Tan第六章-外源基因的表达课件

本课程内容第一章绪论第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的载体第四章目的基因的制备第五章目的基因导入和重组子的筛选第六章外源基因的表达第七章基因操作的基本技术第八章植物基因工程及应用第九章动物基因工程及应用第十章医学基因工程及应用7/10/20231欢迎同学们听课！第六章外源基因的表达第一节大肠杆菌表达系统第二节E.coli重组蛋白的限制因素第三节真核生物表达系统7/10/20232欢迎同学们听课！引言生物技术的应用可以追溯到4000年前，新石器时代的晚期，利用发酵过程生产蜂蜜酒。20世纪，随着一系列的微生物在工业上的应用，生物技术得到了广泛的发展。1927年，AlexanderFleming发现Penicillium能够合成青霉素。随后，真菌和细菌被广泛应用于大规模的生产抗生素。许多重要的医药，并不是来自于微生物，而是高等生物产生的。基因工程的应用，带来了生物技术的革命。基因工程意味着重要的植物或动物蛋白基因可以从宿主中分离出来，插入载体，引进细菌获得大量蛋白。7/10/20233欢迎同学们听课！外源基因表达体系：泛指目的基因与表达载体重组后，导入合适的受体细胞，并能在其中有效表达，产生目的基因产物。有基因表达载体和受体细胞两部分组成。原核基因表达系统和真核基因表达系统。7/10/20234欢迎同学们听课！原核生物作为基因表达系统的受体细胞的特点：单细胞异养，生长快，代谢易控制。基因组结构简单，基因操作和分析容易。含有质粒或噬菌体，易于构建表达载体。生理代谢途径及基因表达控制机制比较清楚。无真核生物的蛋白质加工系统。有内源蛋白酶7/10/20235欢迎同学们听课！mRNA的延伸与稳定性防止非特异性终止：避免衰减子；加入抗终止的序列元件。转录终止序列：保证转录正常终止，防止产生不必要的转录终止产物，使mRNA的长度限制在一定范围内，增加外源基因表达的稳定性。Poly(A)掺入信号序列7/10/20237欢迎同学们听课！表达蛋白在细胞中的稳定性：防止表达产物被内源蛋白水解酶水解途径：a.构建融合蛋白表达体系b.构建分泌蛋白表达体系c.构建包涵体表达体系d.选择蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统7/10/20238欢迎同学们听课！第一节大肠杆菌表达系统大肠杆菌基因表达载体的重要组成元件：启动子：Lac和Tac；PL和PR；T7核糖体结合位点插入位点终止子复制起始区选择标记7/10/202310欢迎同学们听课！外源基因在大肠杆菌中的表达形式：包涵体、融合蛋白和分泌蛋白寡聚型外源蛋白：a.多表达单元的串联重组b.多顺反子重组c.多密码序列重组整合型外源蛋白：将外源基因整合到宿主染色体非必需编码区，在合适的条件下高效表达。7/10/202311欢迎同学们听课！融合蛋白、分泌蛋白和包涵体融合蛋白(fusionprotein)：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，没有改变两个基因的阅读框，以这种形式表达的蛋白，称为融合蛋白。分泌型蛋白(secretedprotein)：外源基因的表达产物N端连有一信号肽序列，通过运输和分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。包涵体(inclusionbody)：一定条件下，外源基因表达产物在大肠杆菌中积累并致密地聚集在一起形成无膜的裸露结构，称为包涵体。7/10/202312欢迎同学们听课！3）核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。

高等生物的基因也被表达信号所包围，但他们的核苷酸序列与E.coli的并不相同。比较E.coli和人类的启动子，有一些是相同的，但是E.coli的RNA聚合酶不可能结合到人类的启动子上，细菌不能识别人类基因的表达信号。7/10/202314欢迎同学们听课！基因表达的信号7/10/202315欢迎同学们听课！表达载体的结构7/10/202317欢迎同学们听课！（一）启动子

