(毕业论文)金银花清咽果冻的研制正文终稿

长春工业大学学士学位论文摘要 咽喉是个易受细菌感染的器官，并常因感冒、劳累和上呼吸道感染而引发炎症，所以开发具有清咽功效的保健食品具有重要意义。金银花是卫生部规定的药食同源的植物，自古被誉为清热解毒的良药，故本实验选取了金银花为主要原料，并提取其抗菌有效成分绿原酸作为清咽功效成分，制取金银花清咽果冻。本论文采用乙醇回流提取法提取金银花中的绿原酸，通过正交试验确定了当料液比为1:20，乙醇浓度为70%，提取温度为60℃，提取时间为60min时绿原酸的得率最高，为5.43mg/g；并且确定了金银花清咽果冻的最佳配方为：复配胶添加量为1%（卡拉胶和魔芋胶的比例为4:1），白砂糖添加量为14%、柠檬酸添加量为0.14％，绿原酸添加量为0.03%，乳酸钙添加量为0.06%，山梨酸钾添加量为0.05%。最后本论文通过抑菌试验和人群试验，评定了果冻具有清咽保健功能。清咽果冻，既方便食用，又有清咽功能，可以有效的预防咽喉疾病，具有很好的市场前景。关键词：金银花；绿原酸；清咽；正交实验；果冻ThestudyofhoneysucklepharynxjellyAbstractTThroatisaspecialorgan,whichisinfectedbybacteriumeasily.Anditisofteneasytoinflamebecauseofcatchcold,tiredandupperrespiratorytractinfection.SoitisimportanttodevelopafunctionalfoodthathasthefunctionofclearingpHarynx.Honeysuckleisa“drughomologousfood”plantthatwasruledbythedepartmentofhealth.Itisalsohonouredasakindofmedicinethatcanclearheatanddetoxicat.Inthisexperiment,honeysuckleisselectedasthemainrawmaterialtoextractchlorogenicacidthatisthefunctionalcompositionofclearingpHarynx.ThenakindofjellythatcanclearpHarynxwasprepared.\o"添加到单词本"Inthispaper,thechlorogenicacidofHoneysucklewasextractedbythemethodofalcoholbackflow.Themaximumextractionefficiencyofchlorogenicacidwas5.43mg/g,whichwasdeterminedbyorthogonalexperiment.Andtheoptimalconditionswerematerialliquidratioof1:20,theethanolconcentrationof70%,theextractingtemperatureof60℃andtheextractingtimeof60minutes.Thentheoptimalformulaofthejellywasdetermined,whichwereadhesivecompoundof1%,whitegranulatedsugarof14%,citricacidof0.14%,Calciumlactateof0.06%andpotassiumsorbateof0.05%.Finally,thefunctionofclearingpHarynxaboutthejellywasconcludedbybacteriostasistestandhumantest.Sothejellyisnotonlyconvenienttoeat,butalsohasthefunctionofclearingpHarynx.Itwellpreventthethroatdisorderseffectivelyandhaveavastpotentialforfuturedevelopment.Keywords:Honeysuckle；chromogenicacid；Orthogonalexperiment；jelly目录摘要 IAbstract II目录 III1文献综述 11.1前言 11.2金银花概述 21.2.1金银花的化学成分 21.2.2金银花的药理作用 31.3绿原酸概述 41.3.1绿原酸结构和化学性质 41.3.2绿原酸的生物药理作用 51.3.3绿原酸的生物合成 71.3.4绿原酸的清咽保健原理 71.4天然产物活性成分提取概述 71.4.1溶剂提取法及其原理 81.4.2连续回流提取法简介 81.5果冻概述 81.5.1果冻简介 81.5.2果冻产品的发展趋势 91.5.3保健果冻概述 101.6清咽保健食品概述 102材料与方法 112.1实验材料和设备 112.1.1实验材料 112.1.2实验仪器和设备 122.2实验方法 122.2.1金银花活性成分鉴定 122.2.2金银花中绿原酸提取工艺的研究 142.2.3金银花清咽果冻工艺配方的确定 182.2.5清咽果冻的产品标准 222.2.6功能试验 233结果与讨论 253.1金银花活性成分鉴定结果 253.2绿原酸标准曲线绘制结果 253.3绿原酸的得率计算 263.4绿原酸提取方法确定 263.5金银花绿原酸单因素实验结果分析 263.5.1提取温度对绿原酸得率的影响 263.5.2料液比对绿原酸得率的影响 273.5.3提取时间对绿原酸得率的影响 283.5.4乙醇浓度对绿原酸得率的影响 283.6绿原酸提取正交实验结果分析 293.7复配胶比例结果分析 303.8清咽果冻配方正交试验结果 313.9清咽果冻产品评价结果 323.10功能试验结果 333.10.1人群试验结果 333.10.2果冻抑菌试验结果 34结论 35展望 36致谢 37参考文献 38长春工业大学学士学位论文1文献综述1.1前言果冻是一种老少皆爱的休闲食品,因外观晶莹,色泽鲜艳,口感软滑,清甜滋润而深受人们的喜爱。但是普通果冻是用增稠剂加入各种人工合成香精、着色剂、甜味剂、酸味剂配制而成。增稠剂虽然来自海藻和陆生植物，可是在提取过程中经过酸、碱、漂白等工艺处理，使其原有的维生素、无机盐等营养成分丧失。海藻酸钠、琼脂等属于膳食纤维类,但摄入过多会影响人体对脂肪、蛋白质的吸收，尤其是铁、锌等无机盐由于结合成不可溶性混合物，降低了人体对铁、锌等微量元素的吸收。果冻色泽鲜艳，是加入人工着色剂的结果。