土壤中金霉素的降解-毕业论文

PAGE13毕业论文题目：土壤中金霉素的降解目录TOC\o"1-4"\h\uHYPERLINK1前言 5HYPERLINK2实验部分 5HYPERLINK2.1仪器与试剂 5HYPERLINK2.1.1实验仪器 5HYPERLINK2.1.2实验试剂 6HYPERLINK2.2标准物质及溶液配制 6HYPERLINK2.3土壤样品的制备和提取 6HYPERLINK2.3.1土壤样品的制备： 6HYPERLINK2.3.2金霉素的提取 6HYPERLINK2.4HPLC-UV测定色谱柱：YP-ODS柱（C18柱）: 7HYPERLINK2.5金霉素的降解试验 7HYPERLINK2.5.1降解浓度的设立 7HYPERLINK2.5.2土壤处理 7HYPERLINK2.5.3称取土样 7HYPERLINK2.5.4降解试验 7HYPERLINK3实验结果与讨论 7HYPERLINK3.1HPLC-UV色谱分析条件的确立与优化 7HYPERLINK3.2土壤样品提取条件的确定优化 9HYPERLINK3.3降解试验结果 9HYPERLINK4结论 11HYPERLINK5资金支持 11土壤中金霉素的降解指导教师∶（河北北方学院理学院化学系，河北张家口075000）摘要:建立了金霉素的高效液相色谱-紫外（HPLC/UV）测定法，采用室内模拟培养试验研究了金霉素样品在土壤中的动态变化以及降解情况.均质样品用PH4.0±0.5Mcllvaine-Na2EDTA缓冲溶液提取，经超声、离心，水性膜过滤后，采用HPLC/UV检测.金霉素在0.05~0.8μg/mL浓度范围内线性关系良好，相关系数r均大于0.99.在0.05、0.10、0.15mg/kg的加标水平下，回收率为86.44%~96.18%.结果表明，金霉素(添加浓度4mg/L，8mg/L，16mg/L)能在土壤中迅速进入降解，半衰期为1d，含量变化呈“L”型.关键词:高效液相色谱；金霉素；土壤；降解ThedegradationofchloroteracyclineinsoilYanChengcheng(DepartmentofChemistry，CollegeofScience,HebeiNorthUniversity，ZhangjiakouHebei，075000,China)Abstract:ThispaperdevelopedtheHPLC/UVtodeterminetheresiduesofchloroteracyclineinsoilsample,andstudiedthedynamicchangesandthedegradationofchloroteracyclinebytheindoorsimulationtrainingtest.HomogeneoussampleswereextractedbyMcllvaine-Na2EDTAbuffersolution(PH4.0±0.5),wasultrasonicextractedandcentrifuged,thentheextractivesolutionwasthroughthemembranefiltration,anddetectedusingHPLC/UV.Thelinearconcentrationofchloroteracyclinerangedfrom0.05µg/mLto0.8µg/mL,andthecorrelationcoefficientwasabove0.99.Therecoverieswere86.44%~96.18%.Theresultsshowedthatthechloroteracycline（dosage4mg/L,8mg/L,16mg/L）canquicklybedegradatedinsoilandthechangesofcontentshowed"L"type.Keywords:highperformanceliquidchromatography(HPLC);chloroteracycline;Soil;degradation1前言金霉素(chloroteracycline，CTC)属于四环素类抗生素药物，是由链霉菌产生的一类广谱抗生素，分子结构如图1所示，主要用于防治动物肠道感染和促进动物生长，在猪和肉鸡上应用最为广泛[1].