发酵工程（同课异构）【知识精讲+拓展提升】高考生物一轮复习课件

发酵工程第十单元生物技术与工程一、传统发酵技术与发酵工程发酵发酵工程发酵是指人们利用微生物，在适宜的条件下，将原料通过微生物代谢转化为人类所需的产物的过程。(P5)指利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品。它涉及菌种的选育和培养，产物的分离和提纯等方面。（P1）原料人类所需产物适宜的条件微生物代谢(复杂分子)(简单分子)蛋白质、多糖氨基酸、抗生素一、传统发酵技术和发酵工程直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次发酵保存下的面团、卤汁等发酵物中的微生物进行发酵、制作食品的技术。传统发酵技术让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制环境中蛋白质脂肪小肽氨基酸甘油脂肪酸++酵母、曲霉和毛霉等多种微生物(毛霉起主要作用)创造毛霉生长环境防止杂菌污染，避免豆腐的腐败由酒及各种香辛料置成，抑制微生物的生长同时增加风味和口感1.传统发酵食品的制作-腐乳菌种名称生物分类代谢类型适宜温度繁殖方式发酵对氧的需求乳酸菌酵母菌醋酸菌真核生物异养兼性厌氧出芽生殖先需氧，后厌氧原核生物异养需氧30-35℃二分裂一直需氧原核生物异养厌氧二分裂密闭厌氧18-30℃18-20℃C2H5OH+O2→CH3COOH（醋酸）+H2O+能量酶②酵母菌先在有氧条件下大量繁殖②再在无氧条件下进行酒精发酵C6H12O6+6O2+6H2O→6CO2+12H2O+能量酶C6H12O6→2C2H5OH（酒精）+2CO2+能量酶③醋酸菌在氧气、糖源充足时,将糖分解成醋酸C6H12O6+2O2→2CH3COOH+2CO2+2H2O+能量酶③当缺少糖源时，将乙醇变为

乙醛，再将乙醛变为醋酸①乳酸菌在无氧条件下将糖分解成乳酸C6H12O6→2C3H6O3（乳酸）+能量酶1.传统发酵食品的制作配置盐水原料处理蔬菜装坛加盐水封坛发酵用清水和食盐配制质量百分比为5%-20%的盐水，并将盐水煮沸，冷却待用；Q1：食盐的作用Q2：盐水的浓度Q3：盐水煮沸的原因Q4：盐水冷却的原因过高：乳酸发酵受抑制，泡菜风味差；过低：杂菌易繁殖，导致泡菜变质。调味、抑制其他微生物的生长杀菌除氧防止杀死乳酸菌1.传统发酵食品的制作-泡菜将新鲜蔬菜洗净，切成块状或条状，混合均匀，晾干后装入泡菜坛内；装至半坛时，加入蒜瓣、生姜及其他香辛料，继续装至八成满；在泡菜发酵初期，酵母菌等较为活跃，发酵产物中有较多的CO2，防止发酵液溢出坛外；防止因装太满使盐水未完全淹没菜料而导致菜料变质腐烂；配置盐水原料处理蔬菜装坛加盐水封坛发酵1.传统发酵食品的制作-泡菜将冷却好的盐水缓缓倒入坛中，使盐水没过菜料，盖好坛盖；创造无氧环境Q1：盐水没过菜料的原因Q2：泡菜坛应该符合什么要求？气密性良好，给泡菜坛内创造无氧环境，严格控制厌氧条件*使用前检查气密性：坛口向上，压入水中，看坛内壁有无渗水现象。配置盐水原料处理蔬菜装坛加盐水封坛发酵1.传统发酵食品的制作-泡菜向坛盖边缘的水槽中注满水，并在发酵过程中注意经常向水槽中补充水；根据室内温度控制发酵时间；Q1：水槽中注满水以及补充水的原因严格控制厌氧条件Q2：控制发酵时间的原因发酵期间，乳酸的质量百分比为0.4%-0.8%时，泡菜的口味、品质最佳配置盐水原料处理蔬菜装坛加盐水封坛发酵1.传统发酵食品的制作-泡菜时期乳酸菌乳酸亚硝酸盐发酵前期发酵中期发酵后期变化曲线泡菜发酵过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的含量变化少（O2抑制乳酸菌活动）少增加（硝酸盐还原菌作用）最多（乳酸菌比其他杂菌更耐酸。乳酸积累，抑制其他菌活动）增多达到最多后开始下降（硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解）减少（乳酸积累，pH下降，抑制乳酸菌活动）继续增多，最后保持稳定下降至保持相对稳定（硝酸盐还原菌被完全抑制）1.传统发酵食品的制作-泡菜【典例1】红酸汤是一种很有特色的火锅底料,制作流程如图所示。请回答以下问题:(1)密封发酵时,常在坛中加入成品红酸汤,其目的是________________________。乳酸发酵的过程即为乳酸菌进行__________的过程,该过程发生在乳酸菌细胞的____________中。