启动子是表达载体的最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。获得重组蛋白的数量很大程度上取决于表达载体所携带的启动子。启动子：诱导型启动子组成型启动子调控元件7/10/202318欢迎同学们听课！真核与原核生物启动子的差异7/10/202319欢迎同学们听课！a)启动子的选择

所有E.coli启动子都有两个保守序列，保守序列的变化是影响转录效率的主要因素。强启动子可以启动高效率的表达，合成大量表达产物。相反，弱启动子，在细胞中表达量较低。表达载体应该含有强启动子，这样克隆的基因可以以最高的速度表达。

建立表达载体的另一个需要考虑的因素是启动子的调控，主要有两种调控方式：

诱导：一个诱导的基因是在加入底物后基因的表达才能启动

抑制：可抑制的基因是在加入调控物后表达被关闭。7/10/202320欢迎同学们听课！大肠杆菌基因表达的调控方式7/10/202321欢迎同学们听课！基因调控是一个复杂的过程，启动子的参与仅仅是间接的。许多参与诱导和抑制的序列存在于启动子的周围。所以诱导和抑制启动子的化学试剂也同样调控克隆基因的表达。

如果重组蛋白对细菌有害，其合成必须严格控制在毒性的水平之下。可以利用调控物抑制基因的表达。即使重组蛋白对寄主细胞无害，仍然需要调控克隆基因的表达，因为持续的高水平表达可以影响重组质粒的复制，最终导致表达产物的下降。

b)表达载体应用的启动子

几种使用频率最高的启动子：

7/10/202322欢迎同学们听课！突变体所产生的cI蛋白可以抑制λPL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。（二）Cassettes和基因融合

一个高效的表达载体不仅需要可调控的强启动子，而且需要E.coli核糖体的结合位点序列和终止子。在载体中，这些表达信号组成一个cassette。

某些casstte载体，克隆的基因并不是直接的与核糖体结合位点临近，而是在一段E.coli基因之后，E.coli的基因直接与结合位点相邻。外源基因的插入必须能够融合两个阅读框架的方式进行，这样就产生了杂交的基因。因此基因的表达产物是一个蛋白质的杂交7/10/202324欢迎同学们听课！分子，包含E.coli阅读框架编码的短肽和外源基因蛋白，这样一个融合的系统具有四种优点：

1)克隆基因的mRNA的高效翻译不仅依赖于核糖体结合位点的存在，而且受编码起始的核苷酸序列的影响。这可能是链间配对形成的次级结构可以影响核糖体与其结合位点的结合。如果相关的序列是由E.coli序列组成，可以避免这一可能性。

2)在融合蛋白中存在细菌肽可以稳定分子阻止被寄主细胞降解。

3)细菌片段可能含有信号肽，引导重组蛋白运输到胞外。如ompA或者malE基因，这样重组蛋白可以7/10/202325欢迎同学们听课！利用CNBr将融合蛋白从蛋氨酸处切下

7/10/202327欢迎同学们听课！第二节E.coli重组蛋白的限制因素在E.coli中生产蛋白仍然存在许多问题，这些问题可以分为两大类：一是因为外源基因的序列；二是因为在E.coli合成重组蛋白存在限制。

一、外源基因序列导致的问题

有三种方式可能导致核苷酸序列阻止外源基因在E.coli中的高效表达：

1）外源基因可能含有内元。E.coli缺乏切除内元的机制。

2）外源基因可能含有在E.coli作为终止子的序列。

3）基因的密码子可能不适合于E.coli中翻译。7/10/202328欢迎同学们听课！总体上讲，所有的生物都共用相同的密码子，但每一种生物都有偏爱的密码子，表现在tRNA识别不同密码子的效率不同。

上述问题都是可以解决的。如果克隆的基因含有内元，可以使用mRNA。定点突变的方法改变可能的终止序列。用E.coli偏爱的密码子。另外一个方法，对于小于2kb的基因可以利用化学合成的片段来代替，利用氨基酸序列作为参考，使用E.coli偏爱的密码子，并保证不会有提前存在的终止序列。7/10/202329欢迎同学们听课！偏爱密码子的问题7/10/202330欢迎同学们听课！核糖体结合位点被遮蔽

