乳酸菌菌种的分离筛选方法解读

乳酸菌菌种的分别精选方法解读乳酸菌菌种的分别精选方法解读/乳酸菌菌种的分别精选方法解读乳酸菌菌种的分别精选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大批乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要供给丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。平常用作为有利微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培育基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培育基常用作为选择性培育基。关于芽孢乳杆菌常用GYP培育基，链球菌有TYC培育基、MS培育基。M17培育基被用作乳球菌的分别培育基。嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特点为：杆菌，两头圆，不运动，无鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。乳酸片球菌细胞呈球状，直径0.6~1.0μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者稀有，不可以链状摆列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS培育基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。乳酸菌在一般琼脂培育基上形成微小菌落，不易察看，因此分别时先富集培育并选择适合的培育基。分别培育基一般增添西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也经常加入醋酸盐，因醋酸盐能控制部分细菌生长，对乳酸菌无害。培育基中增添碳酸钙，乳酸溶解培育基中的碳酸钙形成透明圈，作为分别鉴其他依据，经过对生成的乳酸量进行性能判断。乳酸菌生长生殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分别培育基一般可增添西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均拥有促使生长作用。也经常增添醋酸盐控制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。一.精选方法：溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培育基上产生CaCO3溶解圈，进而精选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的精选。此中培育基中加入CaCO3的作用是：①鉴识能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以保持培育基的PH。精选过程：样品预办理→梯度稀释至10-6→选择适合的稀释度涂布→37℃培育148h→精选产生溶钙圈的菌落频频在MRS培育基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确以为纯种→精选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保留。溴甲酚绿指示剂法：培育基：MRS培育基（含溴甲酚绿酒精溶液）精选过程：同上，不一样样之处是稀释涂布后长出菌落，挑取使溴甲酚绿变色的菌落。二.菌种的分别精选1.培育基：★1.1麦芽汁碳酸钙培育基：麦芽汁（10BX）1L开初灭菌碳酸钙5-10g/LPH自然（分别用）1.2牛肉膏10g/L蛋白胨10g/L酵母膏10g/L番茄汁200g/L葡萄糖10g/L吐温0.05%CaCO315-20g/L溴甲酚绿0.01%（分别用）★1.3番茄汁碳酸钙培育基：酵母膏7.5g/L葡萄糖10g/L番茄汁100mL蛋白胨7.5g/LKH2PO4.0g/L吐温0.5mL（分别用）1.4葡萄糖20g/L酵母膏10g/L1.5蛋白胨8-10g/L酵母膏3-5g/L葡萄糖13-15g/LKH2PO41.5-2.0g/LMgSO0.3-0.5g/LMnSO441.6蛋白胨0.8-1.0g/L糖蜜酵母膏3-5g/L玉米浆0.5-1.0g/LKH2PO40.1-0.3g/LMgSO4葡萄糖8-10g/L（发酵或种子培育基）★★1.7MRS培育基（分别培育计数用）蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂18.0g、蒸馏水1L,pH6.5。（分别培育基），当MRS培育基冷却至45～50℃时,加入已灭菌的碳酸钙,充分混匀,倒平板。1.8BCP培育基（溴甲酚紫培育基）乳糖5.0g蛋白胨5.0g酵母膏3.0g0.5℅溴甲酚紫10ml自来水1000ml（分别用）1.9BCG牛乳营养琼脂：脱脂奶粉10g，溶于50ml水中，加入1.6℅溴甲酚绿酒2精溶液0.07ml，0.075Mpa20min。另取琼脂2.0g，溶于50ml水中，加酵母膏1.0g溶解后调pH6.5-6.8，0.1Mpa20min.趁热在无菌操作下二者混淆平均，倒平板，37℃培育24h，检查能否有杂菌。分别精选：2.1富集培育：取1.0g（1.0ml）于无菌细口瓶中，加入无菌麦芽汁液体培育液于瓶口处，密闭，25-32℃培育48h。