液相色谱方法开发与应用培训班基础知识

GPC系统开发1972

LC-1（LC-830）销售＜与DuPont签订许可合同后制造销售＞1978

LC-3A系列销售＜CDQR方式的单柱塞型送液单元为特征＞1981

LC-4A系列销售＜内置微型计算机的全自动HPLC＞1982 LC-5A系列销售＜世界上首创的微量型LC对应HPLC＞1984 LC-6A系列销售＜世界上最早的积木型HPLC、现在的HPLC的前身＞1991

LC-10A系列销售＜世界上最早采用微冲程送液单元和减低噪音技术的检测器＞1997 LC-VP系列销售＜采用有效性支持功能的积木型HPLC＞LC-2010销售＜追求性能和操作性更加完善的一体型HPLC＞LC-20AProminence销售＜为分析实验室带来革新的HPLC

＞2006ProminenceUFLC利用常规HPLC实现超快速分析2008 ProminenceUFLCXR超快速、高分离度实现高通量分析2010 LC-30ANexeraUHPLC超高效液相色谱岛津HPLC的历史Startedin19691997THECNLOGYBREAKTHROUGHFlexibleHPLCSystemwithMicro-strokeVolumeSolventDeliveryUnitLC-VP2000THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20102004THECNLOGYBREAKTHROUGHLC-20AProminence第3页，课件共161页，创作于2023年2月岛津UFLC遍布五大洲交付波兰南极基地使用的岛津分析装置（摄影：ArturDzieniszewski）第4页，课件共161页，创作于2023年2月LC-20AProminence第5页，课件共161页，创作于2023年2月液相色谱分离原理

液固（吸附）色谱液液（分配）色谱正相色谱反相色谱键合相色谱离子对色谱离子抑制色谱

离子交换色谱空间排斥色谱亲和色谱液相色谱分类第6页，课件共161页，创作于2023年2月吸附色谱分离机理：

化合物在固定相表面吸附中心的竞争吸附吸附色谱固定相极性酸性（硅胶）碱性（氧化镁、硅酸镁分子筛、三氧化二铝等）非极性（活性炭）第7页，课件共161页，创作于2023年2月流动相常使用烷烃为底剂，加入适当的极性调整剂。溶剂极性越大，洗脱能力越大。

注意：不能使用含水的流动相，因为硅胶遇水会失活。（微量水可改善拖尾状况，有时用水作减尾剂）吸附色谱第8页，课件共161页，创作于2023年2月分离物质对中等分子量的油溶性样品可获得最佳分离，例如油品、脂肪、芳烃等对具有不同极性取代基的化合物或异构体有较好的选择性

但对于强极性或离子型的化合物会产生不可逆吸附。对同系物分离能力较差

优点：样品负载能力大稳定性好（pH＝3-8）吸附色谱第9页，课件共161页，创作于2023年2月液液分配色谱

固定相：惰性载体上机械涂布固定液

固定液容易流失，导致保留值减小，柱效下降。化学键合固定相已经逐步取代了液液色谱固定相第10页，课件共161页，创作于2023年2月键合相色谱

－正相液相色谱

正相液相色谱流动相极性小于固定相极性分离机制：范德华作用力的定向作用力、诱导作用力及氢键作用力。固定相：键合的胺基（-NH2)、腈基（-CN)、醚基（-O-）等氢键力：胺基>腈基>芳硝基>二醇基>醚基流动相：常使用烷烃为底剂，加入适当的极性调整剂。溶剂极性越大，洗脱能力越大分离物质：不溶于水/有机混合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC第11页，课件共161页，创作于2023年2月胺基柱：极性强，具有碱性。可在酸性水溶液中作弱阴离子交换剂，分离酚、羧酸、核苷酸。与糖分子中的羟基作用，可分离单糖、二糖、多糖。注意：胺基柱不能分析含有羰基的化合物（如醛、酮、还原糖等，流动相不能用丙酮）键合相色谱