7/10/202331欢迎同学们听课！二、E.coli合成重组蛋白的限制

利用E.coli作为寄主细胞合成重组蛋白可能遇到的问题与细菌的遗传特性有关，例如：

1）E.coli不能加工成正确的重组蛋白。细菌和高等生物的加工过程是不同的。特别是一些动物的蛋白要进行糖基化。糖基化在E.coli中是非常罕见的，在E.coli中合成的蛋白不能正确的糖基化。

2）E.coli不能正确的折叠蛋白，形成无活性蛋白。如果蛋白不能进行正确的折叠，其三级结构往往是不溶的，在细菌中形成内含体。这样在细菌中提取蛋白不存在问题，但将蛋白转化为正确的折叠方式是比较困难的甚至是不可能的。7/10/202332欢迎同学们听课！3）E.coli可能降解重组蛋白。

这一类问题很难解决的，重组蛋白降解的问题可以使用一个或多个蛋白酶突变E.coli来解决。正确折叠也可以通过选择特异的寄主品系来解决。最主要的问题是糖基化的问题，到目前为止仍然是无法解决的问题，只有不需要糖基化的蛋白可以利用这种途径合成。7/10/202333欢迎同学们听课！第三节真核生物表达系统真核基因在大肠杆菌中表达存在的问题：真核基因的结构具有内含子，而大肠杆菌等原核生物没有转录产物剪接加工系统。真核生物mRNA的结构与大肠杆菌中的不同，影响到真核mRNA在原核细胞中的稳定性及与核糖体的结合能力。真核生物的基因对简并密码子的使用偏好与大肠杆菌的不同。大肠杆菌细胞没有真核生物的蛋白质加工修饰系统，使表达产物不能正常折叠。大肠杆菌内源蛋白酶会对真核基因表达产物产生降解，造成表达产物的不稳定性。7/10/202334欢迎同学们听课！真核基因在大肠杆菌中高效表达的对策：克隆真核基因的cDNA或化学合成不带内含子的基因进行表达。将SD序列（核糖体结合位点）引入表达载体，使之位于转录起始点的下游和插入外源基因的上游，保证SD序列与起始密码子间的准确距离和碱基组成，防止核糖体结合位点附近序列转录后形成茎环二级结构。通过点突变等方法将外源基因中的密码子转化为大肠杆菌等受体细胞高频出现的同义密码子。7/10/202335欢迎同学们听课！真核基因在大肠杆菌中高效表达的对策（续）改变外源mRNA的结构使之不易被核酸酶降解。通过多途径提高表达产物的稳定性：a.改变外源基因的表达形式；b.选用某些蛋白水解酶缺陷株作为受体菌；c.对外源蛋白中水解酶的敏感位点进行修饰或改造;d.表达外源蛋白的同时表达外源蛋白的稳定因子。7/10/202336欢迎同学们听课！一、酵母和丝状真菌表达系统酵母作为基因表达受体细胞的特点：单细胞真核生物。具有原核生物没有的蛋白质翻译后的加工和修饰系统。基因组全序列的测定已完成，基因的表达调控机。制比较清楚，遗传操作相对简便。不含毒素和特异性病毒，对人体和环境安全。发酵工艺成熟，成本低廉。7/10/202337欢迎同学们听课！酵母表达载体的重要组成元件：复制起始区：选择标记：营养缺陷型；显性选择标记有丝分裂稳定区表达盒（expressioncassette)：启动子、分泌信号序列和终止子。7/10/202338欢迎同学们听课！酵母表达载体的种类：自主复制型质粒载体整合型质粒载体着丝粒型质粒载体酵母人工染色体7/10/202339欢迎同学们听课！酵母表达体系的宿主菌：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）毕赤酵母（Pichiapastoris，巴斯德毕赤酵母）

