现代生物技术概论

/生物技术被世界各国视为一项高新技术，它广泛应用于医药卫生、农林牧渔、轻工、食品、化工和能源等领域，促进传统产业的技术改造和新兴产业的形成，对人类社会生活将产生深远的、革命性的影响.七大高科技：生物，航天,信息,激光,自动化，新能源，新材料生物技术概念：生物技术（bｉoteｃhnolｏgy)，是指人们以现代生命科学为基础，结合其他基础科学的科学原理，采用先进的科学技术手段,按照预先的设计改造生物体或加工生物原料,为人类生产出所需产品或达到某种目的。生物技术的种类：生物技术不完全是一门新兴学科，包括传统生物技术（指旧有的制造酱、酒、面包、奶酪、酸奶及其它食品的传统工艺)和现代生物技术（包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程、蛋白质工程)两部分。基因工程是2０世纪７０年代随着DＮＡ重组技术的发展应运而生的一门新技术。是指在基因水平上操作并改变生物遗传特性的技术,也称为DNA重组技术。细胞工程是指以细胞为基本单位,在体外条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种的目的，加速繁育动植物个体，或获得某种有用物质的技术.动物细胞工程(胚胎移植细胞融合细胞培养单克隆抗体,核移植）酶工程是利用酶、细胞器或细胞所具有的特异催化功能或对酶进行修饰改造,并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的技术。发酵工程是指利用包括工程微生物在内的某些微生物或动植物细胞及其特定功能,通过现代工程技术手段生产各种特定的有用物质,或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种技术。蛋白质工程是以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系为基础，通过有控制的修饰和合成，对现有蛋白质加以定向改造和设计,构建并最终生产出性能比自然界存在的蛋白质更加优良、更符合人类需要的新型蛋白质。不同生物技术间的相互关系微生物工程菌发酵工程基因工程蛋白质或酶蛋白质工程或酶工程产品动、植物个体或细胞细胞工程优良动、植物品系生物技术所涉及的学科现代生物技术是所有自然科学领域中涵盖范围最广的学科之一.它以包括分子生物学、细胞生物学、微生物学、免疫生物学、人体生理学、动物生理学、植物生理学、微生物生理学、生物化学、生物物理学、遗传学等几乎所有生物科学的次级学科为支撑，又结合了诸如化学、化学工程学、数学、微电子技术、计算机科学、信息学等生物学领域之外的尖端基础学科,从而形成一门多学科互相渗透的综合性学科。其中又以生命科学领域的重大理论和技术的突破为基础。生物技术所涉及的行业种类行业种类经营范围疾病治疗用于控制人类疾病的医药产品及技术，包括抗生素、生物药品、基因治疗、干细胞利用等诊断临床检测与诊断，食品、环境与农业检测农业、林业与园艺新的农作物或动物，肥料,生物农药食品扩大食品、饮料及营养素的来源环境废物处理、生物净化、环境治理能源能源的开采、新能源的开发化学品酶、DNA／ＲNA及特殊化学品设备由生物技术生产的金属、生物反应器、计算机芯片及生物技术使用的设备等传统生物技术的产生：应该说从史前时代起就一直为人们所开发和利用,以造福人类。在石器时代后期,我国人民就会利用谷物造酒，这是最早的发酵技术。◆古老的酿造技术◆巴斯德的发现理论背景：现代生物技术是以20世纪７０年代DNA重组技术的建立为标志的。◆1９４4年Averｙ等阐明了DNA是遗传信息的携带者◆19５3年Ｗatｓon&Crｉcｋ发现DNA双螺旋结构开创分子生物学◆196１年Nｉrenbｅｒｇ破译了遗传密码,揭开了ＤNA编码的遗传信息是如何传递给蛋白质这秘密现代生物技术的诞生1９73年加州大学的Bｏyer等实现了细菌间遗传物质的人工重组，转入一个抗药基因,使大肠杆菌获得了抗药性,第一例DNA重组技术成功1978年Ｇeneｔｅch公司和洛衫矶Ｈｏｐｅ市医学中心将具有明显医药实用价值的蛋白质胰岛素基因导入到E．ｃoli中表达成功19８0转基因动物首获成功，美国人得到转人生长激素基因的超级鼠1983年美国人和比利时人将外源基因引入植物中,并稳定遗传1997年第一只克隆羊在英国Ｒosｓlyn研究所诞生生物技术对经济社会发展的影响:生物技术的发展将越来越深刻地影响着世界经济、军事和社会发展的进程。１改善农业生产，解决食品短缺:提高农作物的产量及品质(培育抗逆的作物优良品系，植物种苗的工厂化生产,提高作物品质,生物固氮,减少化肥使用量）发展畜牧业生产（动物的大量快速无性繁殖，培育动物的优良品系）2提高生命质量,延长人类寿命(开发制造贵重的新型药品,疾病的预防和诊断，基因治疗，人类基因组计划）3解决能源危机、治理环境污染：解决能源危机生物能源将是最有希望的新能源之一,而其中又以乙醇最有希望成为新的替代能源。保护环境人们可以利用微生物净化有毒的化合物，降解石油污染，清除有毒气体和恶臭物质，综合利用废水和废渣，处理有毒金属,达到净化环境、保护环境、废物利用并获得新的产品的目的。4制造工业原料、生产贵重金属:制造工业原料,利用微生物在生长过程中积累的代谢产物,生产食品工业原料，种类繁多.生产贵重金属，利用微生物的浸矿技术对废渣矿、贫矿、尾矿、废矿进行提炼。5生物技术的安全及其对伦理、道德、法律的影响:１基因工程对微生物的改造是否会产生某种有致病性的微生物，这些微生物都带有特殊的致病基因，如果它们从实验室逸出并且扩散，有可能造成类似鼠疫那样的可怕疾病的流行。2转基因作物及食品的生产和销售,是否对人类和环境造成长期的影响，擅自改变植物基因是否可能引起一些难以预料的危险。