－正相液相色谱

第12页，课件共161页，创作于2023年2月

腈基柱：中等极性，分离选择性与硅胶类似，但保留值比硅胶低。对酸性、碱性样品可获得对称峰。对含双键的异构体或双键环状化合物有良好的分离能力。

芳硝基柱：弱极性对芳香族化合物及多环芳烃有良好的分离选择性键合相色谱

－正相液相色谱

第13页，课件共161页，创作于2023年2月二醇基柱：弱极性可分离有机酸及其共聚物。也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相醚基柱：弱极性可分离能形成氢键的化合物，如酚类和硝基化合物也可以作为分离蛋白质的凝胶过滤色谱的固定相键合相色谱

－正相液相色谱

第14页，课件共161页，创作于2023年2月反相液相色谱流动相极性大于固定相极性分离机制：疏水性键合相色谱

－反相液相色谱

第15页，课件共161页，创作于2023年2月反相液相色谱固定相：键合的烷基或苯基等非极性固定相流动相：水、有机溶剂、缓冲液

键合相链越长、疏水性越强，溶质的保留值增大流动相表面张力越大、介电常数越大、极性越强，溶质与键合相的作用越强，流动相的洗脱能力越差，溶质保留值越大。

溶质的极性越弱，疏水性越强，保留值越大。

键合相色谱

－反相液相色谱

第16页，课件共161页，创作于2023年2月分离物质：能溶于水/有机混合物的中性或非离子化合物

烷基柱（C8、C18）

可分离中等极性的化合物，溶于水的高极性化合物，如：小肽、蛋白质、甾族化合物（类固醇）、核碱、核苷、核苷酸、极性合成药物等

苯基柱（-C6H5)：

可分离非极性至中等极性的化合物，如：脂肪酸、甘油脂、多核芳烃、酯类（邻苯二甲酸酯）、脂溶性维生素、甾族化合物（类固醇）、PTH衍生化氨基酸等。键合相色谱

－反相液相色谱

第17页，课件共161页，创作于2023年2月1、稳定性正相键合相的稳定性要小于反相键合相反相键合相使用pH为2-8，pH>8.5会引起基体硅胶溶解2、重现性同一种类型的键合相，因厂家不同、、生产批号不同，会表现不同的分离特性，表现为重复性差3、键合相色谱柱的再生吸附、缔合等作用使柱效降低正相色谱柱再生：1:1甲醇-氯仿反相色谱柱再生：甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、0.01mol/L无机酸（硫酸pH>2）键合相色谱

－键合相使用的注意点

第18页，课件共161页，创作于2023年2月键合相色谱

－流动相的选择

质子接受体质子给予体偶极化合物甲醇乙腈THF乙醚CHCl3CH2Cl2正相色谱反相色谱水正相、反相色谱中溶剂选择性示意图第19页，课件共161页，创作于2023年2月离子对色谱法原理离子对色谱法是将一种（或数种）与溶质离子电荷相反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保留行为的一种色谱法。关于离子对色谱机理，至今仍不十分明确，已提出三种机理：离子对形成机理；离子交换机理；离子相互作用机理。键合相色谱

－离子对色谱

第20页，课件共161页，创作于2023年2月常用离子对试剂季铵盐叔胺烷基磺酸盐高氯酸烷基硫酸盐键合相色谱

－离子对色谱

第21页，课件共161页，创作于2023年2月分析对象

有机酸、碱、盐离子交换色谱法无法分离的离子和非离子混合物药物分析如生物碱、磺胺类药物、某些抗生素、维生素键合相色谱

－离子对色谱

第22页，课件共161页，创作于2023年2月影响离子对色谱分离选择性的因素1、溶剂的极性2、离子强度（反相色谱中，离子强度增加，溶质k’值降低；正相色谱中，离子强度增加，溶质k’值增加）3、pH值（反相色谱中，pH值降低，阴离子溶质k’值降低；正相色谱中，pH值增加，阴离子溶质k’值增加）4、温度5、离子对试剂的性质和浓度的影响键合相色谱