乳酸克努维酵母（Kluyaeromyceslacti）7/10/202340欢迎同学们听课！在酵母中高效表达外源基因的策略根据表达载体的特性性质合适的酵母受体系统。提高表达载体在细胞中的拷贝数及非选择压力下保持拷贝数的稳定。提高外源基因转录水平。7/10/202341欢迎同学们听课！目前，高等微生物已经成为生产动物蛋白的常规方法。但仍然需要一些载体，动物基因的启动子和其他一些表达信号在低等的真核生物中并不能很好的、高效的表达。

（一）酵母S.cerevisiae是目前生产重组蛋白的最普遍的真核微生物。

克隆的基因一般在GAL启动子的控制之下，GAL启动子可以被半乳糖所诱导。S.cerevisiae可以以很高的产量生产蛋白质，但不能正确的糖基化动物蛋白，7/10/202342欢迎同学们听课！也不能将产生的蛋白分泌到培养基中，这样需要从细胞中分离纯化蛋白，增加成本。偏爱密码子也是一个问题，尽管存在这些问题，S.cerevisiae仍然是应用最广泛的生产重组蛋白的真核微生物。在一定的程度上是因为，它是在医药和食品工业中安全的一种生物体，另外还因为S.cerevisiae的生化和遗传研究已经非常详细。

（二）Pichiapastoris，可以合成大量的重组蛋白（可以达到总蛋白的30%），而且其7/10/202343欢迎同学们听课！糖基化与动物非常相似。它所合成的糖化结构与动物的可能不完全相同，但只有细微的差异，并不影响重组蛋白的活性。重要的是，Pichiapastoris产生的蛋白注入血液后，不产生抗原反应。而在S.cerevisiae中，由于过分的糖基化，这样的问题经常会碰到。Pichiapastoris的表达载体利用AOX（乙醇氧化酶）作为启动子，可以被甲醇所诱导。7/10/202344欢迎同学们听课！酵母对人体蛋白的糖基化

7/10/202345欢迎同学们听课！（三）两种重要的丝状真菌是Aspergillusnidulans（构巢曲霉）和Trichodermareesei（瑞氏木霉）。

这些生物的优点是：良好的糖基化能力，并能将产生的蛋白分泌到细胞外。后者是木霉真菌Trichodermareesei的重要特性，在自然中，它能将分解纤维素的酶分泌到它所生存的木头上。分泌特性可以简化重组蛋白的提取。

Aspergillusnidulans的表达载体一般使用葡糖淀粉酶的启动子，可以被淀粉所诱导，被木糖所抑制。

Trichodermareesei使用纤维二糖氢化酶作为启动子，可以被纤维素所诱导。7/10/202346欢迎同学们听课！二、昆虫表达系统

昆虫细胞也可作为生产动物蛋白的重要选择。这种表达系统是以baculovirus为基础的，这种病毒在昆虫中是非常普遍的，但并不侵染脊椎动物。baculovirus的基因组包括多面体基因，他的产物在细胞中的积累可以在侵染循环的末期产生大量的核酸包含体。这个基因的产物占总细胞蛋白的50%左右，如果该基因被外源基因所取代，但产生的蛋白也有相同的水平。所以，该系统最大的优点是，可以产生大量的重组蛋白。7/10/202347欢迎同学们听课！最大的问题是昆虫细胞是否与哺乳动物具有相同的蛋白加工的方式：已有的研究表明，大部分是相同的，但并不总是相同。baculovirus表达系统的应用价值有待于进一步的研究。7/10/202348欢迎同学们听课！三、哺乳动物表达系统对于复杂糖基化结构的蛋白，动物细胞是可以合成有活性蛋白的唯一寄主。但大规模的连续的培养动物细胞存在问题。而且动物细胞的生长速度和最大密度比微生物要低得多，这样就影响了重组蛋白的产量。哺乳动物中应用较多的两个启动子是人类的热激启动子：hsp-70基因的启动子，可以在40°C的条件表达；老鼠金属硫因基因的启动子（mousemetallothionein），培养基中加入锌盐可启动表达。7/10/202349欢迎同学们听课！哺乳动物基因表达载体组成特征：a.启动子b.复制子c.mRNA剪接和加尾信号