细胞质基质增加乳酸菌含量以缩短制作时间无氧呼吸(2)装坛时坛口留有一点空间而不装满的目的是__________________________,红酸汤腌制过程的初期会有气泡冒出,但气泡的产生逐渐停止,试分析原因是________________________________________________________________________________________________________________________________。

防止西红柿发酵后液体膨胀外溢刚入坛时,西红柿表面的杂菌呼吸产生二氧化碳,随着乳酸积累抑制了杂菌的生长,乳酸菌产生乳酸的过程不产生二氧化碳(3)亚硝酸盐的含量影响红酸汤的品质,在发酵过程中影响亚硝酸盐含量的因素有____________________________________________。

温度、食盐用量、腌制时间、腌制方法等1.传统发酵食品的制作-果酒果醋项目果酒果醋菌种酵母菌醋酸菌温度18～30℃30～35℃时间10～12d7～8d氧气条件前期需氧，后期不需氧需氧排气或充气情况发酵旺盛期的CO2产量非常大，要及时排气，防止发酵瓶爆裂适时通过充气口充气，保证充足的氧气条件气味或味道酒味酸味气泡和泡沫有气泡和泡沫无气泡和泡沫发酵液颜色混浊混浊，液面形成白色菌膜检测指标嗅味和品尝、用酸性重铬酸钾检测酒精含量、测定pH、进行酵母菌的镜检等工作观察菌膜的形成、嗅味和品尝、测定pH、进行醋酸菌的镜检等工作器具消毒冲洗葡萄榨汁装瓶果酒检测酒精发酵将发酵瓶、榨汁机等器具用洗洁精清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，晾干备用1.传统发酵食品的制作-果酒果醋取新鲜葡萄，用清水冲洗1-2次，再去除枝梗和腐烂的籽粒，沥干Q1：新鲜葡萄、去腐烂籽粒Q2：冲洗Q3：先洗葡萄，再去枝梗的原因防止带入杂菌造成发酵液污染洗去浮尘，防止洗掉葡萄皮上的酵母菌防止除去枝梗时葡萄皮破损导致杂菌污染器具消毒冲洗葡萄榨汁装瓶果酒检测酒精发酵在发酵的最初阶段使酵母菌的有氧呼吸，大量繁殖产生足够的菌种；防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。用榨汁机榨取葡萄汁，将葡萄汁装入发酵瓶（注意：要留有大约1/3的空间），盖好瓶盖初期需氧、后期无氧1.传统发酵食品的制作-果酒果醋空气进入发酵品会破坏无氧环境以及杂菌污染将温度控制在18-30℃进行发酵，在发酵过程中，每隔12h左右将瓶盖拧松一点（注意：不是打开瓶盖），此后再拧紧瓶盖。发酵时间为10-12d.Q1：拧松Q2：不是打开瓶盖适时排气，以平衡气压结构作用酒精发酵充气口排气口出料口器具消毒冲洗葡萄榨汁装瓶果酒检测酒精发酵可通过从发酵瓶口取样来对发酵的情况进行检测(P8T3)通入空气关闭排出CO2打开便于取样监测关闭Q1：为什么排气口胶管长而弯曲？Q2：该装置还能继续改进吗？防止空气中的微生物污染可以在充气口填充棉花或者安装其他过滤装置，以防止充入的气体携带外来杂菌污染发酵液等1.传统发酵食品的制作-果酒果醋结构作用醋酸发酵充气口排气口出料口器具消毒冲洗葡萄榨汁装瓶果酒检测酒精发酵打开瓶盖盖上纱布果醋检测当葡萄酒制作完成后，打开瓶盖，盖上一层纱布，进行葡萄醋的发酵。发酵温度为30～35℃，时间为7～8d。通入空气排出CO2便于取样监测打开，并接入气泵打开关闭Q1：在制作果酒的过程中，除了酵母菌，是否还有其他微生物生长？它们会对果酒发酵产生影响吗？如果有，如何避免这种影响？