图1金霉素分子结构研究表明，动物饲喂四环素后，有25%～75%甚至70%～90%被排放到粪便废弃物中且不易被降解，并且在施用粪肥的土壤中长期持留[2]，将给土壤带来严重的生态风险[3].中国大多数规模化畜禽养殖场缺少环境治理和综合利用设施，畜禽粪便会不经妥善处理直接排入环境.随畜禽粪便进入土壤的金霉素在土壤中的留存与分解状况不但可以预示这类抗生素的环境风险，而且可能影响作物的生长状况.目前研究主要集中在金霉素在某种畜禽粪便中的降解情况或在粪肥及土壤中的吸附解吸情况[4]，金霉素可被畜禽粪便强力吸附，在新鲜的粪肥中含量很高，中国7省、市、自治区的典型规模化养殖场猪粪中金霉素平均含量为3.57mg·kg-1，最高达121.78mg·kg-1，经过堆腐处理后，其含量有所下降，自然光照下金霉素在鸡粪中的降解半衰期为3.24d，降解率可达97%[5,6].外源添加纯品金霉素在土壤中降解过程主要发生在前10d，且对土壤酶活性有抑制作用，用动物排泄物施肥的土壤，0～40cm土层金霉素最大浓度高达26.4mg·kg-1[7].但有关于畜禽粪便中所含的金霉素进入土壤后的动态变化情况还鲜见报道.因此，本研究通过室内模拟培养试验方式，研究金霉素进入土壤后的动态变化规律及变化差异，并探讨其含量变化的机制，为环境的保护提供科学依据.2实验部分2.1仪器与试剂2.1.1实验仪器LC-2OAT液相色谱仪，配SPD-20A紫外可见检测器和CBM-102色谱工作站（岛津有限公司）；JJW-300精密净化交流稳压电源（东方集团易事特公司）；YP-ODS色谱柱（150L×4.6）（岛津有限公司）；DP-01真空泵（Tianjin，Do-chromtechnologyCo.Ltd.）；800型离心沉淀器（上海手术器材厂）；MS1振荡器（IKA）（德国，IKAW公司）；全套过滤玻璃设备;电子天平（感量0.1mg）（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；500mL棕色试剂瓶，100mL容量瓶；移液管(1mL、5mL、10mL、25mL、50mL)；100mL量筒；5mL全玻璃注射器；50mL烧杯若干；10mL聚丙烯试管若干；0.45μm水性滤膜；一次性纸杯；滴管；吸耳球；PH试纸；保鲜膜.2.1.2实验试剂金霉素（CTC）标准品，纯度92.5%（德国进口）；甲醇，液相色谱专用纯度，(天津市永大化学试剂有限公司)；乙腈，色谱纯，(天津市永大化学试剂有限公司)；柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠、磷酸氢二钠、氢氧化钠、草酸，均为分析纯，（天津市北方天医化学试剂厂）；纯净水，代替二次水，（天津市娃哈哈饮料有限公司）.2.2溶液配制金霉素标准储备溶液:准确称取金霉素标准物质0.0108g溶于甲醇（色谱纯），定容100mL，获得浓度为1.000mg/mL（1000mg/L）的标准储备液，4℃冷藏.临用前再按要求配成系列标准溶液.金霉素标准工作溶液：准确移取一定体积的标准储备液，加水稀释，配制浓度为1、2、4、5、8、10mg/L溶液.Mcllvaine-Na2EDTA缓冲溶液(提取液)，分别称取12.9g柠檬酸、10.9g磷酸氢二钠、37.2g乙二胺四乙酸二钠，加900mL水溶解后，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.0±0.5，加水稀释至1000mL.2.3土壤样品的制备和金霉素的提取 2.3.1土壤样品的制备：土壤样品取自河北北方学院西校区实验田，土壤为耕作土层，采集土壤样品大于10Kg，自然风干、粉碎、缩分，获得实验土样2Kg，土壤进一步自然风干，粉碎，过筛（100目，0.2mm），室温20℃烘干12h，将其全部放入密封袋中，以待备用.2.3.2金霉素的提取准确称取2g土壤样品于10mL聚丙烯离心管中，准确加入Mcllvaine-Na2EDTA提取溶液5mL，涡旋混匀2min，超声提取5min，以3500r/min离心10min后，将上清液移入至另一10mL聚丙烯离心管中，残留物再加入5mL提取液提取1次，3500r/min离心5min，合并提取液备用.