这些人工着色剂，是以煤焦油为原料经化学合成，这些物质对人体没有什么营养价值，吃多无益，甚至还有一定的毒性，因此长期食用会影响身体健康。传统果冻为高糖、高酸产品,热量较高,营养价值低,已逐渐退出市场,所以果冻产品发展方向之一就是要强化果冻营养，将果冻的营养健康与消费者需求相结合，将传统饮食文化与特有资源相结合，开辟出一条果冻创新的道路。目前国内已经出现了丰富多样的保健果冻,开发出了甘薯保健果冻、毛木耳保健果冻、芦荟果冻、山药果冻等一系列营养保健果冻。当今社会发展迅速，人们越来越注重保健养生，通过注意饮食调节以及食用一些日常的保健食品来预防和减缓各种疾病成为一种趋势。权威资料研究表明，咽喉炎是继胃病和感冒病之后最困扰人们生活的疾病,中医理论素有“咽喉口齿诸病皆属于火”之说，咽喉不适的症状在气候燥热的夏季更易引发，加上由于烟酒过度、经常熬夜、食用辛辣食物、过多使用空调等不良生活方式，越来越多的人会遇到咽喉干、痒、疼、紧、涩等问题，严重者甚至遭受咽喉肿胀、刺痛、声带嘶哑、说不出来话的痛苦折磨。所以，以“清凉祛火、杀菌消炎”为基本原理的清咽润喉类产品，迎合了消费者的这一需求，因此具有润喉保健功能的新型果冻值得我们为之深入探究。金银花为忍冬属忍冬植物的干燥花蕾，常用于中药及保健食品，具有清热解毒，凉风散热，抗病毒，保肝利胆的功能。始载于《神农本草经》，其后的《本草纲目》等医药专著均有记载，是一种历史悠久的中药，并且享有“药铺小神仙”之誉。“金银花露”则可成为夏令保健清凉饮料，经常喝些金银花水当茶饮用，能防暑降温，还有疏散风热、清肝明目、清热解毒，清热凉血、解毒散痛、治疗面部痤疮的功效。金银花的原花冲之代茶，嗅之气味芬芳，饮后神清气爽。夏秋服用金银花茶，既能防暑降温、降脂减肥、养颜美容，又能清热解毒、百病不生，是现代人保健养生和防疫防病的绝好佳品。近代研究表明，金银花对多种致病菌如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌等均有一定抑制作用，对肺炎球菌、脑膜炎双球菌、绿脓杆菌，结核杆菌亦有效。水浸剂比煎剂作用强，叶煎剂比花煎剂作用强。若和连翘合用，抗菌范围还可互补；与青霉素合用，能加强青霉素对耐药金黄色葡萄球菌的抗菌作用，这可能是在抑制细菌体内蛋白质合成上有协同的作用。并且验证了绿原酸和异绿原酸是金银花主要的抗菌有效成分。基于金银花的抗菌作用，能促进肾上腺皮质激素的释放，对炎症有明显抑制作用，是治疗和缓解咽喉肿痛的极佳选择，并且金银花是国家卫生部规定的药食同源的药材，在广泛运用于临床医疗研究的同时，也是极好的保健食品的选材。目前天然产物提取也是研究的热点，关于金银花中绿原酸等有效成分的提取方法也有很多研究。绿原酸是一种多酚类化合物，异名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸过程中产生的苯丙素类化合物。绿原酸具有抗菌、抗病毒、止血、抗氧化、消除自由基、抑制突变和抗肿瘤等多种生物活性。在医药、卫生等领域具有很大的应用价值，因此，从植物中提取分离绿原酸具有重要的意义。目前，金银花中绿原酸的提取方法包括水提法、水提醇沉法、稀醇提取法、石硫醇法、戊醇法、乙酸乙酯法和大孔树脂吸附法等,本实验以金银花的花蕾为原料，采用乙醇热回流法提取绿原酸。本论文将绿原酸提取工艺与果冻制作工艺相结合，采用正交实验法得出金银花清咽果冻最佳配方，并通过抗菌试验和人群试验评定其清咽功效。1.2金银花概述金银花（JapaneseHoneysuckle）为忍冬的干燥花蕾或初开的花[1]。金银花常用于中药及保健食品，具有清热解毒，凉风散热，抗病毒，保肝利胆的功能[2]金银花应用于临床已有千年历史，近年来，国内外学者运用现代理论知识做了大量的临床药理工作，从科学的角度证实了金银花具有广谱抗菌、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫、解热抗炎、利胆、保肝、降脂等多种药理作用。临床用于痈肿疖疮，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。金银花的茎、叶和花中主要成份为绿原酸，绿原酸在临床上具有抗菌消炎的作用。临床证明，金银花对于溶血性链球菌、金黄葡萄球菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、肺炎双球菌、百日咳杆菌、脑膜炎球菌等，都有较强的抑菌力，对治疗流行性感冒和炎症均有一定疗效，因而金银花具有“植物抗生素”之称。1.2.1金银花的化学成分金银花化学成分复杂，已鉴别出的就60多种[2]。金银花化学成分研究表明，其花中主要含挥发油、黄酮类、三萜类、有机酸、醇类、微量元素等[3]。其中最重要的药理成分是挥发油，金银花干品中含有挥发油成分60种以上，主要成分为棕榈酸，占挥发油26％以上，其它成分则多为醇、醛、酮、酸、酯类和烷烃等[4]。金银花干花蕾中多为单萜及倍半萜类化合物，含量较高的有香树烯、芳樟醇和香叶醇。金银花主要活性成分为绿原酸。绿原酸是一种多酚类化合物，异名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸过程中产生的苯丙素类化合物[5]。包括绿原酸、异绿原酸和咖啡酸。其中,异绿原酸为混合物，它的异构体有七种，分别为：4，5-二咖啡酸酰奎尼酸、3，4-二咖啡酸酰奎尼酸、3，5-二咖啡酸酰奎尼酸、1，3-二咖啡酸酰奎尼酸、3-酰奎尼酸，4-阿魏酰奎尼酸、5-酰奎尼酸[5]。另外金银花还含有铁、锰、铜、锌、钛、锶等15种无机盐，其花蕾中含有肌醇、β-谷甾醇等。1.2.2金银花的药理作用金银花及其同属植物药理作用研究表明，其具有抑菌、抗病毒、解热、抗炎、利胆保肝、止血、抗氧化、免疫调节等作用。金银花的抗菌作用近代药理研究显示，金银花是一种作用很强的广谱抗菌中药[6]。口腔病原性微生物体外抑菌实验表明，金银花提取液对引起牙龈疾病的变形链球菌，放射粘杆菌及引起牙周病的产黑色素类杆菌，牙龈炎杆菌及半放线嗜血菌均显示较强的抑菌活性，其中在6.25mg/mL情况下其抑菌率为87.5%[7]。用金银花提取液对不同浓度血清型变形球菌进行实验，结果显示最低抑菌浓度在25mg/mL以下者占95.8%，而且最低杀菌浓度一般明显高于抑菌浓度，证明金银花提取液有抑菌作用[8]。金银花对金葡菌、链球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、脑膜炎双球菌、结核杆菌等均有较好的抑制作用，水浸剂较煎剂好。一般认为金银花中抗菌消炎的主要成分是绿原酸及异绿原酸[9]。