16S rDNA基因的PCR扩增课件

16SrDNA基因的PCR扩增16SrDNA基因的PCR扩增PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长16SrDNA基因的PCR扩增PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘引物酶引物酶RNA引物RNA引物16SrDNA基因的PCR扩增PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5‘AUCGCG5‘TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶16SrDNA基因的PCR扩增PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……16SrDNA基因的PCR扩增PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖16SrDNA基因的PCR扩增KaryB.Mullis

<<TheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction>>1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。16SrDNA基因的PCR扩增生物样品DNA片段基因诊断基因治疗基因工程产品法医学检测人类学研究……16SrDNA基因的PCR扩增基因组DNA获取特定DNA片段扩增特定DNA片段16SrDNA基因的PCR扩增94℃变性50-65℃退火XX℃延伸16SrDNA基因的PCR扩增94℃55℃37℃16SrDNA基因的PCR扩增TaqDNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)温度(℃)4050607080901001008060402016SrDNA基因的PCR扩增72℃94℃55℃PCR循环16SrDNA基因的PCR扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2ugTaqDNA聚合酶2.5uMg2+

1.5mmol/L16SrDNA基因的PCR扩增1234522557294时间（min）温度（℃）PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍16SrDNA基因的PCR扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95℃16SrDNA基因的PCR扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50℃引物1引物2DNA引物16SrDNA基因的PCR扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶16SrDNA基因的PCR扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束95℃第2轮开始16SrDNA基因的PCR扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq16SrDNA基因的PCR扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72℃第2轮结束16SrDNA基因的PCR扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增16SrDNA基因的PCR扩增我们实验的反应体系10×Taq聚合酶反应缓冲液2.5μLdNTP(20mmol/L)2μL5’端引物（25pmol/μL）1μL3’端引物（25pmol/μL）1μL菌体DNA（约50ng/μL）1μLTaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μLH2O补足总体积25μL16SrDNA基因的PCR扩增反