3分子克隆技术在人类身上的应用可能造成巨大的社会问题，并对人类自身的进化产生影响；而应用在其他生物上同样具有危险性，因为所创造出的新物种有可能具有极强的破坏力而引发一场浩劫。４生物技术的发展将不可避免地推动生物武器的研制与发展，使笼罩在人类头上的生存阴影越来越大。5动物克隆技术的建立,如果被某些人用来制造克隆人、超人，将可能破坏整个人类社会的和平。第二章基因工程基础学习内容１了解核酸和蛋白质的结构和功能2了解基因工程的四大要素3了解基因工程的原理和过程4了解克隆子的筛选和鉴定5了解基因工程的应用６了解基因工程产品和食品可能潜在的风险一、核酸遗传信息的贮存和传递者１。核酸的化学结构2.核酸的分类核酸分为：脱氧核糖核酸(DeｏxｙribonｕcleiｃacｉdDNA)，ＤNA含A,T，G，C四种碱基和脱氧核糖、核糖核酸（RibｏｎucｌeｉcacidRＮA)，RNA含A,U,G，C四种碱基和核糖3.DＮA的结构（1）ＤＮA的碱基组成（1）组成A＋G=Ｃ+T，G=Ｃ，Ａ=T同种生物的不同组织的碱基组成相同,不同生物的同种组织的碱基组成不同年龄,营养，环境不影响碱基组成(2）ＤNＡ的书写方式如:5'－GＡTCAＴAATＴＣ-3’、3’—CTAGTATＴAＡG—5’可写成：5'—GAＴCAＴAATTC—3’(3）ＤNA双链的存在形式：几乎所有的真核生物的ＤNA都以线形存在,大部分原核生物的染色体ＤＮA和全部线粒体DNA以及细菌的质粒ＤＮA是环状ＤＮＡ分子。病毒和噬菌体中有的含线形ＤＮA，有的含环状DNA。(４）DNＡ双链的基本特点ＤＮA分子是由两条互相平行的脱氧核甘酸长链盘旋而成。ＤＮＡ分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本的骨架,碱基排在内侧。两条链上的碱基通过氢键结合,形成碱基对，它们的组成有一定的规律。DＮＡ的一级结构四种核苷酸的连接及其排列顺序DNＡ的二级结构（双螺旋）指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构DNA的高级结构核小体、30nm纤维、3００nm棒、染色体DNA分子结构特征１原核生物结构简炼,序列利用率高，不转录序列<５%不编码的序列也为调控序列２原核生物DNA分子中有基因重叠现象３真核生物基因组大，主要是非编码的DＮＡ，可以是单一序列或重复序列。4真核基因具有不连续性(断裂基因）５原核生物DＮＡ分子中有基因重叠现象６真核生DN分子中普遍存在插入序列7编码的核苷酸顺序就携带着遗传信息）4。RNＡ的结构组成上与DNA相似，但为核糖核酸，碱基为A，U，G，C.单链,不存在碱基比例关系。局部能形成碱基对，出现双螺旋,不配对区域形成突起（环）RNA的分类信使RNA（mRＮA） -转录遗传信息 ﻩ ﻩﻩ ﻩﻩﻩ转运RNA（tＲNA） —运载氨基酸 ﻩ ﻩ ﻩ核糖体ＲNＡ（rRNA）－蛋白质合成ｍＲＮA的特点（１线形单链结构，携带DＮA信息,作为指导合成蛋白质的模板２真核生物5ˊ-端有帽子结构，免遭核酸酶的破坏3有非翻译序列4真核生物3ˊ-－poｌyA结构,提高mRNA在细胞质中的稳定性)tRNＡ的特点1.四环四臂2.氨基酸臂与反密码臂是识别氨基酸与密码的重要结构rRNA的特点（1是细胞内含量最多(8２％)，也是质量最大的RNA２与蛋白结合形成核糖体参与蛋白合成３不具备单独功能）蛋白合成过程5.DNA分子的功能DNA复制的特点:1．半保留复制：DＮA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代ＤNＡ,每个子代DNＡ中都含有一股亲代DＮA链,这种现象称为DＮA的半保留复制.DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meｓeｌｓoｎ和F.Sｔａhl所完成的实验所证明。2．有一定的复制起始点:DNＡ在复制时,需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段,即复制起始点（复制子)。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。3。需要引物（primｅr）：DNA聚合酶必须以一段具有3＇端自由羟基(3’－OH）的RNA作为引物，才能开始聚合子代DＮＡ链。RＮA引物的大小，在原核生物中通常为50~1０0个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。4.双向复制:ＤNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制。5．半不连续复制：由于DNA聚合酶只能以5’→3'方向聚合子代DNA链，因此两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在聚合时基本上是连续进行的，这一条链被称为领头链（leaｄingstraｎd）。而以５’→3’方向的亲代DＮA链为模板的子代链在聚合时则是不连续的,这条链被称为随从链（laggingｓｔraｎd)。ＤNＡ在复制时,由随从链所形成的一些子代DNＡ短链称为冈崎片段（Okazaｋｉfrａｇｍｅnt）。冈崎片段的大小,在原核生物中约为１00０～20０0个核苷酸，而在真核生物中约为1００个核苷酸。