金银花抗炎解热作用金银花抗炎作用明显，能明显抑制新鲜鸡蛋清、莱胶等所致的大鼠跖水肿，明显抑制炎性增生[9]，体外还能抑制人的γ球蛋白的铜离子热变性。以金银花为主，对于辨证治疗肺炎、流感、百日咳、腮腺炎、急性喉头炎、急性乳腺炎、急性阑尾炎、急性子宫肌内膜炎等,也有较好疗效,不逊于同类西药,而且副作用较小。金银花的利肝保胆的作用金银花所含的多种绿原酸类具有显著的利胆作用,可增进大鼠的胆汁分泌，其α-2常青藤皂苷和无患子皂苷B的混合物对因乙酰基酸所致小鼠肝脏毒性有保护作用[10]。动物实验表明,金银花中的三萜皂苷对CCl4引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用[11]。金银花的抗氧化作用利用鲁米诺发光体系研究证明,金银花水提取物在体外对H2O2具有直接的清除作用,且呈线性量效关系[12]，但在体内是否也有或间接发挥作用，尚待进一步研究[13]。另外金银花对烫伤小鼠中性粒细胞释放过氧化氢有一定程度的改善作用，能使烫伤小鼠中性粒细胞合成和释放溶酶体酶的能力相应减少[14]，说明其具有抗氧化反应的作用。金银花的应用现状金银花的应用相当广泛，含有金银花的药方、药膳方特别常见。据调查,全国有1/3的中医方剂用到金银花。2003年，很多防治非典的中药处方中都使用了金银花。日常生活中,人们还经常以金银花泡水代茶来治疗咽喉肿痛和预防上呼吸道感染。除此之外，许多炎症性疾病的治疗也同样用到了金银花。金银花的药理作用多样,化学成分复杂，因此深入研究其药理活性及毒理学方面,对进一步的临床应用更有指导意义。图1-1金银花1.3绿原酸概述1.3.1绿原酸结构和化学性质金银花抗菌有效成分主要为绿原酸，异绿原酸，它们是奎宁酸和咖啡酸的酯，易溶于水、醇、丙酮等溶剂中，绿原酸药用历史悠久，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆之功效等。广义的绿原酸(chromomericacid)是指由咖啡酸(Caffeinatecad)与奎尼酸(quantaacid)组成的一类缩酚酸，包括3-咖啡酞奎尼酸(3-caffeaoylquinicacid)，4-咖啡酞奎尼酸(4-caffeaoylquinicacid)，5-咖啡酞奎尼酸(5-caffeaoylquinicacid)，3，4-咖啡酞奎尼酸(3,4-dicaffeaoylquinicacid)与4,5-二咖啡酞奎尼酸[7]。狭义的绿原酸，是一种多酚类化合物，由1分子咖啡酸(coffeesacid)和1分子奎尼酸(quinceacid)缩合脱水而成，异名咖啡鞣酸，是植物在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径(HMS)的中间产物合成的一种苯丙素类物质[15]。绿原酸主要分布于茎、叶和花的表层及其以内的几层细胞中，即绿原酸往往分布于植物器官外围的组织细胞中，对植物器官起着保护作用。但是绿原酸作为金银花药材的一种重要有效成分，我们不仅关注绿原酸在植物器官中具体的分布场所，同时更加关注绿原酸在哪些部位的组织细胞中分布最广泛、含量最丰富。绿原酸分子式为C16H18O9，分子量为354.3，25℃水中溶解度为4%，热水中溶解度更大，易溶于乙醇及丙酮，极微溶于醋酸乙酯。绿原酸半水合物为白色或微黄色针状结晶，在110℃时变为无水物，与稀盐酸共热产生咖啡酸,熔点208℃,比旋光度[α]D=35.2°(C=28)。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的酯,其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚三个不稳定部分。在从植物提取过程中，往往通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化。由于绿原酸的特殊结构决定了其可以利用乙醇、丙酮、甲醇等极性溶剂从植物中提取出来,但是由于绿原酸本身的不稳定性,提取时不能高温、强光及长时间加热。绿原酸的供试液放置于棕色瓶、冰箱（2℃）保存时最为稳定。图1-2绿原酸分子式1.3.2绿原酸的生物药理作用绿原酸具有抗菌、抗病毒、止血、抗氧化、消除自由基、抑制突变和抗肿瘤等多种生物活性[16-17],在医药、卫生等领域具有很大的应用价值。因此，从植物中提取分离绿原酸具有重要的意义。抗菌及抗病毒作用有文献报道，绿原酸和异绿原酸对多种致病菌有较强的抑制和杀灭作用，对急性咽喉炎症及皮肤病有明显疗效，临床上用于治疗急性细菌性感染疾病。绿原酸的水解产物咖啡酸也具有止血、利胆及抑制单纯疱疹之功效。此外绿原酸还有降低血脂、增强免疫力、降低血糖等多种生物活性作用[18]。抑制突变和抗肿瘤蔬菜、水果中的多酚类如绿原酸、咖啡酸等可通过抑制活化酶来抑制致癌物黄曲霉毒素B1和苯并[α]芘的变异原性；绿原酸还可通过降低致癌物的利用率及其在肝脏中的运输来达到防癌、抗癌的效果。绿原酸对大肠癌、肝癌和喉癌具有显著的抑制作用，被认为是癌症的有效化学防护剂[19]。心血管保护作用绿原酸作为一种自由基清除剂及抗氧化剂已被大量的试验证明，绿原酸的这种生物活性,对心血管系统能产生保护作用。异绿原酸B对大鼠具有较强促进前列腺环素的释放和抗血小板凝集作用；对豚鼠肺碎片感应的抗体诱导SRS-A释放抑制率达62.3%。异绿原酸C也有促进前列腺环素的释放作用。另外，异绿原酸B对血小板血栓素的生物合成和氢过氧化物诱发的内皮素细胞损伤有极强的抑制作用[20]。清除体内自由基绿原酸及其衍生物具有比抗坏血酸、咖啡酸和生育酚（维生素E）更强的自由基清除效果，可有效清除DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基，还可抑制低密度脂蛋白的氧化。绿原酸对有效地清除体内自由基、维持机体细胞正常的结构和功能、防止和延缓肿瘤突变和衰老等现象的发生具有重要作用[21]。抗氧化作用绿原酸是一种有效的酚型抗氧化剂，其抗氧化能力要强于咖啡酸、对羟苯酸、阿魏酸、丁香酸、丁基羟基茵香醚(BHA)和生育酚。绿原酸之所以有抗氧化作用，是因为它含有一定量的R-OH基，能形成具有抗氧化作用的氢自由基，以消除羟基自由基和超氧阴离子等自由基的活性，从而保护组织免受氧化作用的损害[22]。1.3.3绿原酸的生物合成生物合成植物体内的代谢途径，除了生成自身生长发育必需物质的初生代谢途径，如光合作用、碳同化作用和呼吸作用以外，还通过次生代谢途径产生一些能保护其免受环境侵害、具有生物活性的次生代谢物。