若培育基表内出现绢丝涟漪物，镜检杆状，革兰氏阳性，初步定为乳酸菌。以相同方法转接2-3次，接种量3-5℅.2.2菌种分别纯化：溶钙圈法：富集菌液或样品适合稀释至10-7，混菌法分别，先加入10-12mlMRS培育基或麦芽汁培育基，凝结后再注入4-5ml水琼脂培育基，制成厌氧环境，30℃或37℃培育2-3天（温度低时间稍长），可出现针头状或圆形稍扁菌落，四周形成透明圈。挑取透明圈大，培育基变黄的菌落，频频划线纯化2-3次，所得单菌落编号，经镜检后，疑似乳酸菌落接种于MRS培育基培育后保留备用。或接入液体培育基中，25-32℃培育24-48h，此后穿刺于MRS培育基或麦芽汁碳酸钙半固体培育基中，25-32℃培育48h保留备用。2.3性能测定：乳酸菌定性试验：不一样样条件下的产酸速率试验：将分别菌种接种于MRS液体培育基中25℃37℃温度下培育测不一样样菌株不一样样温度的pH。方法1.汲取发酵液10ml，注入空试管中，加入10℅硫酸1.0ml，在加入2.0℅高锰酸钾约1.0ml，此时乳酸转变为乙醛。取滤纸一条，在含氨的硝酸银3溶液中浸润，横搭在试管口上，将试管渐渐加热至沸腾，使乙醛挥发，若管口滤纸变黑，证明有乳酸生成。方法2.纸层析法：张开剂为正丁醇：甲醇：水=80：15：5，毛细血管汲取发酵液，多次点样于新华滤纸上，1.5℅标准乳酸为比较，均衡2小时后进行层析，3℅溴甲酚蓝显色计算Rf值。产酸量测定：5.0ml发酵液于150ml三角瓶中，加中性蒸馏水10-20ml，酚酞指示剂2滴，用0.1mol/l氢氧化钠滴定至微红色。醋酸量（g/100mL）=氢氧化钠摩尔浓度.Vx90.08x10-3/样品毫升数x100同时，进行单要素试验，分别察看醋酸速度，耐高温，耐酒精度，耐低酸度等主要生产性能，选择优势菌株。菌株判断：3.1菌落形态：3.2菌体形态：（革兰氏染色察看）染色镜检：杆状阳性。3.3乳酸菌运动性检测：半固体穿刺法3.4生理生化：3.3.1生化试验：产过氧化氢，产硫化氢，葡萄糖产生，硝酸盐复原，产生吲哚，甲基红，明胶液化，需氧，精氨酸，糖发酵试验。3.3.2生理试验：乳酸菌产酸能力曲线：将精选的乳酸菌接种于MRS液体培育基中，25-32℃培育48h，间隔4-6h测定发酵液pH。食盐对乳酸菌的影响：在MRS液体培育基中，增添0.0℅2.0℅4.0℅6.0℅氯化钠，菌种分别接种于培育基中，32℃培育48h，测定OD值。4溴甲酚绿指示剂法：原理：溴甲酚绿指示剂在酸性环境中呈黄色，碱性环境呈蓝色，分别培育基配制后PH为6.8，加入溴甲酚绿指示剂呈蓝绿色，产酸后菌落四周变为黄色，较简单鉴识。培育基：BCG牛乳营养琼脂初筛：将样品富集液梯度稀释，适温培育，平板上出现扁平的黄色菌落及四周培育基也为黄色初定为乳酸菌。复筛：将典型菌落转接脱脂乳发酵管，若凝结，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色阳性，连续传代若干次培育，精选出3-4h能凝结的乳管保留备用。注：1.乳酸菌精选常在几种培育基同时进行：分别在麦芽汁碳酸钙培育基，番茄汁碳酸钙培育基，BCP培育基（溴甲酚紫培育基）同时进行混菌划线或涂布培育（放厌氧袋），分别25℃37℃培育48h。菌落察看：平板表面形成淡色（黄色或白色）小菌落。麦芽汁碳酸钙培育基表面，菌落四周形成透明圈，BCP培育基（溴甲酚紫培育基）四周使紫色的培育基形成黄色包围圈。触酶反响：厌氧菌一般无触酶（过氧化氢酶），用滴管滴加3.0℅过氧化氢于菌落上，若无气泡产生，证明该菌为触酶阴性。将各样特点菌落分别接入斜面，培育后保留，进一步生理生化试验，以判断分别何种乳酸菌。菌落判断：半固体或双平板琼脂利于乳酸菌的生长，菌落出现早。2.1菌落形态察看：乳白色边沿不齐整，稍呈半球状突出，实心菌落。5个体形态：半透明细杆状链状摆列，大批时呈发丝状聚集。初步以为乳杆菌。2.2生化判断：在吲哚试验中，加入菌种试管无任何变化，为阴性反响。说明该菌不拥有分解色氨酸产生吲哚的能力。明胶液化淀粉水解氢氧化钾试验均为阴性，说明此菌为乳酸菌。（过氧化氢酶复原硝酸盐）糖发酵试验：发酵果糖半乳糖葡萄糖乳糖产酸为阳性反响，其他麦芽糖蔗糖棉子糖鼠李糖产酸为阴性反响。依据手册第九版判断此种乳酸菌为德氏乳杆菌保加利亚亚种。（纤维二糖甘露醇山梨醇七叶苷水杨苷）2.3乳酸菌生长曲线pH-t测定结果：67三.几种乳酸菌精选举例嗜热链球菌：样品根源：市售酸奶培育基：M17改进培育基，培育温度：42℃，需氧状况：兼性厌氧，精选方法：常例的稀释涂布和划线分别8保加利亚乳杆菌：样品根源：市售酸奶，培育基：牛肉浸膏1.5％，酵母浸膏0.5％，葡萄糖3.0％，柠檬酸三铵0.2％，七水硫酸镁0.02％，琼脂1.5％，pH5.1。培育温度：42℃，需氧状况：兼性厌氧，精选方法：常例的稀释涂布和划线分别法。3.双歧杆菌：样品根源：婴儿新鲜粪便，培育基：MRS培育基、NPNL培育基、TYP培育基、PTYG培育基，培育温度：37℃，需氧状况：严格厌氧，精选方法：常例的稀释涂布和划线分别法。念书的利处1、行万里路，读万卷书。2、书山有路勤为径，学海无涯苦作舟。3、念书破万卷，下笔若有神。94、我所学到的任何有价值的知识都是由自学中得来的。——达尔文5、少壮不努力，老大徒伤心。6、黑发不知勤学早，白首方悔念书迟。——颜真卿7、宝剑锋从磨砺出，梅花香自严寒来。8、念书要三到：心到、眼到、口到9、玉不琢、不可以器，人不学、不知义。10、一日无书，百事荒弃。——陈寿11、书是人类进步的阶梯。12、一