蛹虫草子实体中天然色素的提取工艺毕业论文

长春工业大学本科毕业论文前言蛹虫草最早源于中国，俗称北冬虫夏草或北虫草，由于其药用价值与冬虫夏草极其相似，故药典中记为“北冬虫夏草”。味甘、性平，具有益肺补肾，止血化痰的功效。近些年的研究表明：蛹虫草与冬虫夏草极其相似，无毒副作用，可做为冬虫夏草的良好代用品。其在治疗老年痴呆，清除人体自由基，降血脂，保护肝肾及呼吸系统，调节内分泌与免疫系统，抗肿瘤、抗疲劳、抗病源微生物，镇静抗惊厥作用等方面有极佳的功效。蛹虫草天然色素作为蛹虫草子实体中的生理活性物质之一，也是研究的重点。所以，随着对蛹虫草子实体中天然色素研究的不断深入，利用蛹虫草子实体中天然色素开发的保健品，功能性食品添加剂和药品的市场前景为人研究者们所看好。为了研究出有利于人们身体健康的、经济效益高的蛹虫草子实体中天然色类的深加工产品，就需要我们广大的食品科学家、生物学家和医学家们的共同努力，从而带动整个研究的快速发展。因此，本实验开展对蛹虫草子实体中天然色素提取工艺的研究和优化，为工业化规模性生产蛹虫草子实体天然色素提供理论依据。文献综述2.1蛹虫草子实体2.1.1生长条件蛹虫草子实体是蛹虫草生殖细胞“孢子”（相当于植物的种子）随风飘散粘上某些昆虫的蛹后，萌发菌丝并侵入蛹体内吸取养分，而后从蛹体上长出的金黄色、或橘黄色、或橘红色的棍棒状物体，是产生生殖细胞“孢子”的生殖体（相当于植物的果实体）。图2.1人工培养的蛹虫草子实体图2.2蛹虫草菌丝体生长史蛹虫草是一类复型真菌，在生活史中有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。蛹虫草的菌丝是一种子囊菌，当子实体成熟后可以形成子囊孢子，孢子散发后随风传播。如果孢子落在适宜的昆虫蛹（虫）体上，特别是幼虫的虫体上后，便开始萌发形成菌丝体[1]。菌丝体以昆虫蛹体或虫体的体内组织和器官作为其生长发育的物质和能量来源，很快布满整个昆虫蛹体或虫体的内部，最后将蛹体或虫体内部各种组织和器官完全分解。自此以后，菌丝体由营养生长开始转为生殖生长，菌丝体扭结，并从虫体空壳的头部、胸部、近尾部等处伸出，形成金黄色、橘黄色或橘红色的、顶部略膨大的棒状子实体。在子实体的顶端，着生许多表面呈乳头状突起的子囊壳，每个子囊壳内产生许多子囊孢子，当子囊孢子成熟后放射出来，又开始下一轮生活史。生长地域蛹虫草寄主的专一性不强，可寄生于鳞翅目、鞘翅目、双翅目等昆虫的幼虫、成虫和蛹，并且大多数寄生于蛹。其寄主昆虫共有3目11科19种。野生蛹虫草是一种世界性分布的广布种，其地理分布区域遍及全世界。在我国，野生蛹虫草主要分布在吉林，辽宁、河北、陕西、安徽、广西、云南、广东、四川、贵州、湖北、湖南、山西、山东、江苏，河南等十几个省区[2]。主要表现出以下分布规律：多生长于春夏季节的4～7月份，或秋冬季节的8～11月份；海拔高度一般在100～2000左右；年均气温为2～12℃，最高气温36℃，最低气温-36℃，在蛹虫草大量产生的4～11月份，气温较高，平均气温为9～28℃；蛹虫草产区多属温带湿润气候，年均降水量在650毫米以上，空气相对湿度为60～95%，土壤湿度为20～65%；野生蛹虫草多产生在针阔混交林地上，土壤多为棕壤土、紫红壤土等腐殖质土壤，一般土壤腐殖层3～9厘米的林地中较多[3]。2.1.2功能作用蛹虫草含有虫草素、虫草酸、虫草多糖、蛋白质、超氧化物歧化酶（SOD）、麦角甾醇、氨基酸、维生素及多种微量元素，与冬虫夏草的化学成分基本相同[4]。另外还包含虫草素在内的腺苷、尿苷、尿嘧啶、腺嘌呤等物质。虫草素1951年，加拿大的Cunningh等观察到被蛹虫草寄生的昆虫组织不易腐烂，随后从中分离到一种腺苷类活性物质，命名为虫草素(Cordycepin)，并确定其结构式为3’-脱氧腺苷(3’-Deoxyadenosine)，虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素。虫草素又称虫草菌素、蛹虫草菌素、3’-脱氧腺苷。在已报道的400多种虫草中，蛹虫草是唯一能大量产生虫草素的虫草。分子生物学和现代医学的研究发现，虫草素具有多方面作用[5]：免疫调节、抗肿瘤、抗真菌；增加脾脏重量、加快肝脏核酸和蛋白质更新速度，抗缺氧、增加心肌营养血流量及降低血清胆固醇和B酯蛋白，刺激糖酵解导致ATP合成增加，增强肝脏功能和肌肉中CPK的活性，对由于激素失调引起的性功能损伤有修复作用，能明显增加冠脉血流量，降低冠脉、脑及外围血管阻力。丁向萍[6]等的研究报告《虫草素诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对端粒酶活性影响的研究》中指出，虫草素有抗肿瘤的作用。虫草酸虫草酸(Cordycepicacid)是冬虫夏草主要活性成分之一，又名甘露醇(Mannitol)，化学分子式C6H14O6，为1,3,4,5—四羟基环已酸。施英[7]等在《蛹虫草药理作用研究进展》中提到，虫草酸能抑制各种病菌的成长，可预防与治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞、长期衰竭；虫草酸含量的高低是衡量虫草质量的主要标准之一，一般认为虫草酸含量高的虫草的药用价值高。黎颖[8]在《甘露醇的性质、生产与发展建议》中提到：甘露醇（虫草酸）由于能部分吸收、并发生代谢，是一种较强的自由基清除剂，以及其渗透性脱水和利尿的作用。虫草多糖虫草多糖是一类高分子复合物，在蛹虫草中含量为4～10%，是蛹虫草中含量最高的主要药理活性物质。它的抗癌活性和免疫活性已引起人们的极大兴趣。从1977年开始，日本和中国的科研人员开始对虫草多糖开展研究，已从天然冬虫夏草以及人工培育的虫草真菌中分别分离纯化出了多种多糖组份，并对其理化性质和药理活性进行了详细研究。大量研究表明，虫草多糖有着多种生物活性功能，被医学界和药物学界认为是当前世界上非常好的免疫促进剂之一[9]，具有广泛的药理作用：可活化巨噬细胞刺激抗体产生，提高人体免疫能力，改善呼吸系统，可使肾上腺重量、血浆皮质醇、醛固酮及肾上腺内胆固醇含量增加，有促进肾上腺的作用，抑制肿瘤生长，并具有抗肿瘤[10]、抗辐射、降血糖和脂蛋白、止咳、化痰、润肺和延缓衰老等药理作用，此外,虫草多糖还能抗心律失常，抗心肌缺血，扩张外周血管，降压，降血脂，抑制血小板聚集。