植物体内的绿原酸是由EMP途径产生的磷酸烯醇式丙酮酸(pHospHoglycerateacid)与PPP循环产生的4-P-赤藓糖(earthrise4-pHospHate)合成得到的莽草酸(shikimicacid)经生物转化得来[23]。该途径又称为桂皮酸途径。1.3.4绿原酸的清咽保健原理人体的口腔与咽喉内常潜伏着致病菌，常见的有化脓性链球菌、肺炎双球菌、金黄葡萄球菌及一些厌氧菌。它们在一般情况下不易发病，但当体内环境发生改变，如着凉或机体抵抗力下降时，菌群间的平衡被打破，潜伏的致病菌就会大量繁殖，导致咽喉受到感染，出现红肿、充血、发干、疼痛等症状，引发咽喉疾病。研究结果表明，金银花的主要抗菌成分为绿原酸，具有显著的体外抑菌作用，对革兰氏阳性菌的作用强于革兰氏阴性菌，对金黄色葡萄球菌、乙型链球菌的最低抑菌浓度0.0625mg/mL；对大肠杆菌、伤寒杆菌的最低抑菌浓度分别0.25g/mL[23]。之后，又有研究表明，绿原酸对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)均有抑菌活性。但抗金黄色葡萄球菌的活性比抗大肠杆菌活性更强[24]。所以金银花中绿原酸通过抗菌实现了清咽保健功效。1.4天然产物活性成分提取概述天然产物活性成分是指从再生资源中提取的具有独特功能和生物活性的化合物，其中许多有效成分是疾病防治、强身健体的物质基础。天然产物安全性高，已成为医药、食品及饲料的重要来源，具有很高的生理活性和经济价值。天然产物活性成分包括有黄酮、多酚、萜类等几百种，其相对分子质量较低，从几百到几千，具有一定的极性，可溶于许多有机溶剂中。但是，由于天然产物中成分复杂、有效成分含量低，分离困难，因此，有关天然产物有效成分的提取分离技术一直是摆在人们面前的重要任务。传统方法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法、水蒸气蒸馏法等。但是传统方法往往各自存在较多的缺点，如高温操作引起热敏性有效成分的大量分解，提取液中除有效成分外杂质较多等等。溶剂提取法是实验室最常用的方法。其次，植物的化学成分较复杂，有些成分是植物所共有的，如纤维素、蛋白质、油脂、淀粉、糖类、色素等。有些成分仅是某些植物所特有的，如生物碱类、苷类、挥发油、有机酸、鞣质等。各类化学成分均具有一定的特性，一般可由药材的外观、色、味等作为初步检查判断的手段之一。但是中草药所含化学成分均为多类的混合物，分析时常常互相干扰，不易得到正确结果。因此需根据中草药所含各种化学成分的溶解度、酸碱度、极性等理化性质，再用各类成分的鉴别反应加以鉴别。1.4.1溶剂提取法及其原理溶剂提取法指的是选择适当溶剂将中草药中的化学成分从药材中提取出来。若无特殊规定，药材须经干燥并适当粉碎，以利增大与溶剂的接触表面积，提高萃取率。溶剂提取法是根据天然产物中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出成分溶解度小的溶剂，而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。根据“相似相溶”原理，选择与化合物极性相当的溶剂将化合物从植物组织中溶解出来，同时，由于某些化合物的增溶或助溶作用，其极性与溶剂极性相差较大的化合物也可溶解出来。实验室常用的溶剂提取法有浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等。1.4.2连续回流提取法简介煎煮法可在较高温度下对植物成分进行提取，提取率高，但杂质也相对较多。回流提取法具有操作简单、节省溶剂的特点。对热不稳定成分，一般应避免高温提取。水提取的杂质较多，如无机盐、蛋白质、糖和淀粉，给分离带来困难。乙醇是最常用的有机溶剂，具有低毒、价廉、沸点适中、便于回收利用等特点，且对植物细胞的穿透能力强，除了蛋白质、黏液质、果胶、淀粉和部分多糖等外，大多数有机化合物都能在乙醇中溶解。1.5果冻概述1.5.1果冻简介果冻(FruitJelly)原是一类西式甜点心。六十年代日本首先将其引入工业化生产,从而使果冻从厨房走进工厂,从餐桌走上货架,成为一种时尚的消闲食品。1985年,我国引进了第一条果冻生产线,产品一经面市就以其独特的口感,浓郁的果香味以及新颖的包装形式赢得了广大消费者,尤其是少年儿童的青睐。十五年来,经过广大厂家的辛勤开拓,果冻已在全国城乡家喻户晓,成为年产过百亿元的大批商品。我国也成为世界上最大的果冻生产国。从生产设备、包装材料到内含物基本实现了国产化,花色品种日趋齐全,包装也日趋精美。但是,随着人民生活水平的提高,人们对果冻的要求越来越高,以及我国加入WTO,大量优质低价的进口产品也将会对国内果冻市场造成一定的冲击。同时经过十五年的发展,国内果冻市场已经供过于求,迫切要求提高产品档次,打进国际市场,开辟果冻行业新的生存发展空间。1.5.2果冻产品的发展趋势崇尚天然将是果冻发展的主流，果冻,顾名思义是由水果或果汁制成的胶冻食品。但是由于市场竞争和技术的原因，果冻概念已经发生了变化。大部分果冻既无果肉又不含果汁，仅以香精、色素来模拟水果的香味和色泽，虽然也可以做得美味可口，但是毕竟于健康无益。越来越多的消费者已经认识到这一点，社会舆论对果冻也颇有微词，长此以往,果冻产品将会逐渐被消费者所摒弃。因而天然的果肉、果汁果冻将是未来果冻的主流。质地嫩滑的果冻，辅以天然果肉，形成了独特口感，并含有水果的营养成分。市场上有菠萝、柑橘、桃、梨等品种的果肉果冻产品，可供广大消费者选择。另外，应消费者对果冻保健功能的需求，市场上还出现了高钙果冻、芦荟果冻等品类，营养健康型果冻，日益受到消费者的青睐。追求保健是果冻发展的新潮流如今，药食同源食品和新资源食品作为果冻开发和研究的主要方向。我国有根深蒂固的药食同源传统，有丰富的具有保健功能的食品原料资源，为开发保健果冻提供了得天独厚的条件。中国卫生部和卫生部食品卫生监督检验所曾在1988年、1991年、1998年分别公布了共77种“既是食品又是药品”的名单的文件，可以作为食物加入到食品之中。并公布了14种可作为普通食品管理的新资源食品。2008年又公布了10种新资源食品，其中允许将水解蛋黄粉添加到果冻产品中。2007年4月，卫生部公告的食品添加剂新品种中，允许将叶黄素（着色剂）用于果冻类产品中，最大添加量为50mg/kg。尽管添加量比较小，但由于叶黄素具有较好的抗氧化能力，能有效预防老年性视网膜黄斑变性，因此也具有较好的应用前景。随着新原料的不断发现，果冻生产企业同时也需要积极地申报新资源，应对果冻行业不断可持续开发创新的需要，同时需要把人们所熟知的具有特殊保健作用的食品和营养强化剂添加在果冻中，如蜂蜜，枸杞，芦荟，及多种微量元素，维生素等，对不同的消费人群对营养的需求，添加食品营养强化剂，更大限度的满足人们的营养需要，市场能见到的功能性产品类型有：补充微量元素，如铁、锌、硒、钙等的；增强免疫力、防癌、抗癌，如螺旋藻、绿茶等的；调理、美容、抗老化功能的，如芦荟、枸杞等。