－离子对色谱

第23页，课件共161页，创作于2023年2月离子抑制色谱

通过向流动相中加入少量弱酸（常用醋酸）、弱碱（常用氨水）或缓冲盐（常用磷酸盐和醋酸盐），调节流动相的pH值，增加组分在固定相中的溶解度，并改善峰形，以达到分离有机弱酸、弱碱的目的。键合相色谱

－离子抑制色谱

第24页，课件共161页，创作于2023年2月影响离子抑制色谱分离选择性的因素1、pH值（对于弱酸，pH<pK值时，组分以分子形式存在，k值增大；pH>pK值时，组分以离子形式存在，k值减小。对于弱碱，情况相反）2、温度3、离子抑制试剂的性质和浓度的影响键合相色谱

－离子抑制色谱

第25页，课件共161页，创作于2023年2月分离对象

适合于3.0<pKa<7.0的弱酸、7.0<pKa<8.0的弱碱以及两性化合物的分离

对于pKa<3.0的酸和pKa>8.0的碱，应采用离子对色谱法或离子交换色谱法离子抑制色谱缺点是重复性较差键合相色谱

－离子抑制色谱

第26页，课件共161页，创作于2023年2月键合相色谱

－离子对色谱和离子抑制色谱的区别

1、添加物质不同离子抑制色谱法向流动相中添加抑制剂抑制自身解离。所添加的抑制剂为低分子有机或无机弱酸、弱碱、盐。抑制离子为样品本身具有的离子。离子对色谱法是向流动相中加入离子对试剂。离子对试剂为有机两性化合物、表面活性剂。2、分析对象不同离子抑制色谱法适于分离弱酸、弱碱、有机盐；两性化合物；弱酸、弱碱与分子化合物共存时的分离离子对色谱法用于有机强酸、碱的分离第27页，课件共161页，创作于2023年2月离子交换色谱法

此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子，应用范围较广第28页，课件共161页，创作于2023年2月1．离子交换原理离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：R–A+B=R–B+A

阳离子交换：离子交换色谱法阴离子交换：第29页，课件共161页，创作于2023年2月对于典型的磺酸型阳离子交换树脂，一价离子的KB/A值按以下顺序：Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+二价离子的顺序为：Ba2+>Pb2+>Sr2+>Ca2+>Cd2+>Cu2+,Zn2+>Mg2+不同价离子，价态越高，选择性系数越大对于季铵型强碱阴离子交换树指，各阴离子的选择性顺序为：ClO4->I->HS04->SCN->NO2->Br->CN->Cl->BrO3->OH->HCO3->H2P04->IO3->CH3COO－

>F－离子交换色谱法第30页，课件共161页，创作于2023年2月离子交换色谱法2．固定相

作为固定相的离子交换剂，其基质大致有三大类：合成树脂（聚苯乙烯）、纤维素和硅胶。而离子交换剂又有阳离子和阴离子之分。再根据官能基的离解度大小还有强弱之分第31页，课件共161页，创作于2023年2月3、流动相

离子交换色谱法所用流动相大都是一定pH和盐浓度（或离子强度）的缓冲溶液。通过改变流动相中盐离子的种类、浓度和pH值可控制k值，改变选择性。如果增加盐离子的浓度，则可降低样品离子的竞争吸附能力，从而降低其在固定相上的保留值。

离子交换色谱法第32页，课件共161页，创作于2023年2月

阴离子的滞留次序为：柠檬酸离子>SO42－>C2O42->I->NO3->

CrO42->

Br->

SCN->

Cl->

HCOO->

CH3C00->

OH->F-

用柠檬酸离子洗脱要比氟离子快。阳离子的滞留次序为：但差别不如阴离子明显。

Ba2+>Pb2+>Ca2+>Ni2+>Cd2+>Cu2+>Co2+>Zn2+>Mg2+>Ag+>Cs+>Rb+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