李连德[11]等在《虫草多糖研究进展（综述）》中总结道：多糖是存在于自然界的醛糖和酮糖通过糖苷键连在一起的多聚物，是一切有生命的有机体必不可少的成分，同维持生物机能密切相关。多糖作为药物始于1943年，并广泛作为广谱免疫抑制剂。多糖是非特异性的免疫调节剂（生物效应调节剂BRM），它主要影响网状内皮系统（RES）、巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞以及RNA、DNA、蛋白质的合成、CAMP（环化腺苷-磷酸）的含量，抗体的生成、补体的形成以及干扰素的诱生，并具有抗肿瘤、抗炎、抗凝血、抗病毒、抗放射、降血糖、降血脂等活性。超氧化物歧化酶（SOD）超氧化物歧化酶Orgotein(SuperoxideDismutase,SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质[12]。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。赵勇[13]在《超氧化物歧化酶（SOD）的应用研究进展》中验证：超氧化物歧化酶（SOD）广泛存在与一切生物机体内，通过催化超氧阴离子自由基发生歧化反应、减轻或消除超氧阴离子自由基对机体的损害。超氧化物歧化酶还可以被应用在医药、食品、农业和化妆品等领域[14]。麦角甾醇麦角甾醇是生产维生素D2的前体，也是生产激素类药物的中间体，可用来生产可的松、黄体酮，有维生素D2的作用。邓玉清[15]等人在《微生物麦角甾醇的研究进展》中印证了：角固醇是微生物细胞膜的重要组成部份，对确保细胞膜的完整性，膜结合酶的活性，膜的流动性，细胞活力以及细胞物质运输等起着重要作用。高虹[16]等人在《巴西菇麦角甾醇抗肿瘤活性及作用机理初探》结果表明：巴西菇子实体中提取的麦角甾醇在剂量10mg/kg·d、50mg/kg·d和100mg/kg·d时的瘤重抑制率分别为62.75%、77.61%和79.18%，说明麦角甾醇有较强的抑瘤活性。其他成分除上述成分外，还包含多种微量元素以及虫草素在内的腺苷、尿苷、尿嘧啶、腺嘌呤等物质。腺苷是一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量。腺苷对心血管系统和肌体的许多其它系统及组织均有生理作用。腺苷是用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。蛹虫草富含硒，硒被称为微量元素中的抗癌之王，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—PX)的必需组分，GSH-PX可引起人体不断产生可致癌自由基的破坏。此外，蛹虫草子实体中含有的氨基酸、维生素对蛹虫草的功效开发也有一定作用。2.1.3药用价值提高免疫力蛹虫草子实体中含有的虫草多糖是提高免疫力的最主要的原因。虫草的82.2%为不饱和脂肪酸，此外，尚含有维生素B12、麦角脂醇、六碳糖醇、多种生物碱等，具有调节免疫系统功能，提高细胞能量、抗疲劳的功效。徐廷万[17]等实验得出：人工蛹虫草胞外多糖可增强免疫功能被抑制的非特异性免疫功能和体液免疫功能，还有抗疲劳作用。戴瑛[18]等实验得出：蛹虫草提取物可调节小鼠机体组织的免疫功能，可以缓解由于内毒素或类似物质造成的肺部炎症，具有一定的肺保护作用。刘海燕、魏本征[19]等也通过实验表明：柞蚕蛹虫草对小鼠机体的非特异性免疫功能有明显的增强作用。抗癌作用蛹虫草有良好的抗癌作用，而发挥最大功效的就是蛹虫草子实体中的虫草素。。孙艳等通过对荷肝癌小鼠的实验得出，人工蛹虫草子实体具有抑癌作用，除直接作用外，还可使宿主特异性免疫功能增强而获得明显的免疫保护效应。孙科峰[20]等实验表明：蛹虫草子实体可明显延长S180腹水型小鼠的生存率,对S180实体瘤小鼠的肿块生长有一定的抑制作用;对S180荷瘤小鼠的肿瘤免疫活性因子TNF-β和IL-2有明显的促进作用。汤新强[21]等将人工蛹虫草胞外多糖与治疗剂量的卡铂合用，可增强卡铂的抗肿瘤作用。抑菌、抗炎作用虫草素对葡萄球菌、链球菌、鼻疽杆菌、炭疽杆菌、猪出血性败血症杆菌等均有抑制作用。蛹虫草煎剂对须疮癣菌、絮状表皮癣菌、石膏样小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌等真菌及鸟结核杆菌、枯草杆菌、鼻疽杆菌等结核杆菌也均有抑制作用。宾文等[22]实验表明，人工培养蛹虫草多糖具有抗炎作用，对细胞免疫没有明显的影响。镇静、抗惊厥作用陈桂宝[23]等研究表明，蛹虫草有明显的镇静、耐缺氧、抗炎等作用，对异丙肾上腺素诱发小鼠心肌耗氧量增加也有明显的保护作用。陈敬民[24]等发现蛹虫草能明显减少小鼠的自主活动,拮抗戊四氮所致的小鼠惊厥和一定程度协同戊巴比妥钠诱发小鼠睡眠,表明蛹虫草具有镇静催眠作用。抗衰老作用年龄的增长和某些体外因素会造成机体和皮肤组织自由基产生超过机体正常清除自由基的的能力，从而使皮肤组织造成伤害，导致衰老。由于SOD能够清除自由基，因而可以延缓衰老。人之所以会衰老，老化迹象一点一滴出观，如色素沉淀、体力衰退、是因为体内产生氧化作用，所谓“氧化作用”就类似于生锈，抗氧化剂的补充有助于降低氧化的速度，减慢衰老的脚步。王琦[25]等实验结果表明，蛹虫草能明显降低老年大鼠体内的过氧化脂质（LPO）含量和自由基水平，进而保护细胞免受O2-损害，延缓器官和整个机体的衰老。张桂英等也做了这方面的实验，结论是柞蚕蛹虫草具有提高老龄大鼠超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和明显降低LPO含量的作用。降血脂赵鹏[26]等用不同剂量的蛹虫草菌丝体粉对大鼠的灌胃实验得出：蛹虫草菌丝体具有降低血脂的作用。其他作用除以上功效外，蛹虫草子实体还有其他功能，例如：抗病毒、抗菌、明显抑制肿瘤生长、干扰人体RNA及DNA合成，预防治疗脑血栓、脑溢血、肾功能衰竭，利尿，同时还有抑制血小板积聚防止血栓形成，消除面斑，抗衰防皱的功效。2.2天然色素色素可分为天然色素和合成色素两大类。而来源于天然植物的根、茎、叶、花、果实和动物、微生物等的色素，称为天然色素。