果酒中除了酵母菌，还有乳酸菌、醋酸菌等微生物。

乳酸菌可能分解果酒中的糖从而使果酒变质。可以通过调节发酵的温度、果酒的pH等来控制乳酸菌的含量。由于醋酸菌在有氧的条件下才能进行旺盛的代谢活动，因此在制作果酒的过程中尽量减少O2含量，可以抑制醋酸菌的生长繁殖。此外，通过调节发酵的温度、果酒的pH等同样可以控制醋酸菌的含量。Q2：在制作果醋的过程中，酵母菌是否还会继续发酵？醋酸菌从何而来？采用什么措施可以加快果醋的制作？

随着醋酸发酵的进行，发酵液的pH、发酵温度等均不利于酵母菌的生长繁殖，因此酵母菌活性很低。

在我们的实验条件下，当打开瓶盖后，空气中的醋酸菌会进入发酵液中大量繁殖，其他的菌因不适应环境条件而不能繁殖。我们制作果醋时，可以先买一瓶醋，将其打开暴露于空气中，一段时间后在醋的表面会有一层薄膜（实际上是醋酸菌），用这层薄膜进行接种可以明显缩短制作果醋的时间。【典例2】(2022·天津质检)图甲是传统发酵技术的装置图，图乙是果酒和果醋制作过程中发生的物质变化。下列有关叙述中，错误的是(

)A．甲装置既可用于果醋的制作，也可用于果酒的制作B．使用甲装置制作果醋时，要打开阀a，关闭阀bC．制作果酒和果醋的过程中，发酵液的pH都会降低D．过程③和④都需要氧气的参与，但反应场所不同B【典例3】《齐民要术》记载了一种称为“动酒酢(“酢”同“醋”)法”的酿醋工艺：“大率酒一斗，用水三斗，合瓮盛，置日中曝之。七日后当臭，衣(指菌膜)生，勿得怪也，但停置，勿移动，挠搅之。数十日，醋成”。下列有关叙述错误的是A.该方法的原理是醋酸菌在缺少糖源时可将乙醇最终转化为乙酸B.加水的目的是对酒进行稀释，避免酒精浓度过高杀死醋酸菌C.“衣”位于变酸的酒表面，是由原酒中的酵母菌大量繁殖形成的D.挠搅有利于酒精与醋酸菌充分接触，还可以增加溶液中的溶解氧C【典例4】我国制作泡菜的历史悠久。清末曾懿《中馈录》中记载：“泡盐菜法，定要覆水坛。……。坛口上覆一盖，浸於水中，……。泡菜之水，用花椒和盐煮沸，加烧酒少许。……。如有霉花，……。”下列相关叙述错误的是

