiochemicalactivitye.g.O2uptakeCO2production,ATPproduction,etc.MicrobiologicalassaysRequiresafixedstandardtorelatechemicalactivitytocellmas