1.5.3保健果冻概述保健果冻主要的保健功能作为具有保健功能的果冻产品,比较适合开发的有以下几个方面：a、补充微量元素,如铁、锌、硒、钙等;b、增强免疫力、防癌、抗癌的如螺旋藻、绿茶等;c、有调理、美容、抗老化功能的如芦荟、枸杞等;d、预防以及缓解一些常发病症，如感冒，胃病以及咽喉疾病。开发保健果冻注意事项开发保健果冻必须注意以下几个问题:a、完善法规和管理制度,履行一定的申报手续,规范保健果冻的市场行为,谨防假冒伪劣产品破坏保健果冻产品的形象;b、坚持慎重、严谨的态度,确保安全卫生,保健功能确切；c、尽可能做到美味可口,色香诱人。此外，在果冻的基本原料中,将会更加注重人们的健康和安全。例如：号称为双歧杆菌培养基的低聚果糖,容易被人体吸收的葡萄糖、高果糖等将成为重要的糖源,而合成代糖类将会减少使用,合成色素将会逐渐被天然色素取代,浅色或无色果冻将更易被人接受。1.6清咽保健食品概述吸烟、饮酒以及长期暴露在不卫生的空气环境中的人群容易患急、慢性咽喉炎,并导致咽痛、咽痒、干咳等症状,影响睡眠和工作。由此清咽润喉辅助作用的保健食品,越来越受到消费者的喜爱。市场调查发现清咽类保健食品主要以口服液、胶囊、片剂、冲剂为剂型生产的保健食品占82％。保健食品使用的原料中不含中草药的仅占10.0％，而使用卫生部规定的既是食品又是药品的八十七种药食两用品种占21.3％，既含有药食两用品种又含有其它中草药的保健食品占23.4％，含有药食两用品种以外的中草药材占45.3％，以滋补类中药为主。其中最广泛的产品就是清咽润喉保健茶，生产凉茶的原料主要选于药膳同源的中草药,现代医学及药理研究表明,凉茶中所用的药物大多具有抗菌、消炎、解热、抗病毒、调节机体免疫功能等作用。一般情况主要选用金银花、金银花叶、菊花、甘草、鱼腥草、罗汉果、胖大海、蒲公英、桔梗、淡竹叶等共10种中草药原料。本实验主要选取金银花作为主要原料，通过提取绿原酸，研制出具有清咽功效的保健果冻。

2材料与方法2.1实验材料和设备2.1.1实验材料表2-1实验材料原料名称采购地点/原料出处金银花干燥花蕾宽平大路百姓大药房卡拉胶长春市义盛食品添加剂公司魔芋胶长春市义盛食品添加剂公司山梨酸钾长春市义盛食品添加剂公司乳酸钙长春市义盛食品添加剂公司柠檬酸长春市义盛食品添加剂公司白砂糖长春市欧亚超市绿原酸标准品中国药品生物制品检定所95%乙醇北京北化精细化学品有限责任公司碘化铋钾天津天泰精细化学品有限公司碘化汞钾天津天泰精细化学品有限公司三氯化铁天津天泰精细化学品有限公司氢氧化钠天津天泰精细化学品有限公司硫酸铜天津天泰精细化学品有限公司石油醚天津化学试剂有限公司盐酸天津化学试剂有限公司镁粉天津市光复精细化工研究所2.1.2实验仪器和设备表2-2主要实验仪器和设备仪器名称型号生产厂家电子天平AL104梅特勒-托利多仪器有限公司电热恒温水槽DK-8D型上海医用恒温设备厂旋转蒸发仪RE52-98型上海亚荣生化仪器厂循环水式真空泵SHZ-III型郑州长城科技工贸有限公司紫外分光光度计Lambda25美国PerkinElmer可见分光光度计UV754型上海佑科仪器仪表有限公司电热恒温鼓风干燥箱9070A型上海一恒科技有限公司电热恒温培养箱905型上海医用恒温设备厂2.2实验方法2.2.1金银花活性成分鉴定在提取绿原酸之前，我们先采用颜色反应和沉淀反应，制备了金银花水提液、乙醇提取液和石油醚提取液，然后对金银花活性成分进行鉴定，为进一步研究绿原酸的提取奠定了理论基础。金银花水提液的制备挑选出足够干燥的金银花，花蕾达到足干，一捏即碎，同时将金银花揉碎，研磨细致。称取10g金银花粉末，按照料液比1:20加入200mL蒸馏水,在水浴温度为90℃的情况下，加热提取60min后,抽滤,得到澄清的初步浸提液，冷却后将此滤液用于检测水溶性成分如多糖、氨基酸、多肽等。金银花乙醇提取液制备称取金银花粗粉10g,按照料液比1:20加入95%的乙醇200mL，在水浴温度为80℃的水浴锅上回流加热1小时，经过滤处理后得到金银花乙醇提取液，冷却后对此滤液进行试验，所含的酚类，鞣质，有机酸等被检测。之后将滤液置于旋转蒸发仪中经减压浓缩，得到醇提取物，再用热蒸馏水溶解后，取此溶液进行生物碱的检测试验。将糖浆状物用乙醇溶解后，进行试验来检测黄酮类化合物、苷类，以及内酯类化合物等。金银花石油醚提取液制备称取金银花粗粉10g，加入石油醚（沸程为60-90℃）60mL，在室温下放置2-3h.把经过滤液处理后的滤液放在表面皿上，挥尽石油醚，得到的残留物用于检测抽挥发油、油脂、萜类、甾体化合物等成分。生物碱鉴定取金银花乙醇提取液，先用稀氨水调至中性，再于水浴上蒸干，残渣加5%硫酸5mL溶解后，过滤，滤液供以下实验用。1）碘化铋钾反应：取1mL滤液于试管中，加1～2滴碘化铋钾试剂，如立即有棕黄色至棕红色沉淀产生，表明可能含有生物碱。2）碘化汞钾反应：取1mL滤液于试管中，加2～3滴碘化汞钾试剂，如产生白色或类白色沉淀，表明可能含有生物碱。皂苷鉴定泡沫反应：取2mL金银花水提液于试管中，剧烈振摇2分钟，如产生大量持久性泡沫，再把溶液加热至沸或加入乙醇，再振摇，如仍能产生多量持久性泡沫，表明可能含有皂苷。黄酮类物质鉴定1）盐酸-镁粉反应：取1mL金银花乙醇提液于试管中，加镁粉适量，摇匀，加2～5滴浓盐酸，即产生剧烈反应，如溶液呈红色或紫红色，表明可能含有黄酮类。2）三氯化铝反应：取金银花乙醇提液点于滤纸上，晾干，喷雾三氯化铝试剂，干燥后，斑点呈鲜黄色，如在紫外灯下观察，斑点有明显的黄绿色荧光，表明可能含有黄酮类。挥发油鉴定油斑试验：取金银花石油醚提取液点于滤纸片上，室温下挥去溶剂后，滤纸片上如留有油斑，表明可能含有油脂或挥发油，若稍经加热，油斑消失或减少，表明可能含有挥发油，如油斑无变化，表明可能含有油脂。有机酸成分测定溴甲酚绿试验：取金银花乙醇提取液滴于滤纸片上，等干燥后，喷洒0.04%溴甲酚绿乙醇溶液，如蓝色背景上显黄色斑点，即表示可能有有机酸。溴甲酚绿变色范围是：3.8（黄色）~5.4（蓝色）。还原糖、多糖鉴定斐林反应：取1mL金银花水提液于试管中，加入新配制的4～5滴斐林试剂，在沸水浴中加热数分钟，如产生砖红色氧化亚铜沉淀，表明可能含有还原糖。将上述溶液中沉淀滤过除去，滤液加1mL10％盐酸溶液，置沸水浴中加热水解数分钟，放冷后，滴加10％氢氧化钠溶液调pH至中性，重复上述斐林反应，如仍产生砖红色氧化亚铜沉淀，表明可能含有多糖类。