流动相电离度增大，就会使样品的保留增大。关于pH值的影响，要视不同情况而定。例如，分离有机酸和有机碱时，这些酸碱的离解程度可通过改变流动相的pH值来控制。增大pH值会使酸的电离度增加，使碱的电离度减少；降低pH值，其结果相反。离子交换色谱法第33页，课件共161页，创作于2023年2月

离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景电导信号掩没而无法检测。为了解决这一问题，1975年Small等人提出一种能同时测定多种无机和有机离子的新技术。他们在离子交换分离柱后加一根抑制柱，抑制柱中装填与分离柱电荷相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变成低背景电导的流动相，从而用电导检测器可直接检测各种离子的含量。这种色谱技术称为抑制型离子色谱。离子色谱法第34页，课件共161页，创作于2023年2月

若样品为阳离子，用无机酸作流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换剂。当试样经阳离子交换剂的分离往后，随流动相进入抑制柱，在抑制柱中发生两个重要反应：

R+–OH-+H+Cl-

→R+–Cl-+H2OR+–OH-+M+Cl-→M+OH－+R+–Cl-

由反应可见：经抑制柱后，一方面将大量酸转变为电导很小的水，消除了流动相本底电导的影响。同时，又将样品阳离子M+转变成相应的碱，由于OH-离子的淌度为Cl-离子的2.6倍，提高了所测阳离子电导的检测灵敏度。对于阴离子样品也有相似的作用机理。离子色谱法第35页，课件共161页，创作于2023年2月[抑制型离子色谱仪][非抑制型离子色谱仪]离子色谱法第36页，课件共161页，创作于2023年2月离子色谱法

－抑制器技术的种类76-81填充柱

（再生液）

81-85中空纤维85-92膜类型（抑制液）92-现在膜类型（电透析）岛津公司目前方式

填充柱（电化再生）第37页，课件共161页，创作于2023年2月阳离子交换膜Na+Na+Na+Na+Na+Na+H+H+H+H+Cl-Cl-Cl-NaHCO3Cl-H2CO3Cl-（流动相)(分析后流动相)

电极电极(分析后流动相)+-离子色谱法

－膜类型（电透析）抑制器第38页，课件共161页，创作于2023年2月离子色谱法

－填充柱（电化再生）抑制器NaHCO3+树脂-SO3-H+

=

树脂-SO3-Na++H2CO3-SO3--SO3--SO3--SO3-NaHCO3H2CO3第39页，课件共161页，创作于2023年2月

填充柱(固相化学抑制)(1)带有10通阀的双抑制柱能提供连续进样分析(2)小体积的抑制柱使死体积更小

电化学再生

(1)不需要抑制液/不需额外填加泵(2)非常简单的更换抑制柱和维护简便且价格低CDD-6Asp

电导检测器

分析柱池

B池

A电源电源废液离子色谱法

－填充柱（电化再生）抑制器第40页，课件共161页，创作于2023年2月离子色谱法

－抑制器膜类型

电透析填冲柱(固相化学抑制)－用电化方法再生(shimadzu)

优点

缺点

电透析

－

不需填加泵－

高价格

填充柱-不需填加泵-需要再生

－低价格第41页，课件共161页，创作于2023年2月亲和色谱法（AC）

分离机制

亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的一种方法。它通常是在载体（无机或有机填料）表面先键合一种具有一般反应性能的所谓间隔臂（如环氧、联氨等）；随后，再连接上配基（酶、抗原或激素等）。这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子相互作用而被保留，没有这种作用的分子不被保留。第42页，课件共161页，创作于2023年2月亲和色谱法（AC）第43页，课件共161页，创作于2023年2月分离物质主要用于分离纯化具有不同分子量的生物活性物质，如氨基酸、肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核糖核酸和脱氧核糖核酸等。优点分离的高特效性高选择性高回收率和纯化率亲和色谱法（AC）第44页，课件共161页，创作于2023年2月尺寸排阻色谱法（SEC）