由于天然色素对人体无毒无害，营养价值高，且有些具有一定的生物活性，而从添加量上看食用色素在食品中占的比例很小，一般为产品，饮料、酒类、糕点、糖果、医药等的千分之几、万分之几甚至是十万分之几。2.2.1天然色素的种类天然色素按来源和性质，可分为植物、动物、微生物和矿物色素。矿物色素大多对人体有害，现已不再用于食品着色，动物、微生物色素的应用也较少。天然植物色素可根据化学结构，形态来源和溶解性进行分类，最常用的方法是按照化学结构来分类。多酚类色素多酚类色素主要包括：茶黄色素、多穗柯棕、儿茶黑色素、金樱子棕等。类胡萝卜素类类胡萝卜素是一类重要的天然色素的总称，属于化合物。普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中的黄色、橙红色或红色的色素，主要是β-胡萝卜素和γ-胡萝卜素，因此而得名。不溶于水，溶于脂肪和脂肪溶剂，亦称脂色素。主要包括：番茄色素（番茄红素）、天然胡萝卜素、混合类胡萝卜素、玉米黄、胭脂俗橙色素、藏红花色素、栀子黄色素、栀子绿色素、辣椒红色素、甜椒红色素、辣椒橙色素、南瓜黄色素、沙棘黄、密蒙黄色素、柑橘披黄色素、苜蓿色素、万寿菊色素、柑橘黄、枸杞色素、银杏黄色素、苦瓜色素、蒲公英色素等。酮类色素酮类色素主要包括：姜黄色素、姜黄油树脂、姜黄、姜黄素、郁金色素、郁金香红色素等。醌类色素醌类色素主要包括：茜草红色素、紫草红、紫草色素、紫蓝红色素、紫草素、虎杖色素、凤仙花红色素、决明子红色素等。2.2.2天然色素的性质副作用小，安全性高绝大多数天然色素来自动物、植物组织。因此无毒副作用，安全性高。天然植物色素大多为花青素类、类胡萝卜素等，因此天然色素不但是无毒无害的物质，而且还含有很多人体必须的营养物质和微生物物质，例如番茄红色素，β-胡萝卜素等。色调比较自然，能较好的模仿天然物的颜色植物色素的着色色调比较自然，既可增加色调，又与天然色泽相近，是一种自然的美。植物色素在植物体中含量较少，分离纯化较为困难[27]，其中有的共存物存在时还可能产生异味，因此生产成本较合成色素高。部分天然色素对热、氧、金属及pH值等敏感，稳定性较差天然色素的种类繁多，性质复杂2.2.3天然色素的结构特点按照化学结构不同可分为四吡咯类色素(如叶绿素)、类胡萝卜色素(如辣椒红色素)、花青类色素(如葡萄红色素)、黄酮类色素(如高粱红色素)、醌类色素(如紫草色素)、其它类色素(如焦糖色素、姜黄色素、甜菜红色素等)。四吡咯类色素目前应用于食品着色的四吡咯类色素主要有叶绿素、血红素、胆红素和蓝藻素[28]。这类色素的基本结构都是由四个吡咯环的α-碳原子通过次甲基相连而构成的复杂共轭体系，该共轭体系一般与金属离子(Mg2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+)结合。四吡咯环共轭，这类色素的性能主要由共体系结合的金属离子和衍生的外围结构决定。类胡萝卜色素系共轭烯烃（或共轭烯烃的含氧衍生物），能有效的防止自由基对脂质内侧生物膜的损害，而且还是有效的氧自由基捕获器[29]。例如：β-胡萝卜素食维生素A的前体，可提高机体的免疫功能，可防治中风、心血管疾病的作用[30]；番茄红素可以清除自由基，并能有效预防前列腺癌的发生，还可以激活免疫细胞，防止心脑血管疾病的发生；玉米黄色素是单线态氧，可防止脂质过氧化反应的链式传递，从而可以清除膜内的自由基，维持生物膜的完整性；栀子黄色素具有抗氧化能力和解热、消炎、利胆的功效。类黄酮类色素黄酮类色素是带有C6-C3-C6的水溶性酚类物质，可以切断体内产生衰老和疾病的过氧化链式反应。黄酮类色素还可以保护血管，调节血管的扩张，防止动脉硬化和栓塞。花色苷类色素花色苷类色素由糖苷和糖组成，一般情况下为水溶性，能强烈的吸收紫外线，使细胞分化和其他生命过程正常进行，还可以预防冠心病和心急缺损等。徐清海[31]《天然色素的提取及其生理功能》中提到：从我国食药两用的紫苏中提取的紫苏色素，有解毒、散寒、行气和胃的功效。醌类色素醌类色素因其结构中有多个酚羟基，所以具有一定的抗氧化活性以及抗菌、抗癌、抗病毒的作用。2.3天然色素提取方法2.3.1一般提取法蛹虫草子实体天然色素的提取一般是采用研磨的方法[32]。通常先用石英砂协助研磨，再加入丙酮作助磨剂浸提后得到天然色素。由于不同研究者用的提取方法不同，所以蛹虫草子实体中天然色素的得率也不同。张志军[33]等人称取1g蛹虫草子实体的样品，加入0.5g石英砂后研磨，并同时加入20mL丙酮作为助磨剂，在研磨15min之后，将所得的混合物直接用于浸提处理。稍后再室温下振荡30min，之后经过4000r/min的离心机离心10min，最后取得蛹虫草子实体中的天然色素提取液。最后经紫外-可见光吸收光谱法测得天然色素的产量为718μg/g。适用范围：溶于丙酮的色素2.3.2酸热提取法原理主要是由于酸热法使用了对细胞壁中原来结构紧密的某些成分(多糖和蛋白质等)具有强力疏松作用的盐酸，并配合沸水处理及速冷处理，使细胞壁结构得以破坏，胞内物质溶出。特点该法设备简单、能耗小、成本低适用范围对热和pH值不敏感的色素参照郭鹏飞[34]等的方法，每克蛹虫草子实体的样品加2mol/L盐酸10mL，在室温下浸泡40min，随后在沸水浴中处理4min，迅速冷却后，再3000r/min的离心机中离心10min，弃上清液后，将沉淀用蒸馏水洗涤2次后加20mL丙酮，室温下振荡30min以浸提虫草子实体中的天然色素，然后再在4000r/min条件下离心15min，得上清液即为天然色素的浸提液。最后经紫外-可见光吸收光谱法测得天然色素的产量为2736μg/g。2.3.3微波提取法原理微波所产生的电磁场使被萃取的部分向萃取溶剂界面扩散速率加快[35]。例如在用水做溶剂时，在微波场下，水分子高速转动成为激发态，而当水分子本身释放能量回到激态时，它所释放能量传递给其它物质分子，加速其热运动，缩短被萃取分子由物料内部扩散到萃取溶剂界面的时间，从而使萃取速率提高数倍，同时还降低了萃取温度，最大限度的保证了萃取质量。特点用微波法提取可以缩短生产时间,降低能源溶剂的消耗,同时可以提高提取物的纯度适用范围对热稳定的色素参照赵大球[36]等的方法，称取一定量的样品，之后以丙酮为提取剂，料液比1∶20g/mL，将其混匀后置于微波炉中。在微波功率为140W的提取条件下，提取3min。