2.2.2金银花中绿原酸提取工艺的研究提取方法选择1970年以来对金银花的有效成分进行了提取，开始采用螯合法，后改用铅盐法[25]，最后改为溶剂提取法，随着有效成分的含量和制剂稳定性的要求不断提高，提取工艺亦不断改进。目前提取绿原酸的工艺主要有水提法、醇提法、超声波法，微波法、酶法等。本实验根据文献资料结合实验室条件分别选取了水提法，醇提法进行实验，通过测定绿原酸的得率得出最佳提取方法。.1水提法绿原酸分子式内含有一个羧基和多个羟基，为水溶性物质。所以采用水提法用一定量的水提取金银花中的绿原酸。操作步骤：称取金银花粉末5g，加20倍量蒸馏水100mL，水浴1h，趁热过滤，滤渣再加l0倍量水煎煮30min，趁热过滤，合并提取液，转移至旋转蒸发仪中进行减压浓缩，再用真空干燥烘箱烘干得粗提物，取出称量，计算绿原酸得率。.2乙醇回流提取法与水提法相似，可以采用极性有机溶剂萃取金银花中的绿原酸，绿原酸能够溶于乙醇、甲醇、丙酮等。但是考虑到绿原酸的食用和药用安全性以及提取率等因素。本实验采用含有乙醇的水溶液作为提取剂。操作步骤：金银花干粉5g放入烧瓶中，加入75%的乙醇溶液100mL，在80℃条件下，回流提取2h后，过滤，重复提取3次，合并提取液，转移至旋转蒸发仪中进行减压浓缩，再用真空干燥烘箱烘干得粗浸膏，取出称量，计算绿原酸得率。绿原酸提取工艺流程抽滤第二次回流提取抽滤第二次回流提取乙醇回流提取称取金银花粉末乙醇回流提取称取金银花粉末绿原酸粗提物物减压浓缩真空干燥再次抽滤绿原酸粗提物物减压浓缩真空干燥再次抽滤图2-1金银花绿原酸提取工艺流程图绘制绿原酸标准曲线.1绿原酸最大吸收波长的确定准确称取1mg绿原酸标准品。转移至50mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，即得浓度为20μg/mL的绿原酸标准对照品。从绿原酸标准对照品中取2mL对照品于10mL容量瓶中，用无水乙醇定容，得到浓度为4μg/mL的待测液，摇匀，以无水乙醇为参比液，用紫外可见分光光度计在200～800nm处扫描，确定绿原酸的最大吸收波长。.2绿原酸标准取曲线绘制分别吸取上述绿原酸对照品1、2、3、4、5mL于10mL容量瓶中，加无水乙醇定容，分别得到浓度为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、8μg/mL、10μg/mL的待测液，摇匀，在最大吸收波长处测定吸光度。以绿原酸的浓度X(μg/mL)为横坐标，以吸光度Y(A)为纵坐标，绘制标准曲线。绿原酸提取的单因素实验采用单因素实验优选金银花中绿原酸的最佳提取条件，在金银花的提取工艺中，固定回流次数为2次，以绿原酸的得率作为评定指标，考虑的影响因素有：提取温度、料液比、乙醇浓度，提取时间。.1提取温度对绿原酸得率的影响分别准确称取5g粉碎的干燥金银花5份，置于500mL的锥形瓶中。以1:20的料液比加入70%的乙醇溶液，回流提取温度分别为50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，提取时间60min。连续回流提取两次，回流结束后，合并滤液，抽滤两次，最后将滤液倒入比色皿中，放入分光光度计中进行测量，测得吸光度,通过回归方程计算出绿原酸的得率。.2料液比对绿原酸得率的影响分别准确称取5g粉碎的干燥金银花5份，置于500mL的锥形瓶中。按照l:10、1:15、1:20、1:25、1:30的料液比加入70%的乙醇溶液，在60℃下回流提取60min，连续回流提取两次，合并滤液，抽滤两次，最后将滤液倒入比色皿中，放入分光光度计中进行测量，测得吸光度，并用回归方程计算提取物中绿原酸得率。.3提取时间对绿原酸得率的影响准确称取5g粉碎的干燥金银花5份，分别置于500mL的锥形瓶中。用体积分数为70%的乙醇溶液，按照料液比为1:20，在恒温水浴锅中进行回提取，提取时间分别为30min，45min，60min，75min，90min提取两次后过滤。回流结束后，将溶液合并之后抽滤两次，最后，将滤液倒入比色皿中，放入分光光度计中进行测量，测得吸光度，并用回归方程计算提取物中绿原酸得率。.4乙醇浓度对绿原酸得率的影响准确称取5g粉碎的干燥金银花5份，分别置于500mL的锥形瓶中。按照料液比为1:20，分别加入50%，60%，70%，80%，90%的乙醇溶液，在70℃下回流提取60min，回流结束后，将该溶液合并后抽滤两次，最后，将滤液倒入比色皿中，放入分光光度计中进行测量，测得吸光度，并用回归方程计算提取物中绿原酸得率。绿原酸提取工艺正交试验在单因素实验的基础上，采用传统的正交试验法选取金银花绿原酸的最佳提取工艺，在提取过程中，固定回流次数为两次。考虑其他主要影响因素为：提取温度、料液比、乙醇浓度，回流时间。根据各因素的取值范围和试验的要求设计成正交试验因素水平表，具体见表2-3：表2-3L9（34）正交试验因素水平表因素水平A料液比B温度（℃）CD乙醇浓度(%)时间（min）11:1550604521:2060706031:25708075表2-4L9（34）正交试验混合水平表试验号A料液比%B温度（℃）C乙醇浓度%D时间（h）1111121222313334212352231623127313283213933.1绿原酸得率的测定将提取液用无水乙醇稀释至适当浓度，用紫外分光光度计在324nm波长处测量其吸光度，根据回归方程计算成品中绿原酸得率。2.2.3金银花清咽果冻工艺配方的确定金银花清咽果冻工艺流程成品成品冷却杀菌柠檬酸溶解灌装充填绿原酸粉末溶解过滤卡拉胶魔芋胶白砂糖过滤调配均质溶胶煮胶jiao胶混合均匀纯净水水过滤山梨酸钾、乳酸钙山梨酸钾、乳酸钙图2-2金银花清咽果冻提取工艺流程图金银花清咽果冻操作要点.1绿原酸溶液制备称取干燥金银花，按照图2-2设计的流程以及实验分析得到的最佳提取工艺，得到绿原酸粗提粉末。将绿原酸粉末溶于90℃热水中，连续抽滤两次，滤液静置待用。.2溶胶试验采用的胶凝剂是卡拉胶和魔芋胶复配的混合胶,将混合好的复合胶加入到白砂糖溶液中，使其混合均匀,充分溶胀。由于卡拉胶和魔芋胶有较强的吸水性，直接溶解易结团，为了提高其分散性，胶粉加入时边溶解边搅拌，同时升温，煮沸十分钟制成胶液。.3煮胶绿原酸溶液若过早的加入并和胶粉一起煮沸，会影响其营养成分以及风味物质的保留。酸的过早加入会使凝胶强度剧烈下降，主要是高温、高酸、长时间的作用使胶体水解。直到胶液温度降到70℃左右时，加入绿原酸溶液、柠檬酸、乳酸钙和山梨酸钾，加入时要搅拌均匀，以免造成局部酸度过高，影响质量。混合好后继续加热至沸腾,使胶完全溶解。