DNA复制所需的蛋白质和酶酶和蛋白质作用拓扑异构酶帮助解开复制叉前后的超螺旋结构ＤNA解旋酶解开螺旋Rep蛋白帮助解开双螺旋结构引物合成酶合成RＮＡ引物单链结合蛋白稳定单连区DNA聚合酶Ⅰ消除引物,填满裂缝DNＡ聚合酶Ⅲ合成DＮADNA连接酶连接DNA末端携带遗传信息DＮA的转录转录包括:转录启动子、转录区转录启动子：是５¡¯端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确相结合并具有转录起始的特异性原核生物:-1０区（TATＡAＴ)、－35区（ＴTGＡCA）真核生物：－２5——-30区（TATA）、—7０—－—8０区（CAAT）、－80-—－10０区（GC）转录区:从转录RNA的起录点开始，包括基因编码区和转录终止子二、蛋白质(一)蛋白质的化学组成蛋白质含有：碳、氢、氧、氮、硫。蛋白质水解可成为肽，肽进一步水解为氨基酸,它是组成蛋白质的最小单位。(二)蛋白质的构件分子(氨基酸）氨基酸的化学通式Ｒ不同,组成的氨基酸就不同氨基酸的分类对于20种标准的氨基酸,按照侧链化学性质的不同，可以分为以下三组:疏水性的氨基酸(Ala、Vaｌ、Lｅu、Ｉle、Phe、Ｐro和Ｍet）带电氨基酸（Arｇ、Lys(+）和Ａsp、Gｌｕ(－））亲水性氨基酸(Ｓeｒ、Tｈr、Cys、Asn、Ｇln、His、Tyr、Tｒp）肽键、肽和多肽不同数目的氨基酸以肽键顺序相连,形成链状分子，即是肽或多肽,通常分子量在15０0以下的为肽,在１500以上的为多肽，—NH2端为N末端写在左，另一端为C末端,写在右(三)蛋白质的结构层次蛋白质一级结构肽键肽链氨基酸排列顺序等一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础，但不是决定蛋白质空间构象的唯一因素.二级结构肽链的主链在空间的走向α－螺旋β—折叠β—转角无规卷曲无序结构三级结构在二级结构基础上的肽链再折叠形成的构象.亲水基位球体表面,疏水基位于球体内部四级结构组成蛋白质的多条肽链在天然构象空间上的排列方式，多以弱键互相连接.疏水力、氢键、盐键.每条肽链本身具有一定的三级结构，就是蛋白质分子的亚基蛋白质各级结构蛋白质的一级结构是它的氨基酸序列，蛋白质的二级结构是由氢键导致的肽链卷曲与折叠，蛋白质的三级结构是多肽链自然形成的三维结构,蛋白质的四级结构是亚基的空间排列(四)蛋白质的空间作用力氢键盐键(离子键)疏水键范德华力二硫键脂键(五）蛋白质结构与功能的关系一级结构与功能的关系序列分析空间结构与功能的关系 结构分析蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变,仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集,常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等.(六）蛋白质的生物合成核糖体是蛋白质合成的场所,mＲＮA是蛋白质合成的模板,tRNA是模板与氨基酸之间的接合体。蛋白质的合成步骤翻译的起始——核糖体与mＲNA结合并与氨基酰—tRNA生成起始复合物.肽链的延伸——核糖体沿mRNA５¡¯端向3¡¯端移动,导致从Ｎ端向C端的多肽合成。肽链的终止以及肽链的释放——核糖体从mRＮＡ上解离,准备新一轮合成反应三、基因与基因表达的一般概念基因作为唯一能够自主复制、永久存在的单位，其生理学功能以蛋白质形式得到表达。DＮA序列是遗传信息的贮存者，它通过自主复制得到永存,并通过转录生成mＲNＡ,翻译生成蛋白质的过程控制所有生命现象。

基因表达包括转录（ｔraｎscriptiｏｎ）和翻译(traｎslatioｎ）两个阶段。转录是指拷贝出一条与ＤNA链序列完全相同（除了T→Ｕ之外)的RNA单链的过程,是基因表达的核心步骤。翻译是指以新生的mＲNA为模板，把核苷酸三联子遗传密码翻译成氨基酸序列、合成蛋白质多肽链的过程，是基因表达的最终目的。基因的概念基因是一段有功能的DNA片段基因位于染色体上基因决定生物性状、发育、代谢和免疫状态等历史篇马凡氏综合征（mａｒfan'ｓsyndｒｏme）又名蜘蛛指（趾）综合征，属于一种先天性遗传性结缔组织疾病,为常染色体显性遗传，有家族史。主要表现为骨骼、眼和心血管系统受累。心血管方面表现为大动脉中层弹力纤维发育不全，主动脉或腹总主动脉扩张，形成主动脉瘤或腹总主动脉瘤.主动脉扩张到一定程度以后，将造成主动脉大破裂死亡。发病率约0。04‰～0.1‰。199１年７月,三个研究小组同时报道发现了马方综合征的致病基因和致病机理。他们使用了多种细胞染色和基因作图技术，发现致病基因编码一种原纤蛋白(fibriｌlm)，而原纤蛋白正是晶状体和大动脉壁的组成成分。马方综合征在其发病的严重性上存在差异一个重要的原因是突变可以在该基因的很多位点上发生,而其中一些位点上的突变对基因所编码蛋白的损害会比另一些位点上的突变更大。第二个主要原因是组成人体整个基因组的大约35，000对基因中只有一对发生突变才会导致马方综合征。其他基因可以减弱或者加剧原纤蛋白基因突变的影响.面临的问题伦理问题，各种反对声音；技术障碍马方综合征基因的研究ＤＮA提取技术的完善；孟德尔（1822—1884），奥国人，遗传学的奠基人。21岁起做修道士,2９岁起进修自然科学和数学。主要工作：１85６-186４经过８年的杂交试验，1865年发表了《植物杂交试验》的论文。6２岁时带着对遗传学无限的眷恋，回归了无机世界。主要贡献有：（1)、提出了遗传单位是遗传因子（现代遗传学上确定为基因)；（2）、发现了两大遗传规律：基因的分离定律和基因的自由组合定律。直到1900年,孟德尔定律重新被欧洲的三位科学家发现，遗传学就同这个“再发现”一起诞生了!对分离现象的解释（假说)1、生物的性状由遗传因子决定。决定显性性状的为显性遗传因子、决定隐性性状的为隐性遗传因子。2、体细胞中遗传因子成对存在。纯种高茎的遗传因子为ＤＤ，纯种矮茎的为dd，F１为Dｄ。3、生物体形成生殖细胞——配子时，成对的遗传因子彼此分离，分别进入不同的配子中。4、受精时，雌雄配子随机结合,合子中遗传因子又恢复成对。