尺寸排阻色谱法又称凝胶色谱法，主要用于较大分子的分离。与其他液相色谱方法原理不同，它不具有吸附、分配和离子交换作用机理，而是基于试样分子的尺寸和形状不同来实现分离的。凝胶渗透色谱（GPC）流动相为有机溶剂凝胶过滤色谱（GFC

）流动相为水溶液

第45页，课件共161页，创作于2023年2月

尺寸排阻色谱被广泛应用于大分子的分级，即用来分析大分子物质相对分子质量的分布。它具有其他液相色谱所没有的特点：（1）保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。（2）保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器（3）固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于柱子不能很强保留分子，因此柱寿命长。（4）不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10％才能得以分离。尺寸排阻色谱法（SEC）第46页，课件共161页，创作于2023年2月分离原理尺寸排阻色谱是按分子大小顺序进行分离的一种色谱方法。其固定相为化学情性多孔物质——凝胶，它类似于分子筛，但孔径比分子筛大。凝胶内具有一定大小的孔穴，体积大的分子不能渗透到孔穴中去而被排阻，较早地被淋洗出来；中等体积的分子部分渗透；小分子可完全渗透入内，最后洗出色谱柱。这样，样品分子基本上按其分子大小，排阻先后由柱中流出。尺寸排阻色谱法（SEC）第47页，课件共161页，创作于2023年2月固定相

排阻色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。尺寸排阻色谱法（SEC）第48页，课件共161页，创作于2023年2月

（1）软性凝胶如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。

（2）半刚性凝胶如高交联度的聚苯乙烯（Styragel）比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。

（3）刚性凝胶如多孔硅胶、多孔玻璃等既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。一般控制压强小于7MPa，流速＜1cm3·s-1；否则将影响凝胶孔径，造成不良分离。尺寸排阻色谱法（SEC）第49页，课件共161页，创作于2023年2月

流动相

排阻色谱所选用的流动相必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。当采用软性凝胶时，溶剂也必须能溶胀凝胶。另外，溶剂的粘度要小，因为高粘度溶剂往往限制分子扩散作用而影响分离效果。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。选择溶剂还必须与检定器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。

以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。尺寸排阻色谱法（SEC）第50页，课件共161页，创作于2023年2月尺寸排阻色谱法（SEC）流出顺序SEC柱第51页，课件共161页，创作于2023年2月GPC/GFC的目的GPC（凝胶渗透色谱）聚合物分子量测量GFC（凝胶过滤色谱）蛋白质分离第52页，课件共161页，创作于2023年2月MW和

RT的关系分子量（低分子量)排阻限渗透限时间第53页，课件共161页，创作于2023年2月样品分子量小于2000分子量大于2000溶于有机溶剂溶于水溶于有机溶剂溶于水溶于己烷溶于甲醇-水或乙腈-水溶于THF非离子化离子化液固色谱法正相键合相色谱法反相键合相色谱法低分子GPC反相键合相色谱法抑制电离反相键合相色谱法离子对色谱法低分子GFC离子色谱法凝胶渗透色谱凝胶过滤色谱离子色谱法反相键合相色谱法液相色谱分离模式选择指导图第54页，课件共161页，创作于2023年2月第二部分柱子基本性能参数第55页，课件共161页，创作于2023年2月液相色谱柱类别尺寸（柱径/mm）备注制备柱>10生产型制备柱直径可达几十厘米半制备柱5~10分析柱2～5典型柱为4.6或4微型柱细径柱（narrowborecolumn）0.8~2.0一般柱管可为金属亦可为塑料制，如PEEK制毛细管柱（capillarycolumn）0.05~0.5毛细管柱可为填充柱亦可为开管柱纳米柱(nano-column)<0.1填充柱或开管柱第56页，课件共161页，创作于2023年2月硅胶纯度填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸填料床的长度和内径颗粒形状球型或不规则型粒径平均颗粒直径,通常3-10µm表面积颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/g表示孔径颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å碳百分率与基体物质相连的键合相的量封尾用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来表征色谱柱的参数第57页，课件共161页，创作于2023年2月硅胶特性[无定型]