在微波提取后，于室温下振荡30min，经离心机离心后得天然色素的浸提液。最后经紫外-可见光吸收光谱法测得天然色素的产量为696μg/g。2.3.4超声波提取法原理超声波提取法[37]利用超声波的空化作用加速植物有效成分的溶出，另外超声波的次级效应,如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放，并充分与溶剂混合，利于提取；超声波的粉碎、搅拌等特殊作用，可打破植物细胞壁，以使溶媒尽快渗透到植物细胞中，溶出其中有效成分。特点超声波法在提取过程产生强烈的振动、空化、搅拌，与传统提取方法相比具有生产周期短、无需加热、产率高、条件温和有效成分不被破坏等优点参照姬小明[38]的方法，称取一定量样品，以丙酮为提取剂，在料液比为1∶20g/mL的情况下,避光条件下用超声波提取1h，超声后在室温下振荡30min，最后经离心后，取上清液得天然色素的浸提液。最后经紫外-可见光吸收光谱法测得天然色素的产量为628μg/g2.3.5超临界CO2萃取法（SFE）原理利用处于临界温度、临界压力之上的超临界流体具有溶解许多物质的能力的性质,将其作为萃取剂，从液体或固体中萃取分离出特定成分的新型分离技术[39]。特点无化学溶剂消耗和残留、无污染,避免了色素在高温下的热裂化，保护了色素的天然活性，保持了天然色素的色泽、香气纯正。同时提取工艺简单，能耗低，萃取剂便宜，提取的产品具有纯度高，无毒副作用等优点。适用范围番茄红素、β-胡萝卜素、紫草色素、玉米黄色素据文献报道[40]，超临界CO2萃取技术在天然色素萃取中的应用研究主要有番茄红素、β-胡萝卜素、紫草色素、玉米黄色素等的提取。如：在40MPa下，得到65%番茄红素和35%胡萝卜素;超临界CO2萃取技术萃取紫草色素含杂质少，色价高，产品色质好，避免了有机溶剂萃取的溶剂残留问题；在34.47MPa下得到番茄红素为38.8%的最大提取率；所得玉米黄色素的性能指标优于传统方法，萃取率高且不含残留溶剂，产品指标符合国家标准等。2.3.6有机溶液提取法原理相似相溶特点萃取剂便宜，设备简单，操作简单易行，提取率较高，但用其提取的某些产品质量较差，纯度较低，有异味或溶剂残留，影响产品的应用范围。适用范围水溶性、醇溶性的花色苷类、黄酮类、脂溶性色素据姚成立[41]等的研究报告提出：提取高梁红色素是用0.1%的盐酸水溶液浸泡2h，除去杂质和杂色后，再用7%的乙醇水溶液在40℃下浸提，然后过滤、浓缩、干燥而得。利用有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等提取姜黄得姜黄色素。将虾壳用盐酸浸泡24h后过滤，滤渣用95%乙醇浸泡,提取液经蒸馏后得到浓缩的粗制虾青素提取物。2.3.7酶法提取法原理纤维素酶可是纤维素、半纤维素等物质降解，引起细胞壁和细胞间质结构发生局部疏松、膨胀等变化，从而增大胞内有效成分向提取介质的扩散，促进色素提取效率的提高。特点条件温和、有效成分理化性质稳定等优点适用范围红花黄色素2.4蛹虫草子实体天然色素的测定方法2.4.1紫外-可见光吸收光谱法紫外--可见分光光度法是根据物质分子对波长为200-760nm这一范围的电磁波的吸收特性所建立起来的一种定性、定量和结构分析方法[42]。此方法具有灵敏度高、准确度好、选择性优操作简便、重现性好，分析速度好、应用广泛等特点。波长长（频率小）的光线能量小，波长短（频率大）的光线能量大。分光光度测量是关于物质分子对不同波长和特定波长处的辐射吸收程度的测量。2.4.2高效液相色谱法（HPLC）高效液相色谱法是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析技术[43]。该技术具有分离效率高、分析速度快、用样量少、灵敏度高、流出组分可收集,兼具分析和制备等优点，适应于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物分离分析。对于热不稳定性或极性大的天然色素来说，HPLC是一种有效的分离分析方法。赵明波[44]等建立了菊科植物红花中的主要有效成分羟基红花黄色素A的HPLC定量分析方法。HPLC技术在天然色素成分分析中的应用研究主要有玉米黄素、β-玉米黄素、叶黄素、番茄红素、α，β-胡萝卜素的分析。如：玉米黄素、叶黄素、番茄红素与β-胡萝卜素用NovapakC18(4.6mm×150mm)色谱柱，流动相为乙腈-甲醇-二氯甲烷(体积比70:20:10)；β-胡萝卜素、VE、VD3用正相LPorasil柱，反相VydacTP54柱，流动相为己烷-二异丙醚-10%二异丙醚己烷溶液，梯度甲醇-水(体积比93:7)；玉米黄素，叶黄素，β-玉米黄素，α，β-胡萝卜素，用C185Lm色谱柱，流动相为乙腈-甲醇-二氯乙烷(体积比60B35B5)，含0.1%BHT、0.1%三乙胺和0.05mol/L醋酸铵；玉米黄素用C18柱，流动相为甲醇-四氢呋喃(体积比95B5)，流速为1.0mL/min。2.4.3薄层色谱法薄层色谱，或称薄层层析(thin—layerchromatography），是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术[45]。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法，一般是将固定相(如硅胶)薄薄地均匀涂敷在底板(或棒)上，试样点在薄层一端，在展开罐内展开，由于各组分在薄层上的移动距离不同，形成互相分离的斑点，测定各斑点的位置及其密度就可以完成对试样的定性、定量分析的色谱法。薄层层析有许多优点[46]：它保持了操作方便、设备简单、显色容易等特点，同时展开速率快，一般仅需15～20分钟；混合物易分离，而且还可以使用如浓硫酸、浓盐酸之类的腐蚀性显色剂。薄层层析的缺点是对生物高分子的分离效果不甚理想。2.5研究内容及研究意义蛹虫草作为我国名贵且传统的强壮滋补品，在历史上很早就引起了重视和应用。近年来由于国家的重视和商业经济的需求，对蛹虫草的生产、研究和应用取得了迅速发展。蛹虫草天然色素作为蛹虫草子实体中的生理活性物质之一，也是研究的重点。所以，随着对蛹虫草子实体中天然色素研究的不断深入，利用蛹虫草子实体中天然色素开发的保健品，功能性食品添加剂和药品的市场前景为人研究者们所看好。为了研究出有利于人们身体健康的、经济效益高的蛹虫草子实体中天然色素的深加工产品，就需要我们广大的食品科学家、生物学家和医学家们的共同努力，从而带动整个研究的快速发展。本实验就蛹虫草子实体中天然色素的提取进行了进一步的研究，不仅以天然色素的提取产量为目标，还考虑到后续的处理方面，在尽可能多的提取出蛹虫草子实体天然色素的基础上，通过提取方法的优化，在提取过程中完成了对天然色素的初级提取分离操作。本实验为以后进一步研究蛹虫草子实体天然色素的结构奠定基础，也进一步为开发蛹虫草子实体天然色素产品提供了理论依据以及广阔的市场经济前景，其实验数据及实验方法也为其他领域的研究提供了平台和参考。