卟啉病是由于血红素生物合成途径中共同作用的6种酶中的一个缺失而引起的一组疾病，可分为6种，急性间歇性卟啉病就是其中的一种.血红素是血红蛋白的核心，血红蛋白是红细胞的重要组成成分，红细胞负责人体中从肺部向组织细胞运输氧。这种疾病是显性遗传的,X—连锁基因孟德尔明确地描述了基因遗传三种经典模式中的两种—显性遗传和隐性遗传。人们又花了大约50年的时间才弄清楚第三种模式—伴性遗传或X-连锁遗传的科学原理。如果一位妇女遗传了一条携带有隐性致病基因的X染色体,那么几乎可以肯定的是她另一条X染色体上的等位基因会阻止这个致病基因的表达，但如果一位男性遗传了一条携带有致病基因的X染色体，他的Ｙ染色体上没有相应的基因可以抵消致病基因的表达,他就会发病.血友病是一种常见的严重凝血障碍性疾病,发病率约为1/１0０0０。像大多数遗传疾病一样,血友病最糟糕的是在病人的一个基因上可能会出现几百种不同的突变.根据突变的不同程度，血友病可分为轻度、中度和重度：轻度血友病患者只有在受到重伤后才有严重出血的危险;中度血友病患者会由微小的伤口而引发严重出血;重度血友病患者经常会自发性地关节出血，这在以前还会引发严重的骨骼问题.微生物工程目前可以生产凝血因子VIIＩ。遗传上关系更近的结合（我们称之为乱伦)的结果是后代拥有更高比例的相同等位基因。我们每个人一定携带一些等位基因，当它们单个出现时没有什么风险，但当它们配对时就会造成严重的后果。每个人都携带４～5个致死基因。任何特定遗传致死基因的单个拷贝不表达出疾病的原因很简单，因为这个拷贝所在的一对等位基因中,另一个“正常”拷贝所编码的蛋白质足以抵消这个不正常蛋白质所造成的缺陷。表亲婚配的子女所拥有的一套基因来自他们父母极其相似的两个基因组(一套完整的基因）.如果这对表兄妹的一个共同祖先携带了有害变异，那么从统计学上讲他们都携带这个拷贝的可能性要比非近亲大得多。因此，他们的子女遗传获得这个“坏”基因的成对拷贝的可能性也比非近亲婚配子女大得多。1９96年,纽约小组成功地克隆了致密性骨发育不全的致病基因，说明了这种遗传疾病是由编码组织蛋白酶K的基因缺陷引起的。这个蛋白质的功能是服务于破骨细胞的，破骨细胞主要负责溶蚀、重塑骨骼（尤其是在骨生长时）.患者的破骨细胞可以完成溶蚀任务，但由于他们的组织蛋白酶K不能正常工作,所以破骨细胞不能继续完成它的任务。４.遗骸——ＤNA与尸骨负面影响社会上就出现了一股强大的趋势要将在博物馆中保存了10０年或更久的遗骸交还给原住民重新埋葬.决定退还遗骸的部分原因是殖民时期统治者对原住民犯下了骇人的罪行，殖民者曾错误地认为澳大利亚土著居民是一种大猿.司法篇法庭上的DＮＡ革命5。DNA侦探——新的DNA证据目前，由于发现的DNA多态位点越来越多,ＤNA分析技术越来越简便、快速，世界上有120多个国家和地区已应用DＮA分析技术办案，解决刑事(如杀人、强奸）、民事(亲子鉴定）纠纷问题,DNA多态性分析的个人识别能力可以与人类指纹技术相媲美，个人同一认定精确度已达到９9．999９99%以上,否定率则为100％;亲子鉴定中肯定生物学父子关系概率基木上可达99．9９％以上。因此，DＮA检验已成为各类刑事、民事案件最有价值的检验技术之一，被国际社会普遍誉为“当代社会的科技福尔摩斯"美国刑事法庭接受DＮA证据的历程全面接受阶段怀疑拒绝阶段理性接受阶段STR（短串联重复序列）SＴR(微卫星ＤNA）一种简单串联重复DNA序列。其重复单位为1～6个核苷酸，由1０～50个重复单位串联组成。在整个基因组中分布广且密度高。例如ＣACＡCACAＣA是5个二核苷酸CＡ的重复。在猫、人类以及其他高等生物中，宽阔的DNA“高速公路”上总有许多“路段”（串）不编码蛋白质,但其中含有STＲ。STR基因座变异极大。在一个基因座上，你可能含有9个CA，你的邻居可能有１２个CＡ,而另一个人又可能只有7个ＣA。基于STR长度的变异，两个样本差异的表示方法已经建立起来，因而这种差异为我们提供了鉴定两个样本是否出自同一个体的途径。因为染色体上有很多不同的STR基因座，所以我们可以用同一套SＴR去确定两个样本是否来源相同.已广泛应用于法医学个体识别和亲子鉴定等领域.目前已有一套人的ＳTR基因座（１3个）以用于比对人类样品。除了同卵双生子，两个随机抽取的人在5个基因座上具有相同STＲ的几率近乎为零。一般来说，如果两个样本在目前用于人类鉴定的13个基因座中有３个相匹配，那么它们在其他基因座上相匹配的可能性会很大。相反，如果两个样本没有一个基因座上的SＴR数目相同，则几乎可以肯定它们不是出自同一个体。乘积法则乘积法则假设从被检测的每一个DNA基因座获得的结果确实独立于其他基因座的结果。我们就可以计算每个基因座随机匹配的概率并将它们相乘。应用乘积法则之后，两个DNＡ样本仅靠运气匹配在一起的可能性马上就会变得很小，所以比对两个样本所下的结论会变得非常之有力.从理论上讲，鉴定时检测分析的DNA基因座数量越多,鉴定结论的准确性越高，发生偶然巧合的可能性就越低。PCR技术2０世纪８0年代初期，PCＲ是由一位勇于创新的年轻分子生物学家穆利斯在加利福尼亚西特斯生物技术公司工作期间研究出来的。穆利斯认使用一个极其简单的方法，即利用为人熟知且能通过商业途径获得的酶来扩增任何ＤNＡ样本，无论这个样本有多小都能被扩增到我们所需要的量。该技术获得１992年诺贝尔奖，它为癌症诊断和亲子鉴定翻开了新的一页,有力地推动了我们发现和克隆人类基因的进程。PCＲ涉及了一系列连续的反应,并且要一遍遍地重复。首先，给感兴趣的ＤNA加温，使其变性后导致双螺旋解开成为单链.接着，已知结构的短片段单链DNＡ与靶ＤNA的两端化学连接。如果能看见其过程，就会发现这个时候DNA的两端都是双链的,其余的大部分长度还是单链的。最后一步是向混合液中加入DNA聚合酶和组成DＮA的４种碱基。