准确移取上清液2mL过0.45µm的水性膜，进行HPLC/UV分析.2.4HPLC/UV测定色谱柱：色谱柱：YP-ODS柱（C18柱）检测器：紫外检测器（UV），波长355nm流动相：甲醇－乙腈（1:3，V/V）-0.01mol/L草酸（经过过滤处理）(4:6,V/V)，使用前超声脱气10min.流速：1.0mL/min柱温：25℃进样量：20μL2.5金霉素的降解试验2.5.1降解浓度的设立参考文献资料和金霉素的最大残留限量值（最大值600mg/kg，肾），以及仪器检测结果设立了三个金霉素的药物的降解浓度，即4mg/L，8mg/L，16mg/L2.5.2土壤处理试验前，准确称取500g制备好的干燥的土壤加水至最大含水量的50%-60%，（最大含水量采用纸杯滴水法测定），混合均匀至于塑料袋中2h，使水分混合均匀.2.5.3称取土样准确称取5g处理好的土壤样品于干净的纸杯中，共称取90份，其中每个浓度做3次重复，每个浓度做9个点，共81份，同时做空白，共计90份,2.5.4降解试验称取好的土样烧杯做好标记，添加相应浓度的药物标准溶液，然后用保鲜膜覆盖好，防止水分流失，在上面扎几个小孔，置于室温度稳定的环境中培养，所有样品采用称总重法每周调节含水量一次，根据标号分别在固定的时间内取出测定，（取样时间：0h、2h、5h、10h、1d、2d、5d、10d、15d），所取样品当天处理测定完成.3实验结果与讨论3.1HPLC/UV色谱分析条件的确立与优化在采用HPLC/UV检测金霉素时，为了有效地降低金霉素的去质子化作用，流动相一般选用酸性溶液，如磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸、乙酸、磷酸、草酸、甲酸等，其中最常用的是草酸和甲酸.由于实验过程中使用甲酸作流动相，存在基线漂移的现象，而且柱压明显升高，所以本实验使用草酸，但是配制流动相之前必须进行过滤！流动相中的有机相，如甲醇、乙腈对金霉素的色谱分离和检测灵敏度有较大的影响.当流动相中只含有甲醇时，虽然分离度较好，但是洗脱速度慢；当流动相中只有乙腈时，虽然洗脱速度快，但是分离度变差.因此，在本实验中同时选用甲醇、乙腈和草酸作为流动相，其中草酸的浓度为0.1mol/L.同时参考文献，确定了三者之间的比例.优化的流动相为甲醇/乙腈（1:3，V/V）-0.01mol/L草酸（经过过滤处理）(4:6,V/V).在优化的色谱条件下，获得的金霉素的色谱图如图2所示.比采用此条件对浓度为1、2、4、5、8、10mg/L的金霉素标准溶液进行测定，获得的标准曲线如图3所示，标准曲线方程为y=7256.1x+158.98，R²=0.9987符合所进行实验色谱分析的要求.金霉素（Rt=2.85min）金霉素（Rt=2.85min）图2金霉素标准谱图图3HPLC/UV测定金霉素的标准曲线（n=3）3.2土壤样品提取条件的确定优化根据文献报导，土壤等样品中金霉素残留一般采用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲溶液提取，采用C18固相萃取净化.对于本实验，由于处理样品量较大、分析时间需准确控制，防止继续降解，本研究探讨了不经净化，采用离心取上清液直接测定的方法对金霉素进行分析，获得了满意结果，金霉素HPLC/UV测定不存在干扰.土壤样品HPLC/UV色谱图见图4.同时对添加了三个浓度的土壤样品进行测定，测定的回收率见表1.金霉素（Rt=2.85min）金霉素（Rt=2.85min）图4土壤样品中金霉素HPLC/UV测定的色谱图表1金霉素回收率（n=6）土样编号添加浓度(mg/L)标准品平均峰面积检测平均峰面积回收率(%)1417460.414415.6±47082.56%±2.7%2828753.226732.3±52092.97%±1.8%31643732.542321.2±61096.77%±1.4%3.3降解试验结果根据降解实验设计，分别在0h、2h、5h、10h、1d、2d、5d、10d、15d取出相应标记的土样进行金霉素含量的HPLC/UV测定.以降解时间为横坐标，以色谱峰面为纵坐标，绘制降解曲线.