第三章试验部分3.1材料与设备3.1.1原材料蛹虫草子实体，经粉碎后，干燥条件下保存备用。3.1.2主要仪器（1）YJ1002型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；（2）FQ-250DB型数控超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；（4）721紫外可见分光光度计，上海亚容生化仪器厂；（5）DK-98-Ⅰ型电子恒温水浴锅，天津市泰斯特仪器有限公司；（6）G8023CTL-K3名秀光波微波炉，佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司；（7）101A型电热鼓风干燥箱，中国天津泰斯特仪器有限公司；（8）DH6-914385-Ⅲ电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；（9）HZQ-F160全温振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂。3.1.3主要试剂甲醇（分析纯）丙酮（分析纯）盐酸（分析纯）乙醚（分析纯）石油醚（分析纯）3.2试验方法3.2.1蛹虫草子实体中天然色素的提取工艺酸热浸提法按每克样品加2mol/L盐酸10mL，室温下浸泡40min，在沸水浴中处理4min，迅速冷却，3000r/min离心10min，弃上清液，将沉淀用蒸馏水洗涤2次后加20mL丙酮，室温下振荡30min以浸提天然色素，然后再在4000r/min条件下离心15min，得上清液即为天然色素的浸提液。超声波法称取一定量样品，丙酮为提取剂，料液比1∶20(g/mL)，避光条件下超声波提取1h，为了保持超声温度恒定，采用分段超声，10min为一个提取阶段。超声后室温下振荡30min，离心后取上清液得天然色素的浸提液。微波法称取一定量样品，丙酮为提取剂，料液比1∶20（g/mL），混匀后置于微波炉中。在微波功率为140W的提取条件下，提取时间3min。微波提取后，于室温下振荡30min，离心得天然色素的浸提液。一般研磨法称取1g样品，加入0.5g石英砂研磨，同时加入20mL丙酮作为助磨剂，研磨时间为15min，所得混合物直接用于浸提。室温下振荡30min，4000r/min离心10min得天然色素的提取液。3.2.2蛹虫草子实体中天然色素提取工艺的优化（酸热法）图3.1天然色素提取工艺单因素试验（1）盐酸浓度对蛹虫草子实体中天然色素提取率的影响分别按每克样品加0.01mol/L、0.02mol/L、0.03mol/L、0.04mol/L、0.05mol/L、0.06mol/L盐酸溶液按照酸热提取法的提取工艺过程进行实验，从而确定适宜的盐酸浓度。（2）盐酸用量对蛹虫草子实体中天然色素提取率的影响分别按每克样品加0.5mol/L的盐酸溶液5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL，按照酸热提取法的提取工艺过程进行实验，从而确定适宜的盐酸用量。（3）热处理时间对蛹虫草子实体中天然色素提取率的影响按照酸热提取法的提取工艺过程，分别在沸水浴中处理1min、2min、4min、6min、8min、10min，从而确定适宜的热处理时间。响应面优化实验根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理，综合单因素影响试验结果，选取盐酸浓度、盐酸用量、丙酮浸提时间对天然色素提取影响显著的3个因素，在单因素试验基础上采用三因素三水平的响应面分析方法，因素与水平见表3.1，Box-BehnkenDesign试验设计表见表3.2。表3.1酸热法响应面试验因素水平表因素水平-101盐酸浓度（mol/L）0.20.51盐酸用量（mL）51015热处理时间（min）246表3.2Box-BehnkenDesign试验设计表试验号盐酸浓度（mol/L）盐酸用量（mL）热处理时间（min）色素产量(μg/g）10-112110310-140115-110600071-108-1-10900010000110-1-112-101130001401-115-10-116000171013.2.3蛹虫草菌丝体天然色素的检测标准曲线的绘制准确称取β－胡萝卜素对照品10.0mg置于100mL棕色容量瓶中，加氯仿20mL溶解，继续加氯仿至刻度，摇匀。准确量取10.00mL溶液置于100mL棕色容量瓶中加氯仿稀释至刻度，摇匀。分别吸取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00mL溶液置于25mL棕色容量瓶中加氯仿至刻度，以0．00mL为空白，在455nm的波长处测定吸收度。色素的检测提取色素之后，将提取液适当稀释，用分光光度计在475nm处测定吸光度。3.2.4蛹虫草子实体中天然色素的性质研究光照对天然色素稳定性的影响将天然色素提取液分别置于阳光直射、室内自然光和避光条件下保存24h、48h、72h，测定吸光度的变化。温度对天然色素稳定性的影响将天然色素提取液分别置于25、60、80、100℃下保存1h、2h、3h、4h，测定吸光度的变化。3.3结果与讨论3.3.1β－胡萝卜素标准曲线的绘制图3.2β－胡萝卜素标准曲线图3.2表示,在455nm处测吸光值，以β－胡萝卜素浓度（μg/mL）为横坐标，吸光值吸光度平均值为纵坐标，得线性回归方程为Y＝0.1672X+0.0021,相关系数r=0.9999。