聚合酶识别双链的末端，在那里开始合成与单链互补的DNＡ链直到延伸到另一端的双链区。第一个循环（耗时几分钟)结束后，原来的DNA含量增加一倍。每经过一个循环DNA含量就增加一倍，如果20个循环下来,原来的DNA就被扩增了１00万倍。PCR定义聚合酶链式反应简称PCR（英文全称:PolymeraseCｈaiｎRｅａctｉon,简称ＰCR）.它是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火及适温延伸三步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNＡ得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有ＤNA，RNＡ的地方.技术原理DＮＡ的半保留复制是生物进化和传代的重要途径.双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNＡ聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DＮA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制ＤＮＡ的变性和复性，并设计引物做启动子,加入DNＡ聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是，DＮA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNＡ聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PＣR技术的应用和发展。发现耐热ＤNA聚合同酶-—Taq酶对于ＰCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使ＰCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床.工作原理PCR由变性—-退火（复性）-－延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板ＤＮＡ经加热至９3℃左右一定时间后，使模板DＮA双链或经PCＲ扩增形成的双链DNA②模板ＤNA与引物的退火（复性）：模板DNＡ经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DＮA③引物的延伸：DNA模板-－引物结合物在TａqDNＡ聚合酶的作用下,于7２℃左右,以dＮTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA重复循环变性—－退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链",而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。反应体系与反应条件PCR反应五要素：引物、酶、dＮTP、模板和缓冲液（其中需要Ｍg２+).温度控制由ＰCR仪完成。PＣR产物检测--电泳电泳的定义:依据分子或颗粒所带的电荷、形状和大小等不同，因而在电场介质中移动的速度不同,从而达到分离的技术.基因测序定义:对基因中碱基排列顺序的测定。6。盲配-—罪犯DNA数据库的产生DNＡ数据库的其他应用DNA数据库至少还为我们带来了三个重大的好处：首先,在研究犯罪现场时，侦探们可以利用ＤＮA分析来判断现场的血液或者精子痕迹是属于一个人还是多个人。其次，在公众因为一系列未侦破的罪案（如强奸案）而恐慌时,通过比对几个罪案现场的样本，法医学家可以判断出这些罪案是不同的人干的还是一个连环作案罪犯所为。最后，因为(DＮＡ）分子比较稳定,所以DＮＡ分析可以用来帮助鉴别严重腐烂的尸体。DNＡ数据库可以帮助侦破刑事案件以及为无辜的嫌疑人摆脱嫌疑，但是如果利用这种ＤＮA档案为行为遗传学研究服务，将可能引发严重的人权问题和社会歧视问题。DＮＡ证据的真实面目

DNＡ鉴定可以进行人身识别的理论前提是“每个人有且仅有一组DＮＡ基因，而且各不相同,终身不变”。然而，任何科学技术都有自身的局限性,仅适用于特定的领域。DNA鉴定技术也是如此.目前,法庭科学界已经发现ＤNA鉴定依据的理论前提并非绝对正确,而是存在例外。1．“每个人的DNA基因各不相同”存在例外现代遗传学表明,同卵双胞胎或多胞胎的DNA基因几乎完全相同。这意味着通过DNA鉴定无法识别同卵兄弟或者姐妹。因此，如果同卵兄弟或者姐妹中有且仅有一人实施了犯罪，尽管DＮA证据可以证明真凶就在同卵兄弟或者姐妹中,但是如果他(她）们相互推诿，则仅凭DＮＡ证据无法认定谁是真凶.2．“每个人有且仅有一组ＤNA基因并终生不变”存在例外基因领域的“奇美拉"（Chiｍera）现象已经证明有的人携带一组以上的DNＡ基因.“奇美拉”原本是希腊神话中狮首、羊身、蛇尾的神兽，科学家将人携带至少两组DNA的情形称为“奇美拉”现象。7。基因与暴力—-突变会导致犯罪吗？XＹY综合症单胺氧化酶A缺乏这段DＮＡ序列中有一个基因编码一种称为单胺氧化酶A的蛋白质，其作用是调控一种重要的神经递质—儿茶酚胺在大脑中的水平。亨廷顿氏舞蹈症是一种家族显性遗传型疾病.患者由于基因突变或者第四对染色体内DＮＡ的ＣＡG三核甘酸重复序列过度扩张,造成脑部神经细胞持续退化，机体细胞错误地制造一种名为“亨廷顿蛋白质”的有害物质。这些异常蛋白质积聚成块，损坏部分脑细胞，特别是那些与肌肉控制有关的细胞,导致患者神经系统逐渐退化，神经冲动弥散，动作失调，出现不可控制的颤搐，并能发展成痴呆,甚至死亡.病征主要表现为:1．情绪异常,变得冷漠、易怒或忧郁。