(

)A．发酵初期出现的气泡可能来自菜上附着的酵母菌的细胞呼吸B．“坛口上覆一盖，浸於水中”是为了创设坛内的无氧环境C．“泡菜之水，用花椒和盐煮沸”，其目的就是为了调味D．“如有霉花”说明泡菜遭到污染，可加适量烧酒抑制杂菌生长C【典例5】(2022·烟台调研)泡菜的制作容易受环境条件的影响，温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短等，均会造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。某研究小组以“测定泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化”为课题开展了如下研究。①取3个泡菜坛，分别编号为A、B、C。②向3个泡菜坛内分别加入调味料和0.6kg洗净的新鲜大白菜。③向3个泡菜坛内分别加入2L浓度依次为3%、5%、7%的食盐水。④密封后置于相同的环境中发酵。⑤测定亚硝酸盐的含量。在封坛前进行第一次测定，以后定期测定，并将测定的数据绘制成曲线图，如下图所示。(1)制作泡菜的主要菌种是________，其代谢类型是_____________。(2)该实验的自变量是____________。实验中食盐水需煮沸并冷却后才可使用，原因是______________________________。乳酸菌异养厌氧型食盐水的浓度煮沸灭菌，冷却避免高温杀死乳酸菌等发酵菌种【典例5】(2022·烟台调研)泡菜的制作容易受环境条件的影响，温度过高、食盐用量过低、腌制时间过短等，均会造成细菌大量繁殖，亚硝酸盐含量增加。某研究小组以“测定泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量的变化”为课题开展了如下研究。①取3个泡菜坛，分别编号为A、B、C。②向3个泡菜坛内分别加入调味料和0.6kg洗净的新鲜大白菜。③向3个泡菜坛内分别加入2L浓度依次为3%、5%、7%的食盐水。④密封后置于相同的环境中发酵。⑤测定亚硝酸盐的含量。在封坛前进行第一次测定，以后定期测定，并将测定的数据绘制成曲线图，如下图所示。(3)图中浓度为3%的食盐水的测定结果，说明______________________________。(4)为了使实验结果更准确，测定亚硝酸盐含量时应______________________。食盐水浓度过低会导致亚硝酸盐含量过高多次测定后取平均值营养协调pH适宜碳源氮源防止杂菌污染稳定、温和自然界基因工程2.发酵工程产物浓度过滤沉淀蒸馏、萃取2.发酵工程

具体应用成果食品

传统的发酵产品

酱油（霉菌）、酒类（酵母）医药农牧业肥料农药饲料食品添加剂酶制剂工程菌改造菌种柠檬酸（黑曲霉）、谷氨酸（谷氨酸棒状杆菌）淀粉酶、果胶酶、脂肪酶和氨基肽酶等生长激素释放抑制激素青霉素疫苗乙型肝炎疫苗2.发酵工程-应用根瘤菌肥、固氮菌肥（根瘤菌和固氮菌）多种农林虫害（苏云金杆菌）、玉米螟和松毛虫（白僵菌）、水稻枯纹病（井冈霉素）淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液通过发酵获得微生物菌体（单细胞蛋白）

具体应用成果其他方面解决资源短缺和环境污染问题对极端微生物的利用2.发酵工程-应用酒精、乙烯（纤维素废料）洗涤剂（嗜热菌、嗜盐菌）完成酵母菌的繁殖，大部分糖的分解和代谢物的生成。发芽焙烤碾磨糖化蒸煮发酵消毒终止低温、密闭、储存一段时间→澄清、成熟的啤酒释放淀粉酶杀死种子胚但淀粉酶不失活淀粉分解加啤酒花产生风味组分终止酶作用糖浆灭菌杀死啤酒中大多数微生物主发酵后发酵啤酒的工业化生产流程(P23“图1-­9”)某生产谷氨酸的发酵装置，在中性和弱碱性条件下会积累谷氨酸，但在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N­乙酰谷氨酰胺，由此可知__________________________________________________________________。为了缩短发酵时间，确保品质稳定，工业上大规模生产时，其主要做法是_________________________________________________的工业化生产流程”环境条件不仅影响微生物的生长繁殖，而且也会影响微生物代谢物的形成先通过微生物培养技术获得单一菌种，再将它们接种到物料中进行发酵（P27）单细胞蛋白是以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得的大量的微生物