结果表明β－胡萝卜素在0.8μg/mL~4.0μg/mL范围内，吸收度值与浓度呈良好的线性关系。3.3.2蛹虫草子实体天然色素提取方法的比较提取方法的选择由图3.3可知，酸热法的提取效果是最好的，其主要原因可能是，酸热法使用了盐酸，而盐酸对细胞壁中某些紧密的结构具有强力疏松作用，在同时经过盐酸浸泡、沸水加热的工艺之后，细胞壁的结构被破坏，胞内的物质溶出。酸热法与研磨法、超声波法及微波法相比，最显著的优点是设备简单、成本低、能耗小。图3.3提取方法的比较浸提溶剂的选择图3.4不同浸提溶剂的选择由图3.4可知，丙酮的色素提取产量最高，石油醚的色素提取产量最低，分析其原因，丙酮是强极性有机溶剂，比弱极性有机溶剂如乙醚等提取色素产量更高。3.3.3酸热法提取蛹虫草子实体中天然色素的单因素分析盐酸浓度对蛹虫草子实体中天然色素提取率的影响图3.5盐酸浓度对色素产量的影响实验结果表明（如图3.5)，盐酸浓度在0.05～0.06mol/L范围内，随着盐酸浓度的降低，色素产量逐渐增大，0.05mol/L时色素产量最大。盐酸用量对蛹虫草子实体中天然色素提取率的影响图3.6盐酸用量对色素产量的影响实验结果表明（如图3.6），随着浓度的增大，色素产量逐渐降低，说明盐酸浓度过大对色素有一定的破坏作用；盐酸浓度太小，色素产量较低，说明破壁效果不明显。热处理时间对蛹虫草子实体中天然色素提取率的影响图3.7热处理时间对色素产量的影响实验结果表明（如图3.7），热处理时间在0～4min时，色素产量逐渐增加，4min时色素产量最大，热处理时间继续增加,色素产量开始降低。3.3.4响应面优化酸热法提取蛹虫草子实体中的天然色素响应面试验结果表3.3Box-BehnkenDesign试验设计结果试验号盐酸浓度（mol/L）盐酸用量（mL）热处理时间（min）色素产量(μg/g）10-1117432110952310-11009401120805-1105156000274671-108248-1-1050190002746100002745110-1-1149812-1015281300027461401-1156715-10-158916000274717101918采用DesignExpert7.0软件对表3.3试验数据进行回归分析，由此可求出影响因素的一次效应、二次效应及其交互效应的关联方程，对酸热提取法提取蛹虫草子实体中天然色素的影响因素进行更深入的研究和条件优化，并做出响应面图。多元回归拟合分析得到天然色素的色素产量与各因素变量的二次方程模型为：色素产量（ug/g）= 2746.00+196.2*A+68.50*B+75.75*C +28.50*A*B-7.50*A*C+67.00*B*C-1504.50*A2-543.50*B2-480.50*C回归方程方差分析回归方差分析见表3.4，用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著，模型的显著水平远远小于0.05，此时Quadratic回归方差模型极显著。从回归方程各项的方差分析结果还可以看出方程的失拟项较小，表明该方程对试验拟合情况好、误差小，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。从表3.6还可以看出,对色素产量影响的大小依次为盐酸浓度、热处理时间、盐酸用量。表3.4方差分析表方差来源平方和自由度均方f值p值显著性模型 1.309 1.4590.37<0.0001A-盐酸浓度（mol/L） 3.081 3.0819.160.0032**B-盐酸用量（ml/g）37538.00137538.002.330.1703C-热处理时间（min）45904.50145904.002.860.1349AB3249.0013249.000.200.6666AC225.001225.000.0140.9092BC17956.00117956.001.120.3257A29.5319.53592.81<0.0001**B21.2411.2477.36<0.0001**C29.7219.7260.470.0001总残差1.12716077.00失拟误差1.12337512.3375024.67<0.0001**纯误差2.0040.50总和1.3216注：**.P＜0.01，差异极显著；*.P＜0.05，差异显著。响应面曲面分析RSM方法的图形是特定的响应面(Y)与对应的因素X1、X2、X3构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，每个响应面对其中两个因素进行分析，另外一个因素固定在零水平。从中可以直观地反映各因素对响应值的影响，从试验所得的响应面分析图上可以找到它们在提取过程中的相互作用。回归优化响应面图分别见图3.8。盐酸浓度与盐酸用量对天然色素提取率影响的响应面和等高线图盐酸浓度与热处理时间对天然色素提取率影响的响应面和等高线图盐酸用量与热处理时间对天然色素提取率影响的响应面和等高线图图3.8图3.8直观地反映了各因素对响应值的影响，比较图中6个图可知：盐酸浓度对天然谁说的色素产量的影响最为显著，表现为曲线相对较陡；而盐酸用量、热处理时间表现为曲线较为平滑，随其数值的增加或减少，响应值变化较小。根据所得到的模型，可预测在稳定状态下的最优工艺条件为在室温条件下，盐酸浓度0.05mol/L,盐酸用量10mL，热处理时间5min。此条件下，天然色素的产量为2747.71μg/g。验证实验为了检验实验结果是否与真实情况相一致，根据上述结果进行近似验证实验，考虑到实际操作的便利，将最佳工艺条件修正为室温条件下，盐酸浓度0.,05mol/L，盐酸用量10mL，热处理时间5min,在此条件下进行3次平行实验天然色素的色素产量为2743.01μg/g。与理论预测值相比，其相对误差约为0.171%。而且重复性也很好，说明优化结果可靠。3.3.5蛹虫草子实体中天然色素的性质研究光照对天然色素稳定性的影响图3.9光照对天然色素稳定性的影响由图3.9可知，日光对类胡萝卜素有明显的破坏作用，而室内自然光及放置在暗处对天然色素的影响相对较小，所以用天然色素着色的食品在储存和运输过程中应尽量避免阳光直射，以保持食品色泽。温度对天然色素稳定性的影响图3.10温度对天然色素稳定性的影响由图3.10可知，天然色素随着温度的升高，降解速度加快，温度对天然色素有一定的破坏作用。