2．手指、腿部、脸部或身体出现不自主动作.3。智力衰减，判断力、记忆力、认知能力减退。一般来说，导致患者死亡的原因是因为突然跌倒或者感染其他并发症.目前药物可以控制、减缓情绪波动和动作问题，但无法彻底根治该疾病.8。不当出生——医生应当知道什么？儿童广泛性发育障碍（PDD）,这个名称用来宽泛地定义未明原因的儿童疾病。脆性X综合征：现今在Ｘ脆性部们已发现了致病基因FMR—１,它含有ＣGC三核甘酸重复序列，后者在正常人约为３0拷贝，而在正常男性传递者和女性携带者增多到15０~50０bp，称为小插入,这种前突变无或只有轻微症状.女性携带者的CGG区不稳定，在向后代传递过程中扩增，以致在男性患者和脆性部位高表达的女性达到1000～300０bp，这种全突变可关闭相邻基因的表达，从而出现临床症状。由前突变转化为完全突变只发生母亲向后代传递过程中.根据对脆性部位DＮA序列的了解，现已可用PＣＲ扩增等方法检出致病基因。行为篇９.精神疾病狂躁抑郁症也称双向情绪病或双向情绪失调，患者经常感到极度无助，对家庭和工作均丧失兴趣，不闻不问，但有时情绪却又突然高涨,令人无所适从，病发成因多数是沉重生活压力和滥用药物所致。成年患者情绪反覆的周期较长，消沉数月后,又会活跃数月，但儿童患者发病的周期却较短，一日内，情绪可以数度起落.症状表现躁狂发作病人一般存在所谓“三高"症状，即情感高涨、思维奔逸和意志行为增强.20世纪8０年代早期和中期，分子生物学家在人类染色体上的DＮA标记定位方面取得了重大进步。而分子标记技术的发展也使发现致病基因的方式有了革命性的进步。分子标记分子标记是以生物的大分子，尤其是生物体内的遗传物质——DＮA的多态性为基础的遗传标记，是ＤNA水平上遗传变异的直接反映.2０世纪７0年代Ｇｒodzicker等首创DNA限制片段长度多态性(Ｒestｒｉｃtionｆragmentlｅngtｈpｏｌyｍoｒphiｓm，ＲＦLP)技术,开创了应用分子标记作为遗传标记的新阶段，并开始应用于植物遗传育种的研究。随着PＣR技术的发展,又产生各种新型的分子标记，如ＲAPＤ、SSR、AFＬP、小卫星DNA、SＴＳ、ＳＳLP、CAPS、IＲA、SAＭPL、ＳSCP等。RAPD标记RAＰＤ即随机扩增DNＡ多态性技术是Ｗillｉamｓ和Welｓｈ两个研究小组在1990年发展起来的一种DＮA遗传标记，它是建立在PCR基础之上，以随机的寡聚核苷酸(１0个碱基）作为PCR的反应引物，对基因组DNA进行扩增,由扩增产物的多态性而显示基因组的多态性的检测技术.RAPＤ原理RＡＰD原理基本与PCＲ原理相同，它的应用是基于这样的一个推理:对于不同来源DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的片段（不同来源DNA间可能具有同源性)，也可能得到不同的带谱.仅在某一特定来源中出现的条带就可作为该模板的分子标记。ＲAPD标记的特点①无需专门设计RAPD扩增反应引物，也无须预先知道被研究生物基因组的核苷酸序列，引物可随机合成和随机选定。②每个RAPＤ反应中，仅加单个引物，就可通过引物和DNA随机配对实现扩增，扩增无特异性;③退火温度低，一般为36℃，这样的温度能保证核苷酸引物与模板的稳定结合,同时允许适当的错误配对，以扩大引物在基因组DNＡ中配对的随机性,使ＲAPD有较高的检出率.④ＲAPD技术简便易行、省时省力，不需要RＦLＰ分析的预备性工作:如同位素标记及分子杂交。RAPD易于程序化，利用一套随机引物可得到大量的分子标记,并可借助于计算机系统进行分析。⑤RAPD分析所需的ＤNA样品量极少，仅需要25ｎg左右,这对于生物早期取样鉴定或在DNA受限制的情况下是十分有利的。RAPD引物RＡPD引物由完全随机的１0个碱基组成。RAPＤ产物扩增结果精神分裂症是一种精神科疾病,是一种持续、通常慢性的重大精神疾病，是精神病里最严重的一种，是以基本个性，思维、情感、行为的分裂,精神活动与环境的不协调为主要特征的一类最常见的精神病,多青壮年发病,进而影响行为及情感。精神分裂症的一个特征：妄想精神分裂症的又一个主要症状:幻觉10.性格尿床即遗尿症。是指3岁以上的小儿入睡后还不能控制排尿，从而不自觉的尿床。习惯性遗尿会使孩子虚弱,影响身体健康和智力发育，经常尿床还会给家庭带来烦恼。临床表现为:睡眠昏沉,难以叫醒，醒后不知。平时易出汗,尤其夜间出许多.睡觉姿势多为爬或蜷卧式。脾气古怪、胆小怕事、性格内向,做梦找厕所、冬天或阴雨天加重。数以万计的儿童(尤以男孩居多）在7岁之后依然会尿床。在儿童精神病学中，尿床被称为原发性遗尿。上个世纪的大部分时间中,原发性遗尿一直被归咎于情感障碍，在很多病例中表现为父母与子女的严重冲突.精神病专家认为这个问题是由专制型父母同被动攻击型子女间的冲突所引发的.一个单基因的变化是如何引发诸如尿床问题的呢?可能性之一就是它改变了一个蛋白质的功能，而大脑正是利用这个蛋白质令肾脏在夜晚制造较少的尿量.求新性人的个性在广义上可以用四个主要范畴来评价，即求新性、避害性、趋利性以及持续性。一种称为多巴胺的神经递质(一类在脑细胞之间传送信号的化学信使)在生产和加工过程中的变异极大地影响了人类性格的差异。多巴胺影响的４方面证据:（1）动物研究己证明多巴胺水平对探索行为存在影响；(2）多巴胺代谢的变异影响着人们对可卡因反应的方式；(3）不同人的脑细胞对神经递质的处理方式之间存在巨大差异;（4）较之其他多巴胺受体,D4受体集中于更为有限的一组脑细胞上，对求新性的形成影响巨大.社交性先天性卵巢发育不全又称特纳氏（Tuｒneｒ）综合征,是一种先天性染色体异常所致的疾病。本征在１９59年被证实系因性染色体畸变所致，因为Ｔuｒnｅr曾在１938年首先报道，故又称Turneｒ综合征。11。