。其不仅含有丰富的

，还含有糖类、

和维生素等物质。菌体蛋白质脂质（P28）青霉素发酵是高耗氧过程，如何能够在发酵过程中给微生物持续高效地供氧呢？(提示：血红蛋白具有携带O2的能力。)可以用基因工程的方法，将血红蛋白基因转入青霉素生产菌来提高菌体对氧的吸收和利用率。②在青霉素发酵过程中，总有头孢霉素产生。人们通过对青霉素生产菌代谢途径的研究发现，在青霉素与头孢霉素的合成过程中，它们有一个共同的前体，这个前体经过两种不同酶的作用分别合成两个产物。如何改造青霉素生产菌使其只生产青霉素，或者只生产头孢霉素呢？可以对两种酶的基因进行改造或敲除其中一种酶的基因，从而使青霉素生产菌只生产一种产物。A．发酵中所使用的谷氨酸棒状杆菌菌种可从自然界筛选也可通过诱变育种、杂交育种或者基因工程育种获得B．为了保证发酵产品的产量和品质，图中发酵配料及发酵罐需经过严格的灭菌C．在发酵过程中，通过加料口取样，随时监测产物浓度和微生物数量D．图中发酵过程需通入无菌空气，并通过搅拌使培养液与菌种充分接触后关闭通气口【典例6】发酵工程是指采用现代工程技术手段，利用微生物的某些特定功能，为人类生产有用的产品。常用好氧菌谷氨酸棒状杆菌利用图1的发酵罐来大量生产味精，发酵流程如图2所示。下列叙述正确的是(

)B二、微生物的培养技术及应用分类标准培养基种类培养基特点作用物理性质固体培养基加凝固剂，如琼脂微生物的分离与鉴定、活菌计数、保藏菌种液体培养基不加凝固剂常用于工业生产功能选择培养基在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长微生物的选择、分离鉴别培养基在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物微生物的鉴定成分来源天然培养基用化学成分不明确的天然物质配制常用于工业生产合成培养基用已知的化学物质配制分离、鉴定等1.培养基的分类各种培养基的配方不同，一般都含有水、碳源（提供碳元素的物质）、氮源（提供氮元素的物质）和无机盐等营养物质，此外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。例如：牛肉膏蛋白胨培养基微生物乳酸杆菌霉菌细菌厌氧微生物特殊条件添加维生素pH调至酸性pH调至中性或弱碱性无氧2.培养基的组成消毒灭菌概念使用较为温和的物理、化学或生物等方法杀死物体表面或内部一部分微生物。使用强烈的理化方法杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。常用方法煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒湿热灭菌、干热灭菌、灼烧灭菌适用对象操作空间、操作者的衣着和手等器皿、接种用具、培养基等3.无菌技术方法条件作用对象消毒煮沸消毒法100℃，煮沸5～6min杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢。用于家庭餐具等生活用品的消毒巴氏消毒法62~65℃消毒30min或80~90℃处理30S~1min杀死牛奶中绝大多数微生物，并且基本不会破坏牛奶的营养成分。牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温灭菌的液体消毒化学药物消毒法用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒；石炭酸、煤酚皂溶液；一定浓度的食醋皮肤、伤口、动植物组织表面和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等紫外线消毒紫外线照射30min照射前，适量喷洒石炭酸、煤酚皂溶液等消毒液，可以增强消毒效果方法条件作用对象灭菌湿热灭菌利用沸水、流通蒸汽或高压蒸汽进行灭菌的方法。其中高压蒸汽灭菌效果最好，100kPa、121℃维持15～30min培养基及多种器材、物品干热灭菌在干热灭菌箱内，160～170℃条件下，加热2～3h耐高温和需保持干燥的物品，如玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等灭菌灼烧灭菌直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速地灭菌微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等在微生物学中，将接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体称为培养物。由单一个体繁殖所获得的微生物群体称为纯培养物。获得纯培养物的过程就是纯培养。4.微生物的纯培养菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。纯培养方法：平板划线法和稀释涂布平板法。纯培养的原理：将单个微生物分散在固体培养基上，之后经培养得到的单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物(单菌落)。酵母菌的纯培养步骤配制培养基、灭菌、倒平板、接种、分离和培养等步骤。★倒平板的操作Ⅰ、培养基灭菌后需要冷却至50℃左右时才能倒平板。Ⅱ、将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，不要完全打开，以免杂菌污染培养基。Ⅲ、培养基冷却凝固后，要将培养皿倒置的原因：