第四章结论与展望4.1结论(1)本实验以用蛹虫草子实体中天然色素的提取率为标准，比较了四种提取方法，其中因酸热提取法操作简易，条件易控制，结果精准，提取率最高，成为最适合的提取方法。提取后利用紫外-可见分光光度法检测天然色素。(2)在单因素试验的基础上，经响应面优化实验确定了提取用虫草子实体中天然色素的最佳工艺条件为：盐酸浓度0.05mol/L,盐酸用量10mL，热处理时间5min,并以丙酮为提取溶剂，用量为10mL。在此条件下，天然色素的提取率为2747.71μg/g。（3）对于天然色素的稳定性，日光对天然色素有明显的破坏作用，温度升高对天然色素有一定的破坏作用。4.2展望综合蛹虫草子实体中天然色素的上述药理作用，蛹虫草子实体不仅有抗肿瘤、降血糖、抗衰老、提高免疫力的作用，还能够抗炎及治疗肝的病毒性感染。本实验取得了一些成果，但仍然有需要提高和完善的地方，比如在检测方法上，分光光度法检测蛹虫草子实体天然色素含量存在一定的缺陷，因此还需要进一步摸索更准确的蛹虫草子实体天然色素含量测定方法；对于工业化生产中蛹虫草子实体天然色素的提纯，还需要寻找更经济的方法和材料等。本实验来源于社会的需求，在技术上已经具有一定的基础，随着人工培养蛹虫草产业规模的不断扩大，作为培养附属产物的固体培养基的产出量也会越来越大。因此该研究课题具有良好的开发价值，其产业化必然会带来良好的社会效益和环境效益。随着对蛹虫草子实体天然色素的生物活性研究进一步深入，天然色素的生物活性机理及功效因子将会更加明确，它的应用领域也必将会更加拓宽。但是，由于多天然色素本身的结构很复杂，种类繁多，其结构的测定和分离纯化有较大的难度，有些子实体天然色素的药理作用还与许多其它因素有关，给色素的研究及应用带来许多挑战，这需要相关行业的人士来共同应对。近些年，人们的健康保健意识逐渐增强。天然色素作为保健食品的成分也将会成为人们研究的重点。我国天然色素资源丰富，应用历史悠久，具有巨大的开发前景。通过对蛹虫草子实体天然色素的构效和量效关系的研究，人们将会利用我国丰富的多糖资源，生产出高附加值的保健食品，以提高人民身体素质、增进健康、提高生活质量。

致谢在这里首先要感谢我的导师王志兵老师。王志兵老师平日里工作繁多，但在我做毕业设计的每个阶段，论文从选题、构思、资料收集到最后定稿的各个环节给予细心的指引和教导，使我对于蛹虫草子实体天然色素的提取有了深刻的认识，并最终得以完成毕业论文。我的设计较为复杂烦琐，但是王老师仍然细心地纠正论文中的错误。除了敬佩王老师的专业水平外，王老师严谨的治学态度、丰富渊博的知识、敏锐的学术思维、精益求精的工作态度、积极进取的科研精神以及诲人不倦的师者风范是我毕业生的学习楷模，并将积极影响我今后的学习和工作。同时也非常感谢给予我支持的邱芳萍老师为我的试验提供了实验场所和仪器设备。论文是在长春工业大学食品功能研究所完成的，在整个设计和实施过程中，学长学姐对论文的开展提出了许多宝贵的意见和建议，使我受益匪浅。其次还要感谢大学四年来所有的老师，为我们打下牢固专业知识的基础；同时还要感谢所有的同学们，正是因为有了你们的支持和鼓励。此次毕业设计才会顺利完成。然后感谢长春工业大学四年来对我的大力栽培。在四年的大学生涯里，还得到众多老师的关心支持和帮助，在此谨向老师们致以衷心的感谢和崇高的敬意。最后，我要向在百忙之中抽时间对本文进行审阅、评议和参加本人论文答辩的各位老师表示感谢。参考文献[1]林群英,宋斌,李泰辉等.蛹虫草研究进展[J].微生物学通报，2006,33（4）:154-157[2]陈顺志.冬虫夏草和北虫草研究进展[J].中国生化药物杂志,1995,5（16）：242-245[3]刘刚.国内蛹虫草研究现状[J].中国中医药信息杂志,1994,1（1）：23-24[4]贡成良，吴卫东，徐承智等.家蚕蛹虫草的化学成份分析[J].蚕业科学，2002，28（2）：168-172[5]蔡友华,刘学铭.虫草素的研究与开发进展[J].中草药,2007,8（38）：1269-1272[6]丁尚萍,马力,魏书堂等.虫草素诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对端粒酶活性影响的研究[J].中华肿瘤防治杂志,2008,2（15）：109-113[7]施英,吴娱明,廖森泰等.蛹虫草药理作用研究进展[J].广东蚕业,40(3)：43-45[8]黎颖.甘露醇的性质、生产与发展建议[J].广西化学,1999,4（28）：30-32[9]张建军,徐洪利,赵斐等.虫草多糖结构及免疫功能研究进展[J].安徽农业科学,2009.37（26）：12542－12544.12594[10]吴晓忠,罗素琴,刘乐乐等.中药多糖抗肿瘤作用的研究进展[J].内蒙古医学院学报,2009,1（31）：81-83[11]李连德,李增智,樊美珍等.虫草多糖研究进展（综述）[J].安徽农业大学学报,2000,27（4）：413-416[12]张欣.超氧化物歧化酶（SOD）及其研究进展[J].内蒙古石油化工,2010,（16）:14-15[13]赵勇.超氧化物歧化酶（SOD）的应用研究进展[J].攀枝花学院学报,2007,6（24）：9-11[14]迟乃玉,张庆芳,刘长江等.SOD的化学特性及其应用[J].沈阳农业大学学报,1990-04,30（2）：171-175[15]邓玉清,王纪,虞龙等.微生物麦角甾醇的研究进展[J].微生物学杂志,2001,3（21）：45-47[16]高虹,史德芳,杨德等.巴西菇麦角甾醇抗肿瘤活性及作用机理初探[J].中国食用菌,2011,30（6）：35-39[17]徐廷万,王丽波,段文健等.人工蛹虫草胞外多糖对受抑制的免疫功能的影响及抗疲劳作用[J].中药药理与临床,2002，18（6）：17-18[18]戴瑛,张斌,周勇等.蛹虫草提取物对内毒素引起小鼠急性肺损伤的保护作用[J].研究原著.2004年4月,9（4）：386-388[19]刘海燕,魏本征.柞蚕蛹虫草对小鼠非特异性免疫功能影响的研究[J]山东中医药大学学报.2004,4（28）：304-305[20]孙科峰,戴兵,刘珂等.人工蛹虫草子实体对荷瘤小鼠免疫功能的影响[J]中国医药学报.1990[21]汤新强,杨彤,李传勋等.