天赋唐氏综合症又称２1三体综合征或先天愚型属常染色体畸变，是小儿染色体病中最常见的一种，活婴中发生率约１/（６0０～80０），母亲年龄愈大，本病的发病率愈高。60％患儿在胎儿早期即夭折流产。21三体综合征包含一系列的遗传病，其中最具代表性的第２１对染色体的三体现象，会导致包括学习障碍、智能障碍和残疾等高度畸形。致病机理患儿体细胞染色体为4７条,有一条额外的２1号染色体,核型为4７。XX（或XY),+21。其发生机制系因亲代（多数为母方）的生殖细胞染色体在减数分裂时不分离所致.根据唐氏综合症致病机理,可推断智力相关基因位于21号染色体上。1２.同性恋基因遗传测试问题植物与动物１3。基因改造生物转基因作物在过去的15年中，基因工程技术——将一个或多个基因从一种生物转人另一种生物生殖细胞原生质内的受控转移-—令世界农业大为改观。质疑:一是人们对食品安全问题还不够关注;二是如果基因改造生物带有的基因转移到了它们的近缘野生种中,也许就会导致农业生产的灾难。未来会怎样?1。作物产量逐步挺高。2.农药、化肥施用量逐年减少。3。农产品品种越来越好.４．人类体内毒素积累越来越多。5。植物界的覆灭.重要作物的巨大变革全仰仗20世纪８０年代出现的两项新技术，即植物克隆和转基因。以及植物细胞的全能性.植物细胞全能性:指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完整植株的遗传能力。在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。植物细胞全能性是植物组织培养的理论基础。任何部位和组织的活体植物细胞均能在特定条件下发育成完整的植株.活体植物细胞的分裂繁殖能力与动物受精卵细胞相同。动物细胞具备全能性吗？不具备。动物细胞分化程度较高，虽然每一个细胞核也具有个体的全部遗传信息，但由于不同组织细胞内营养物质不同，极大的限制了遗传信息的表达，从而导致单细胞不能再生个体。动物细胞核是具备全能性的,把细胞核取出注入取出细胞核的受精卵内一样可以再生动物个体。该技术即动物克隆。1、农杆菌介导的转化目前应用于植物转化的农杆菌有根癌农杆菌和发根农杆菌，它们都是侵染性非常强的土壤菌，能够侵染所有的双子叶植物和部分单子叶植物。由于它们具有天然的转移外源DNA的属性，因而在植物转基因中备受重视,得到广泛的应用。有关根癌农杆菌的Ti质粒转化系统是目前研究最多、理论基础最透彻和技术最为成熟的外源基因转化方法。几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤.它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A。ｔｕmefaｃｉens）。其致瘤特性是由Tｉ（tumｏｒ-ｉnducing）质粒介导的。农杆菌介导转化是在其Tｉ质粒的T-DNA区和Vｉr区的相互作用下完成的，其中T—DNA区是转移到植物基因组的区段，而Ｖiｒ区负责对T—DＮA区进行切割、转移和整合到植物基因组.其侵染过程主要包括5个阶段，分别为：(１)农杆菌在植物敏感细胞上吸附；(2)农杆菌中的Ti质粒上的viｒ区基因被激活;(3)Ｔ-ＤNA切割和T-DNＡ复合物形成；（4)T-DＮＡ复合物由农杆菌进入植物细胞;(５)T—DNA整合到植物染色体上并且进行表达。农杆菌介导法的优点：农杆菌作为一种自然界中存在的基因转化系统，在其介导转化植物受体时基因的转移具有自发性，T—ＤNA插入的拷贝数较少，重排程度低,其转移基因具有稳定遗传且呈孟德尔遗传的优点；此外，农杆菌介导法还具有操作简单、转化率高、嵌合体少的特点，是进行大规模转化的首选方法。农杆菌介导法的缺点：农杆菌介导转化也存在一些缺点，比如农杆菌感染过程会对植物材料造成损伤,T—DNA整合时其边界可能会发生短截，T－ＤＮA以串联形式整合;转移T－DNA区的两个基因未必共表达等。2外源基因直接转化法是指通过物理或化学的方法将外源基因导入植物细胞或原生质体，由此获得转基因植株的方法。主要包括化学刺激法、基因枪法、电击法和显微注射法等。化学刺激法是利用原生质体本身易于摄取外来物质的特性,再加以化学药剂刺激，使外源基因转入原生质体细胞的转化方法。其使用的化学药剂主要有磷酸钙、氯化钙和PEG等，其中最常用的是ＰＥG刺激法.PＥG即聚乙二醇。PEG刺激法的原理是将原生质体细胞悬于含有DNA质粒和PEG的溶液中，首先由PEG扰乱原生质细胞表面电荷，从而造成细胞间融合；然后质粒DNＡ在渗透压的作用下透过原生质膜进入细胞内并最终随机的整合入基因组中。基因枪法又称微弹轰击法,它是利用火药爆炸或高压气体加速,将包裹了带目的基因的ＤNA溶液的高速微弹直接送入完整的植物组织和细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生成植株,其中表现为转基因阳性的植株即为转基因植株。电击法也是一种以原生质体为受体的外源基因转化技术，其原理是利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上形成可逆的瞬间通道。当外源DNA附着于细胞质膜靠近电击点时，DNA分子就有可能通过小孔进入细胞内，进而整合到受体细胞的基因组上.显微注射法是使用毛细微管在显微镜下将外源DNA注射入植物细胞或原生质体的一种直接而完善的外源基因转移方法。在植物转基因的应用过程中,由于植物细胞的细胞壁和原生质体的弹性,通常将细胞用琼脂糖多聚赖氦酸固定，也可用吸管吸取单个细胞固定，然后将外源DNA通过特制的毛细微管注入细胞、原生质体或直接注入核内。有关基因改造生物的争论199９年，关于基因改造生物的争论在美国爆发了。