防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。Ⅳ、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板应

，因为Ⅴ、整个操作过程要在酒精灯火焰旁进行，避免杂菌污染。4.微生物的纯培养弃用空气中的杂菌可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生。灼烧时期目的取菌种前每次划线前接种结束后Q1:为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？杀死接种环上原有微生物。杀死上次划线时残留菌种，使下一次划线的菌种直接来源上次划线的末端杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。Q2：在灼烧接种环之后，要等其冷却后再进行划线的原因？以免接种环温度太高，杀死菌种。————————■链教材资料·发展科学思维■———————4.微生物的纯培养————————■链教材资料·发展科学思维■———————Q4：平板冷凝后，要将平板倒置的原因是什么？因为平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，平板倒置后，既可避免培养基表面的水分过快地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。Q5：在接种前随机取若干个灭菌后的未接种的平板，先行培养了一段时间，这样做的目的是

。检测培养基平板灭菌是否合格4.微生物的纯培养Q3：在作第二次以及其后的划线操作时，总是从上一次划线的末端开始划线的原因？

使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，以便获得单个菌落。【典例7】大肠杆菌是寄生于人和动物肠道中的细菌，利用其代谢产物能与染料伊红美蓝反应，使菌落呈黑色的特性，从而将其鉴别出来。表格是其培养基配方，相关叙述错误的是

(

)A.培养基配方中X的成分可以是琼脂B．该培养基中蛋白胨提供的主要营养有碳源、氮源和维生素C．可采用干热灭菌法对该培养基灭菌D．可利用培养基上菌落的特征来判断和鉴别大肠杆菌的存在成分蛋白胨乳糖磷酸二氢钾X蒸馏水2%伊红水溶液0.5%美蓝水溶液含量10g10g2g20～30g1000mL20mL13mLC

【典例8】鲸死亡后会沉入海底，俗称“鲸落”。“鲸落”后期会形成一个以厌氧菌和硫细菌等为主体的生态系统。厌氧菌以“鲸落”肌肉中的脂肪为食，同时产生一些硫化氢等硫化物。硫细菌将硫化物氧化成硫酸盐，并以该过程中释放的能量合成有机物。请回答相关问题：(1)培养微生物的培养基中一般都会含有水、无机盐、氮源和碳源，培养“鲸落”群落中厌氧菌的碳源必须是_________________。要培养硫细菌，培养基中的成分需要特殊配制，主要体现在__________________________________，这种培养基可以用来专一性培养硫细菌，所以称为______培养基。(2)在分离“鲸落”中的微生物时要制备固体培养基，在倒平板操作后，将平板倒置，这样做的目的是_________________________________________________。含碳有机物(或脂肪)碳源必须是含碳无机物(或碳酸盐)，选择防止培养皿皿盖上凝结的水珠落入培养皿造成污染，防止培养基中的水分过快挥发同时加入硫化物(3)为了研究“鲸落”中含有微生物的情况，需将“鲸落”提取物加水稀释，然后将稀释水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，这种方法称为________________。下面所示的四种菌落分布情况中，不可能由该方法得到的是________。(4)若想得到“鲸落”中某目标菌种，可用平板划线法进行纯化。若下图甲是接种培养后的菌落分布图，对应的平板划线操作示意图为________。图甲中的③更易获得单菌落，判断依据是___________________________。每次划线的菌种都来自上一次划线的末端，最后一次划线结束时更容易获得单菌落稀释涂布平板法D丙方法平板划线法稀释涂布平板法纯化原理接种工具单菌落的获得用途接种效果图相同点通过连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散将菌液进行一系列等比稀释后,分别涂布到固体培养基表面培养，以得到单菌落。接种环涂布器从最后划线区挑取稀释度合适的整个平板上都可找到单菌落分离纯化菌种，获得单菌落①分离纯化菌种，获得单菌落②用于计数①都能分离纯化菌种

②都在固体培养基上进行的尿素［CO(NH2)2］含氮量高，化学性质稳定，是现代农业生产中一