图5金霉素降解曲线实验结果表明，不同浓度的金霉素在土壤中降解的动态变化趋势基本一致，均表现为培养前期含量迅速下降，中后期逐步稳定.到了一定时间后，低浓度的变化不明显，高浓度的则持续减少，但降幅有所减缓.通过实验可知金霉素的半衰期大约为一天，影响其降解的主要因素有金霉素的浓度、土壤与空气的接触面积.金霉素残留物进入环境后由于前期降解快，后期降解困难，从而造成土壤的污染，影响生态.由于后期试验金霉素降解缓慢，所以应该采取相关措施促进金霉素的降解（如可能的催化剂等）.从图中可知较高初始浓度组的金霉素降解速率均比较低初始浓度组慢.4结论本实验建立了优化的HPLC/UV检测金霉素的方法，采用Mcllvaine-Na2EDTA缓冲溶液提取，采用C18固相萃取净化.对于本实验，由于处理样品量较大、分析时间需准确控制，防止继续降解，本研究探讨了不经净化，采用离心取上清液直接测定的方法对金霉素进行分析，结果获得了满意结果，金霉素HPLC/UV测定不存在干扰.金霉素在室内降解规律，在高浓度条件下能快速进入降解期，半衰期为1d，半衰期后降解速率减缓．降解曲线呈“L”型．建议在后续的研究中可以对不同土壤湿度、光照对降解的影响，并加入对土壤灭菌前后的对照考察微生物对金霉素降解的作用.以对更深入的研究金霉素在土壤中的降解行为做出更合理的判断，对我们保护环境做出更大的贡献，为保护环境出谋划策.5资金支持本课题得到河北北方学院课题“金霉素在栗钙土中的转归及对土壤微生物和白菜的生态毒性研究2010”的资助.参考文献：[1]鲍艳宇，周启星，万莹，等．2010．3种四环素类抗生素在褐土上的吸附和解吸．中国环境科学，30(10):1383－1388．[2]庞国芳，曹彦忠，张进杰，等.高效液相色谱法同时测定禽肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的研究.分析测试学报，2005,24（4）：61-63.[3]王敏，唐经春.土壤中的抗生素污染及其生态毒性的研究.第三届全国农业环境科学学术研讨会论文集.2009年3月.[4]刘伟，王慧，刘小军，杨大为，匡光伟，孙志良.抗生素在环境中降解的进展.动物医学进展，2009，30（3）：89-94[5]薄海波，陈立仁.固相萃取法提取、高效液相色谱-紫外检测法同时测定蜂王浆中土霉素、四环素、金霉素残留[J].中国卫生检验杂质，2004,14（6）：699-700.[6]鲍艳宇.四环素类抗生素在土壤中的环境行为及生态毒性研究.2008.年8月.[7]aiYQ,JiangGB,LiuJF,etal.Muliti-walledcarbonnanotubespackedcartridgeforthesolid-phaseextractionofseveralphthalateestersfromwatertsamplesandtheirdeterminationbyhighperformanceliquidchromatography[J].Anal.Chin.Acta,2003,494:149-156.[8]MitscherLA.Thechemistryofthetetracyclineantibiotics[C]//MedicinalResearchSeries,Vo.l9,NewYork:MarcelDekkerInc1,1978致谢在论文完成之际，首先衷心感谢指导老师和老师.在课题的研究和论文的撰写过程中，给予细心的指导和帮助，指导实验过程中很多容易忽视的细节，帮助解决很多实验过程中遇见的难题，尤其是赵老师兢兢业业的工作精神，严谨的治学态度和高尚的人格使我钦佩不已，她的言传身教将使我受益无穷.还要感谢分析实验室的老师平时对于实验的帮助，提供仪器并给于实验室安全的教育.同时还要感谢所有的老师悉心的指导！