注意煮胶温度不宜过高,时间不宜过长以防止魔芋胶分解,失去凝胶性能。.4过滤加热完成后，将胶液进行过滤，去除杂质及泡沫,即制得透明澄清、粘滑的混合胶溶液。.5灌装趁热灌装,防止混液冷却形成凝胶,不利于罐装的进行..6杀菌将灌装好的果冻，放入85℃热水中灭菌5~10min冷却成为金银花清咽果冻成品..7复合胶的比例确定用单一的胶制成的果冻口感较硬，用复配胶可改善胶体的韧性和口感。为使果冻具有优良的组织状态和口感，应选适宜的复配胶比例，本实验选用卡拉胶和魔芋胶进行复配试验，用果冻强度作为指标来选择复配胶比例。操作要点：在复配胶总量确定的条件下，选取卡拉胶和魔芋胶的比例分别为2:3、3:2、4:1。按照以上果冻工艺流程进行试验，最后分别测定各组试验果冻强度，得出最佳复合胶配比。果冻强度测定方法：将一根端面平整光滑的玻璃棒固定在滴定管专用的铁架台上。在室温下，在托盘天平的两个托盘中，一边放置被测的果冻，另一边放置与果冻等重量加入水的烧杯，当两边平衡时，将固定在铁架台上的玻璃棒底面与果冻表面轻轻接触，然后固定好玻璃棒；在另一端的烧杯中用胶头滴管缓慢地加入水，直至果冻表面在压力下破裂，停止加水，如此测定五次，即可得出结果。设M=最终烧杯与水的重量—果冻重量，则果冻强度=(M1+M2+M3+M4+M5)/5。果冻配方确定的正交实验通过查阅文献资料以及果冻GB19299-2003标准，以生产500g果冻为标准，得到了白砂糖、柠檬酸、复配胶、绿原酸的添加范围，如表2-5所示，并且根据GB2760食品添加剂使用卫生标准在配方中添加了适量的乳酸钙和山梨酸钾。取复配胶、白砂糖、柠檬酸、绿原酸4种配料作正交试验，通过对产品的感官性状及物理性状进行综合评定，得出最佳配方。因此，选用4因素3水平的正交试验L9（34）来确定最佳组合。表2-5L9（34）正交试验混合水平表因素水平A复配胶（%）B白砂糖（%）CD柠檬酸绿原酸(%)（%）10.8100.080.02521120.100.03031.2140.120.035表2-6L9（34）正交试验因素水平表试验号A复配胶添加量（%）B白砂糖添加量（%）C柠檬酸添加量(%)D绿原酸添加量（%）1111121222313334212352231623127313283213933.1感官评分标准将成品果冻打乱编号后让感官鉴评员进行感官评定，鉴评人员由10人（5男，5女）组成，每个成员根据果冻外观形态、色泽、风味等指标进行打分,采用100分制评分检验法进行感官评定，具体评分标准见表2-7。表2-7金银花润喉果冻感官评价表项目评价标准得分色泽（20分）呈橘黄色，均匀一致16─20接近橘黄色，基本一致9─15呈橘黄色，严重不均匀0─8滋味及气味（30分）酸甜适口，具有金银花特有清香20─30酸甜基本适口，金银花味不够10─19甜酸严重偏离，基本无金银花味0─9性状（20分）半透明，柔软适中，细腻，无气泡16─20半透明，偏软或偏硬，基本细腻，少量气泡9─15不透明，严重偏软或偏硬，不够细腻，大量气泡0─8口感（30分）入口细腻，适口，有弹性，有咬劲20─30入口基本细腻，适口，有弹性，有咬劲10─19入口不够细腻，适口，无弹性和咬劲0─92.2.4果冻研制中存在的问题及探讨成品中存在气泡果冻在煮胶沸腾时会产生大量气泡，气泡的存在对产品的色泽、风味及外观都会产生不良的影响。因此，需对其进行消泡处理，以保持果冻质地均匀，口感细腻。添加魔芋胶果冻产品在形成凝胶时会产生脱水现象，脱水现象既影响果冻的外观，也易引起产品质量变化。添加魔芋胶可以增强果冻的韧性，同时降低果冻的脱水率保持果在货架期内有比较稳定的品质。添加乳酸钙乳酸钙保湿性强，能锁定果冻中自由水分的吸收量，从而降低成品中水分活性，有利于果冻成冻和保存。pH值对复配胶脱水现象的影响卡拉胶是一种带负电荷的高分子多糖，由于分子上具有半硫酸酯基ROSO3-而具有很强的阴离子性，当它与氢离子结合成卡拉胶酸时，稳定性最差。在酸性条件加热时，卡拉胶组成物容易发生水解，使胶液粘度和凝胶强度显著降低，凝胶的持水性也大大下降。所以在煮胶时，使体系为pH6.5以上，温度适宜70℃，且体系加酸后不能复煮。2.2.5清咽果冻的产品标准根据国家对果冻所提出的卫生标准（GB/19299-2003）并结合本实验的产品特点对金银花清咽果冻从感官指标、理化指标、微生物指标以及功效成分指标4方面得出金银花清咽果冻产品评定标准。如表2-8所示：表2-8金银花清咽果冻产品评定表指标项目评定方法感官指标色泽人群评定滋味人群评定性状人群评定可溶性固型物/（g/100g）GB19299-2003理化指标总砷（以As计）（/mg/kgGB/T5009.12铅（以P计)/mg/kgGB/T5009.12铜（以Cu计/mg/kgGB/T5009.12PH值GB19299-2003菌落总数/cfu/gGB/19299-2003大肠菌群/MPN/100gGB/19299-2003微生物指标霉菌和酵母/(cfu/mL)GB/19299-2003致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌GB/19299-2003功效成分指标绿原酸（mg/100g）GB22250-2008-T清咽果冻产品检测严格按照表2-8的产品标准表以及表中所规定的方法，对产品进行检测。2.2.6功能试验清咽果冻抑菌试验.1牛肉膏蛋白胨培养基的制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（LB培养基）：牛肉膏10g，蛋白胨10g，琼脂15g，NaCl5g，双蒸水1000mL，pH7.2-7.5，121℃灭菌20min。.2菌种活化取4个培养皿，在培养皿分别倒入一定量的牛肉膏蛋白胨培养基，分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乙型链球菌、枯草芽孢杆菌接种环，划线培养，然后放入培养箱内，在37℃下恒温培养24h。.3菌悬液制备分别将菌种（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乙型链球菌、枯草芽孢杆菌）溶于0.9%的无菌生理盐水中，使菌悬液浓度达到约为5×106~5×107cfu/100g。.4抑菌效果的检测将2.5.3所制备的菌种的菌悬液1mL分别均匀涂布在牛肉膏蛋白胨琼脂平板培养基上，然后将浸泡过果冻浆液的滤纸片2片(滤纸圆片的直径约为6mm下同)放在培养基上，并且以1片未经处理的滤纸片作对照，分别在37℃下培养24h后观察有无抑菌圈。清咽果冻的人群试验清咽果冻的人群试验参照：国家食品药品监督管理局以国食药监保化〔2012〕107号印发《清咽功能评价方法》。该《评价方法》分为试验项目、试验原则及结果判定，清咽功能检验方法有2部分。其中的评价方法有动物实验和人群实验，由于实验条件的限制，只能选取20名咽喉不适的同学进行简单的人群试食。.1受试人群要求在同学中选取试食组、对照组各10人，主观症状为咽喉不适。.2试验设计及分组要求采用对照设计。按受试者的咽部症状、体征随机分为试食组和对照组，分组时尽可能考虑影响结果的主要因素如病程、年龄、性别等，进行均衡性检验，以保证组间的可比性。试食组按推荐服用方法和服用量每日服用清咽果冻，对照组可服用安慰剂，受试样品给予时间10天。试验期间受试者不改变生活、工作环境，不改变原来生活、饮食习惯。.3结果判定方法通过试食组与对照组组间比较，通过咽部改善情况，可判定金银花清咽果冻具有清咽保健功能。