人工蛹虫草胞外多糖对卡铂抗癌和骨髓抑制作用的影响[J].中医药学刊.2004,3（22）：403-406[22]宾文,宋丽艳,于荣敏等.人工培养蛹虫草多糖的抗炎及免疫作用研究[J].时珍国医国药.2003,1（14）：1-2[23]陈桂宝,罗梅初,刘实晶等.蛹虫草的药理作用研究[J].中草药.1997,7（28）：415-417[24]陈敬民,李友娣,洪庚辛等.蛹虫草的镇静催眠作用[J]中药药理与临床.1997,13（6）：44-45[25]王琦,梅宁,梅汝鸿.益微超氧化物歧化酶（SOD）研发历程[26]赵鹏,杨俊峰,李彬,等.蛹虫草菌丝体降血脂作用的动物试验研究[J].中国食品卫生杂志,2004,16(5):434-436[27]李崇英,王安,李涛等.食用天然色素的纯化与研究进展[J].中国调味品.2007,9:19-24[28]左玉.天然色素研究与应用[J].粮食与油脂,2006,9：46-48[29]杨丽华,陈晓光.天然色素的资源开发和应用研究进展[J].中国食物与营养.2010,6：13-16[30]李福枝,刘飞,曾晓希等.天然类胡萝卜素的研究进展[J].食品工业科技,2007,9（28）：227-232[31]徐清海,明霞.天然色素的提取及其生理功能[J].应用化学.2005,5（34）：268-271[32]毛利娟,王永禄,李学明等.共研磨法提高兰索拉唑的溶出度[J].中国医药工业杂志.2011,42（8）：595-600[33]张志军,江晓路,牟海津等.蛹虫草类胡萝卜素提取工艺的研究[J].食品科技.2006：99-103[34]郭鹏飞,胡长鹰.番木瓜中类胡萝卜素的提取[J].中国调味品.2009,34（1）：95-99[35]王志祥,李红娟,万水昌等.微波萃取技术及其在中药有效成分提取中的应用[J].时珍国医国药.2007,5（18）：1245-1247[36]赵大球,薛银芳,周春华等.植物类胡萝卜素分析方法研究进展[J].北方园艺.2011（02）：195-199[37]钟玲,尹蓉莉,张仲林等.超声提取技术在中药提取中的研究进展[J].西南军医.2007,6（9）：84-87[38]姬小明,邵惠芳,刘金霞等.类胡萝卜素的提取及分离方法研究进展[J].河南科学.2008,11（26）：1337-1339[39]倪志伟,李军玲.超临界CO2萃取技术在天然产物提取中的应用[J].安徽农业科学.2009，36（14）：5715-5716[40]杨忠林,邵友元,姚创等.超临界CO2萃取技术在天然产物提取中的应用[J].广东化工.2009,,3（36）：26-29[41]姚成立,毕建洪.天然色素的提取和研究进展[J].安徽化工.2007,3（33）：1-4[42]杨万政,曹秀君,李金淑等.紫外分光光度法测定沙棘油中总类胡萝卜素方法改进[J].中央民族大学学报.2009,3（18）：5-8[43]杨虹琦,岳骞,黎娟等.高效液相色谱法测定烤烟类胡萝卜素[J].湖南农业大学学报（自然科学版）.2006,6（32）[44]赵明波,邓秀兰,王亚玲等.高效液相色谱法测定红花中的羟基红花黄色素A[J].色谱.2003,6（21）：593-595[45]彭光华,李忠,张声华等.薄层色谱法分离鉴定枸杞子中的类胡萝卜素[J].1998,1（20）：76-78[46]果秀敏,崔彤宇,牛延锋等.薄层色谱法分离菠菜叶片中色素的研究[J].河北农业大学学报,2000,2（23）：101-104基于C8051F单片机直流电动机反馈控制系统的设计与研究基于单片机的嵌入式Web服务器的研究MOTOROLA单片机MC68HC（8）05PV8/A内嵌EEPROM的工艺和制程方法及对良率的影响研究基于模糊控制的电阻钎焊单片机温度控制系统的研制基于MCS-51系列单片机的通用控制模块的研究基于单片机实现的供暖系统最佳启停自校正（STR）调节器单片机控制的二级倒立摆系统的研究基于增强型51系列单片机的TCP/IP协议栈的实现基于单片机的蓄电池自动监测系统基于32位嵌入式单片机系统的图像采集与处理技术的研究基于单片机的作物营养诊断专家系统的研究基于单片机的交流伺服电机运动控制系统研究与开发基于单片机的泵管内壁硬度测试仪的研制基于单片机的自动找平控制系统研究基于C8051F040单片机的嵌入式系统开发基于单片机的液压动力系统状态监测仪开发模糊Smith智能控制方法的研究及其单片机实现一种基于单片机的轴快流CO〈,2〉激光器的手持控制面板的研制基于双单片机冲床数控系统的研究基于CYGNAL单片机的在线间歇式浊度仪的研制基于单片机的喷油泵试验台控制器的研制基于单片机的软起动器的研究和设计基于单片机控制的高速快走丝电火花线切割机床短循环走丝方式研究基于单片机的机电产品控制系统开发基于PIC单片机的智能手机充电器基于单片机的实时内核设计及其应用研究基于单片机的远程抄表系统的设计与研究基于单片机的烟气二氧化硫浓度检测仪的研制基于微型光谱仪的单片机系统单片机系统软件构件开发的技术研究基于单片机的液体点滴速度自动检测仪的研制基于单片机系统的多功能温度测量仪的研制基于PIC单片机的电能采集终端的设计和应用基于单片机的光纤光栅解调仪的研制气压式线性摩擦焊机单片机控制系统的研制基于单片机的数字磁通门传感器基于单片机的旋转变压器-数字转换器的研究基于单片机的光纤Bragg光栅解调系统的研究单片机控制的便携式多功能乳腺治疗仪的研制基于C8051F020单片机的多生理信号检测仪基于单片机的电机运动控制系统设计Pico专用单片机核的可测性设计研究基于MCS-51单片机的热量计基于双单片机的智能遥测微型气象站MCS-51单片机构建机器人的实践研究基于单片机的轮轨力检测基于单片机的GPS定位仪的研究与实现基于单片机的电液伺服控制系统用于单片机系统的MMC卡文件系统研制基于单片机的时控和计数系统性能优化的研究基于单片机和CPLD的粗光栅位移测量系统研究单片机控制的后备式方波UPS提升高职学生单片机应用能力的探究基于单片机控制的自动低频减载装置研究基于单片机控制的水下焊接电源的研究基于单片机的多通道数据采集系统基于uPSD3234单片机的氚表面污染测量仪的研制基于单片机的红外测油仪的研究96系列单片机仿真器研究与设计基于单片机的单晶金刚石刀具刃磨设备的数控改造基于单片机的温度智能控制系统的设计与实现HYPERLINK"/de