感谢一起做实验的马文涛、杨普华同学，在实验过程中给予我很大的帮助，也向所有关心过和帮助过我的同学表示衷心的感谢.2012.6.10基于C8051F单片机直流电动机反馈控制系统的设计与研究基于单片机的嵌入式Web服务器的研究MOTOROLA单片机MC68HC（8）05PV8/A内嵌EEPROM的工艺和制程方法及对良率的影响研究基于模糊控制的电阻钎焊单片机温度控制系统的研制基于MCS-51系列单片机的通用控制模块的研究基于单片机实现的供暖系统最佳启停自校正（STR）调节器单片机控制的二级倒立摆系统的研究基于增强型51系列单片机的TCP/IP协议栈的实现基于单片机的蓄电池自动监测系统基于32位嵌入式单片机系统的图像采集与处理技术的研究基于单片机的作物营养诊断专家系统的研究基于单片机的交流伺服电机运动控制系统研究与开发基于单片机的泵管内壁硬度测试仪的研制基于单片机的自动找平控制系统研究基于C8051F040单片机的嵌入式系统开发基于单片机的液压动力系统状态监测仪开发模糊Smith智能控制方法的研究及其单片机实现一种基于单片机的轴快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于双单片机冲床数控系统的研究基于CYGNAL单片机的在线间歇式浊度仪的研制基于单片机的喷油泵试验台控制器的研制基于单片机的软起动器的研究和设计基于单片机控制的高速快走丝电火花线切割机床短循环走丝方式研究基于单片机的机电产品控制系统开发基于PIC单片机的智能手机充电器基于单片机的实时内核设计及其应用研究基于单片机的远程抄表系统的设计与研究基于单片机的烟气二氧化硫浓度检测仪的研制基于微型光谱仪的单片机系统单片机系统软件构件开发的技术研究基于单片机的液体点滴速度自动检测仪的研制基于单片机系统的多功能温度测量仪的研制基于PIC单片机的电能采集终端的设计和应用基于单片机的光纤光栅解调仪的研制气压式线性摩擦焊机单片机控制系统的研制基于单片机的数字磁通门传感器基于单片机的旋转变压器-数字转换器的研究基于单片机的光纤Bragg光栅解调系统的研究单片机控制的便携式多功能乳腺治疗仪的研制基于C8051F020单片机的多生理信号检测仪基于单片机的电机运动控制系统设计Pico专用单片机核的可测性设计研究基于MCS-51单片机的热量计基于双单片机的智能遥测微型气象站MCS-51单片机构建机器人的实践研究基于单片机的轮轨力检测基于单片机的GPS定位仪的研究与实现基于单片机的电液伺服控制系统用于单片机系统的MMC卡文件系统研制基于单片机的时控和计数系统性能优化的研究基于单片机和CPLD的粗光栅位移测量系统研究单片机控制的后备式方波UPS提升高职学生单片机应用能力的探究基于单片机控制的自动低频减载装置研究基于单片机控制的水下焊接电源的研究基于单片机的多通道数据采集系统基于uPSD3234单片机的氚表面污染测量仪的研制基于单片机的红外测油仪的研究96系列单片机仿真器研究与设计基于单片机的单晶金刚石刀具刃磨设备的数控改造基于单片机的温度智能控制系统的设计与实现基于MSP430单片机的电梯门机控制器的研制基于单片机的气体测漏仪的研究基于三菱M16C/6N系列单片机的CAN/USB协议转换器基于单片机和DSP的变压器油色谱在线监测技术研究基于单片机的膛壁温度报警系统设计基于AVR单片机的低压无功补偿控制器的设计基于单片机船舶电力推进电机监测系统基于单片机网络的振动信号的采集系统基于单片机的大容量数据存储技术的应用研究基于单片机的叠图机研究与教学方法实践基于单片机嵌入式Web服务器技术的研究及实现基于AT89S52单片机的通用数据采集系统基于单片机的多道脉冲幅度分析仪研究机器人旋转电弧传感角焊缝跟踪单片机控制系统基于单片机的控制系统在PLC虚拟教学实验中的应用研究基于单片机系统的网络通信研究与应用基于PIC16F877单片机的莫尔斯码自动译码系统设计与研究基于单片机的模糊控制器在工业电阻炉上的应用研究基于双单片机冲床数控系统的研究与开发基于Cygnal单片机的μC/OS-Ⅱ的研究基于单片机的一体化智能差示扫描量热仪系统研究基于TCP/IP协议的单片机与Internet互联的研究与实现变频调速液压电梯单片机控制器的研究基于单片机γ-免疫计数器自动换样功能的研究与实现基于单片机的倒立摆控制系统设计与实现单片机嵌入式以太网防盗报警系统基于51单片机的嵌入式Internet系统的设计与实现单片机监测系统在挤压机上的应用MSP430单片机在智能水表系统上的研究与应用基于单片机的嵌入式系统中TCP/IP协议栈的实现与应用单片机在高楼恒压供水系统中的应用基于ATmega16单片机的流量控制器的开发基