3结果与讨论3.1金银花活性成分鉴定结果根据分析结果得到下表3-1：表3-1金银花活性成分鉴定结果预试成分方法结果生物碱碘化铋钾棕黄色沉淀（+）碘化汞钾白色沉淀（+）皂苷类泡沫反应泡沫持续时间>10min（+）黄酮类盐酸-镁粉反应呈紫红色（+）三氯化铝黄绿色荧光（+）还原糖斐林试剂砖红色氧化亚铜沉淀（-）有机酸溴甲酚绿试验有黄色斑点（+）挥发油油斑实验油斑减少表3-1的鉴定结果表明：金银花的活性成分有黄酮、生物碱、脂类、挥发油、有机酸等成分。3.2绿原酸标准曲线绘制结果表3-2绿原酸吸光光度值绿原酸浓度/(μg/mL)246810吸光度/A0.190.270.360.430.50最大吸收波长和标准曲线绘制如下：图3-1绿原酸最大吸收波长图图3-2绿原酸标准曲线由图3-2可知绿原酸浓度在2~10μg/mL范围内满足良好的线性关系。得到浓度与吸光度的计算公式：Y=0.0395X+0.109，R2=0.9983。由此可以根据吸光度值计算出绿原酸的得率。3.3绿原酸的得率计算Y=[(A-0.109)/0.395×N×V×10-3]/M式中Y：绿原酸得率(mg/g)；A：吸光度；N：稀释倍数；V：绿原酸滤液体积(mL)；M：金银花原料的质量(g)。3.4绿原酸提取方法确定方法绿原酸得率（mg/g）水提法3.88乙醇回流提取法5.01表3-3不同提取方法绿原酸的得率由表3-3得到乙醇回流提取法的得率高于水提法的得率，所以选用乙醇回流法提取金银花中的绿原酸，不仅可以提高提取率，而且可以回收溶剂，节约资源。3.5金银花绿原酸单因素实验结果分析3.5.1提取温度对绿原酸得率的影响根据实验数据得到以下实验结果：提取温度/（℃）5060708090绿原酸得率（mg/g）3.974.734.534.364.12表3-4提取温度对绿原酸得率的影响图3-3提取温度对绿原酸提取效果提取的影响由图3-3可看出，绿原酸的得率随着提取温度的升高而升高，但达到60℃后又开始下降。这是因为在较低的温度范围内随着温度的升高，金银花与乙醇溶剂传质速率增大。但绿原酸不稳定，当温度过高时，会加速绿原酸的分解，并使其有效成分被破坏失活，使绿原酸的得率降低。故选取60℃为提取绿原酸的最佳温度。3.5.2料液比对绿原酸得率的影响根据实验数据得到以下实验结果：表3-5料液比对绿原酸得率的影响料液比/（g/mL）1:101:151:201:251:30绿原酸得率（mg/g）3.393.814.674.694.68图3-4料液比对绿原酸得率的影响由图3-5可看出，绿原酸的得率随着料液比的增加而增大。这是因为随着料液比的增加．单位质量金银花周围的乙醇溶液含量增多，溶剂与原料充分接触，二者的传质作用增强，绿原酸得率增大。但是当料液比大于1：20后，绿原酸得率增长减弱。而且随着料液比的增大，给绿原酸的精制带来困难，同时又浪费了溶剂，增加了生产成本。故选取1:20为提取绿原酸的最佳提取料液比。3.5.3提取时间对绿原酸得率的影响根据实验数据得到以下实验结果：表3-6提取时间对绿原酸得率的影响提取时间（min）3045607590绿原酸得率(mg/g）4.164.434.744.243.91图3-5提取时间对绿原酸得率的影响由图3-5可看出，绿原酸得率随着提取时问的增加而增大，当浸提时间达到60min时，提取效果最佳；当提取时间大于60min，绿原酸的得率反而下降，这可能是因为提取时间过长，提取物中的杂质可能会增加，而这些杂质会吸附部分绿原酸，造成绿酸得率降低，故选取60min为提取绿原酸的最佳提取时间。3.5.4乙醇浓度对绿原酸得率的影响根据实验数据得到以下实验结果：表3-7乙醇浓度对绿原酸得率的影响乙醇浓度（%）5060708090绿原酸得率(mg/g)0.630.921.330.830.61图3-6乙醇浓度对绿原酸得率的影响由图3-6可看出，绿原酸得率随乙醇浓度的增加而增大，当乙醇浓度达到70%时，提取效果最佳；当乙醇浓度大于70%时，绿原酸的得率反而下降，这可能是因为浓度过高，当乙醇浓度过大时．金银花组织内的一些绿原酸不易被高浓度的乙醇萃取，一些杂质会萃取出会影响绿原酸的析出，故乙醇浓度为70%是提取的最佳浓度。3.6绿原酸提取正交实验结果分析表3-8L9（34）绿原酸提取正交试验结果表试验号A提取温度（℃）B料液比（%）C提取时间（min）D乙醇浓度（%）绿原酸得率(mg/g）11（50）1（1：15）1（45）1（60）3.88212（1：20）2（60）2（70）4.72313（1：25）3（75）3（80）4.6442（60）1234.84522314.99623125.0473（70）1324.62832134.11933213.96K14.4164.4474.2534.313K24.8994.4654.5104.705K34.2334.4564.4784.529R0.4600.1380.4310.592优水平A2B3C1D2因素主次A.>B>C>D表3-9绿原酸提取工艺验证实验表实验序号绿原酸得率(mg/g)15.0325.43结果分析1<2注：序号1为正交试验中绿原酸得率最高的提取工艺；序号2为正交试验分析的理论绿原酸得率最高的提取工艺；由表3-9可得：本实验所确定的绿原酸得率最高的实验条件为以A2B2C2D2为最佳提取工艺，即料液比为1:20，乙醇浓度为70%，提取温度为60℃，提取时间为60min时绿原酸的得率最高。3.7复配胶比例结果分析表3-10复配胶比例对果冻强度的影响卡拉胶：魔芋胶果冻强度感官特征2：3102.34g凝胶不够强，弹性大，咀嚼感不佳3：2110.48g凝胶不够强，弹性适中，咀嚼感好4：1118.07g凝胶适中，弹性适中，咀嚼感好从表3-8结果可知：卡拉胶与魔芋胶产生协同增效作用，形成稳定的凝胶体，使凝胶强度提高和口感细腻润滑。在果冻制作中，卡拉胶：魔芋胶为4∶1时，果冻强度最适宜，口感最佳，凝胶强度最适。3.8清咽果冻配方正交试验结果表3-11L9（34）清咽果冻正交实验结果试验号A复配胶添加量%B白砂糖添加量%C柠檬酸添加量%D