这场争论主要集中在：（1）基因改造生物是非自然的;(2)将基因引人食用植物而导致未知的食物过敏风险;(3)转基因食品可能会违反正统的犹太教及伊斯兰教有关不洁食物的戒律;（4）转基因作物可能会危害到某些物种;（５)转基因作物可能会破坏现有的生态平衡；（6）基因改造生物的使用将不利于第三世界国家的经济发展。基因改造生物就是非自然的—-如果它们的存在仅是因为人类有能力创造它们的话。然而，对于人类消耗的绝大部分其他农产品来说，情况也是一样的。所有的作物和家畜都是持续数百代强制性育种的产物.至于过敏问题，转基因生物引发过敏反应的可能性甚微.“基因漂移”植物工厂：转基因植物技术的出现提供了一种诱人的可能性:植物能够像工厂一样,以低廉的成本制造昂贵的药物以及其他重要产品。戈谢病旧称高雪病，是一种由基因突变引起的遗传疾病.基因在正常情况下负责葡糖脑苷脂酶的作用，这种酶帮助人体分解成名为葡糖脑苷脂的脂肪。有戈谢病的患者，不能产生这种酶，因而也不能分解脂肪，这样就把脂肪累积在肝脏、脾和骨髓中.戈谢病能导致疼痛、疲劳、黄疸、骨损伤、贫血甚至死亡.营养基因组学又叫营养遗传学，是研究营养素和植物化学物质对机体基因的转录、翻译表达及代谢机理的科学.营养基因组学将是制药工业——许多基于基因组研究的新药物的来源-—和目前如火如茶的“另类医疗”运动之间的缓冲地带。14.转基因动物“蓝色革命”：利用海洋生物来满足全世界对食物的需求.药用激素:1993年11月１5.濒危物种我们能为拯救这些濒危物种做些什么昵？最好的方式当然是不要任由它们灭绝,而最可靠的途径就是建立大型保护区,让大型物种有足够宽广的地域能为自己的生存而奋斗。为什么要去拯救濒危动物呢？全世界的生物群包含着丰富的DNA信息,如果我们能保护、研究这些信息，并对它们有所了解，它们就能为我们提供令人目不暇接的疾病新知识,以及能对抗不断折磨着人类的传染病的有效新药。１6.异种移植欺骗免疫系统：从猪到狗的异种移植研究发现，受体动物有时在数秒钟内发动对供体器官的压倒性的攻击,并在数分钟内导致器官的死亡，这个反应就是现在所熟知的超急性排斥反应(HAR)。这是异种移植很难逾越的免疫屏障。人们已有了规避异种移植的超急性排斥反应的方法：（1）操纵猪早期胚胎，剔除那些编码猪细胞表面标记的基因，这些标记会立刻被人体免疫细胞召集的种间抗体所识别并攻击；(2)创造带有一个或多个人类基因的转基因猪,这些基因调控抗体可以缓解“补体瀑布"的强度。安全问题和伦理争议8道德、人权与隐私篇２1。遗传检测与隐私权遗传检测始于２0世纪６0年代,当时人们已经开始在所有新生儿中筛查苯丙酮尿症（PKＵ），这是一种非常罕见的（１/１2000新生儿)、导致神经发育迟缓的遗传性疾病。检测无法治疗的疾病发现非亲子关系2２。冷冻胚胎体外受精：ＩVF的具体操作方法是首先用激素控制女性的排卵期并刺激她的卵巢以产生比平常更多的卵子.胚胎保存技术23.克隆人类克隆的道德问题干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞,具有再生各种组织器官和人体的潜在功能,医学界称为“万用细胞”。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞和成体干细胞.胚胎干细胞的发育等级较高，是全能干细胞，而成体干细胞的发育等级较低，是多能干细胞或单能干细胞。干细胞的作用：干细胞就像爬上组织支架的种子，长成人们急需的器官。到那时可以为需要器官的人无限量地提供器官。优生学简史在美国和欧洲,负优生学以一种新的更为巧妙的形式正在形成.他的主要做法是检查并引导妇女避免生出患有严重遗传或先天性疾病的孩子。高尔顿最早感兴趣的是正优生学,研究改善未来群体的平均遗传品质。正优生学的目标一直都是寻求增加最优个体的繁殖方法.２、基因工程基础2．1基因工程概述2。2工具酶限制性内切酶、DNA连接酶、DNＡ聚合酶、碱性磷酸酯酶、S1核酸酶、逆转录酶2．3基因工程载体质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、其它载体２．4目的基因２。5目的基因与载体的连接2。6重组DNＡ向受体的转化2。7重组体的筛选和外源基因的鉴定2．８基因工程的应用第一节基因工程概述一、基因工程（Geneｅngｉｎeerinｇ）:又称分子克隆(Mｏlecularｃloｎing)或DNA重组技术（RecombinantDＮATechnolｏｇｙ),是指在基因水平上操作并改变生物遗传特性的技术。基因工程的基本过程:（１)从供体细胞基因组中，经酶切或ＰＣR等方法分离出含目的基因的DNA片段.然后用限制性内切酶将外源基因和载体分子切开.(2)用DNA连接酶将外源基因的DNA片段连接到载体分子上,形成重组分子。（3)借助转化手段将重组ＤNＡ分子导入受体细胞中。(4）培养细胞，以扩增重组分子或整合到受体细胞基因组中。（5）筛选和鉴定转化细胞所以，基因工程的实施至少需要四个必要条件：工具酶、目的基因、克隆载体、受体细胞。第二节工具酶一、限制性内切酶（resｔｒicｔionｅnｚyme)它是一类能识别双链ＤNA分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNＡ双链结构的核酸内切酶。它们主要从原核生物中分离纯化出来。二、DNＡ连接酶(ligａse）定义:能将两段DＮA连接起来的酶。作用：催化ＤNＡ相邻的5ˊ磷酸基与３ˊ羟基末端之间形成磷酸二酯键，将DＮA单链缺口封合起来。在基因工程中常用的连接酶主要有两种:1．T４—DNA连接酶：能连接粘性末端和平末端的DNA片段，反应体系中需提供ATP.2．大肠杆菌DNＡ连接酶：只能连接具有互补粘性末端的DNA片段，反应需供给NAD+。三、ＤＮＡ聚合酶作用：能够把脱氧核糖核苷酸连续的加到双链DＮＡ分子引物链的３ˊ羟基末端，催化核