[球形]

制备用

分析用第58页，课件共161页，创作于2023年2月硅胶性质粒径

5mm5mm的粒子是最常用的.然而,这是指平均粒径为

5

mm，也存在

3mm和10mm的粒子.对于好的柱子，窄范围的粒径分布是非常重要的.粒径第59页，课件共161页，创作于2023年2月硅胶性质孔径

:80-120Å正常的硅胶表面有微孔.分析用的柱子,微孔大小80Å-120Å是最常用的.对于蛋白质和聚合物等大分子,300Å,500Å和1000Å(甚至更大)常被使用.在大量分析时无孔的硅胶也常使用.有孔和无孔第60页，课件共161页，创作于2023年2月硅胶性质

表面积和碳百分率

表面积如果孔径增加,表面积降低.100Å:450m2/g150Å:330m2/g300Å:100m2/g碳百分率碳含量高,填充物保留能力强.碳含量为12%-20%

是最常用的第61页，课件共161页，创作于2023年2月硅胶性质硅羟基容易和硅烷化试剂发生反应Cl-Si(CH3)2-RR=C18,C8,C4,Phenyl,C3H7CN,C3H7NH2,DiolSiSiO2SiSiSiSiSiOOOOOOOOOHOHOHOH硅羟基SiSiO2SiSiSiSiSiOOOOOOOOOSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-R硅羟基第62页，课件共161页，创作于2023年2月硅胶性质

残留硅羟基残留的硅羟基即使对于改良的硅胶

(e.g.ODS,C8),

仍旧有硅羟基保留在表面.硅羟基对

胺类化合物有强的吸引力,因而会造成此类物质的拖尾.C18C18C18C18silicagelOHOH残留的硅羟基第63页，课件共161页，创作于2023年2月硅胶性质

封尾为了降低硅羟基的影响,选择

封尾

的柱子C18C18C18silicagelOHOHC18C18C18silicagelO-TMSO-TMSTMS处理TMS:三甲基硅烷[封尾][无封尾]C18C18第64页，课件共161页，创作于2023年2月封尾和未完全封尾的效果比较Peaks1.Propranolol2.Acenaphthene3.Ammitriptyline封尾未完全封尾第65页，课件共161页，创作于2023年2月如何消除拖尾流动相中加入辅助剂三乙胺高氯酸钠（NaClO4）在流动相中加入胺修饰剂和高氯酸钠有助于减少拖尾，因为这些添加物可以对硅羟基产生屏蔽效应.第66页，课件共161页，创作于2023年2月NaClO4如果在流动相中填加了胺修饰剂或

TBA离子对试剂，分析结束后必须清洗柱子。

高氯酸钠可以较好的去除胺修饰剂或

TBA离子，因为高氯酸钠与胺化合物有很强的吸引力。下面的溶液经常被用来清洗柱子（含有100mM高氯酸钠）0.1%的磷酸水溶液/甲醇=1:1第67页，课件共161页，创作于2023年2月表征色谱柱性能的参数容量因子理论塔板数理论塔板高度分离度拖尾因子第68页，课件共161页，创作于2023年2月容量因子，

k’t1=

组分峰的保留时间t0=死时间(非保留时间)t0t1k’=t0t1-t0第69页，课件共161页，创作于2023年2月理论塔板数，

N中国/日本药典:N=5.54×

(Rt/W1/2)2美国药典:

N=16×(Rt/W)2WW1/2H1/2HRtArea理论塔板高度,H

H=L/NL：色谱柱长N：理论塔板数第70页，课件共161页，创作于2023年2月分离度，Resolution相邻两峰完全分离其分离度

Rs≥1.5.第71页，课件共161页，创作于2023年2月完全分离时的分离度

Rs=1.0Rs=1.5峰形不是三角形

，而是高斯分布第72页，课件共161页，创作于2023年2月拖尾因子，TT=W0.05/2d0.05

W0.05

：5％峰高处峰宽

d0.05：5％峰高处的前半峰宽d0.05W0.05H0.05H第73页，课件共161页，创作于2023年2月

通常，以指定的一组标准溶质为样品，测定他们在柱子上的理论塔板数，作为柱效的衡量指标。标准溶质的选择，不同柱子选择不同。但要求他们有不同的容量因子（第一个化合物的k’=0，其余的在2–10内），能反映出柱子的基本性能理论塔板数液相色谱柱

－柱性能评价第74页，课件共161页，创作于2023年2月

特别注意的是，新购买的柱子在实验室中所测定的柱效，往往低于生产厂家给出的柱效。排除保存和运输过程中引起的柱性能变化等因素外，柱外效应可能是最主要的原因。

只要将死体积减至最小（进样阀至柱头、柱头至检测器的连接管），一般可以得到满意的色谱图液相色谱柱

－柱性能评价第75页，课件共161页，创作于2023年2月与柱子有关的一些常数保留体积VR/保留时间tR

绝对保留体积V’R/绝对保留时间t’R

死体积V0

：不保留溶质的保留体积死时间t0：不保留溶质的保留时间死体积＝柱外体积＋柱体积对于常规柱及制备柱，柱外体积可忽略；对于微型柱，柱外体积影响很大，必须尽量降低柱外体积第76页，课件共161页，创作于2023年2月选择原则采用“HPLC”级溶剂避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂对试样有适宜的溶解度溶剂粘度要小与检测器相匹配流动相第77页，课件共161页，创作于2023年2月溶剂的等级HPLC级优级纯分析纯都经过蒸馏和0.45mm的过滤(除纤维毛,未溶解的机械颗粒）优级纯的纯度比分析纯大,但里面含有防腐剂和抗氧化剂HPLC级经过0.2mm的过滤,且除去有紫外吸收的杂质微量分析、梯度洗脱流动相第78页，课件共161页，创作于2023年2月水/甲醇梯度ODS柱鬼峰GradientCurve1mL/min,0-100%MeOHover10minsandholdfor15mins.鬼峰的出现流动相第79页，课件共161页，创作于2023年2月水的等级纯化水蒸馏水去离子水波长

(nm)纯化水去离子水因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高纯化水中去除了无机和有机的污染物吸光率流动相第80页，课件共161页，创作于2023年2月选择缓冲液的步骤

1.确定最佳分离状态时的流动相pH2.选择具有与流动相pH相近的pKa的缓冲液（即使浓度稀也具有较强能力的缓冲液）3.确认检测波长下缓冲液是否有大的吸收（在波长210nm附近进行检测时，不能用醋酸和柠檬酸的缓冲液）缓冲盐第81页，课件共161页，创作于2023年2月pK1pK2pK3醋酸4.87柠檬酸3.134.766.40磷酸2.167.2112.32缓冲盐常用代表性的弱酸的pKa值第82页，课件共161页，创作于2023年2月缓冲液的使用

使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞:

用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1mL/min），再用甲醇冲洗30min

用纯水冲洗泵头清洗管路易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液缓冲液第83页，课件共161页，创作于2023年2月流动相的更换不互溶的流动相不能直接更换缓冲盐不能直接用有机溶剂更换水正己烷异丙醇缓冲盐有机溶剂水第84页，课件共161页，创作于2023年2月-乙腈黏度低

在相同流速时有较低的柱压-当和水混合时黏度有变化柱压也相应有变化

乙腈和甲醇

…黏度溶剂的黏度Water/methanolWater/methanolWater/acetonitrileWater/acetonitrilePressure(MPa)Water(100%)Organicsolvent(100%)Water/Organicsolvent1:1第85页，课件共161页，创作于2023年2月过滤：0.45mm或更小孔径滤膜

目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。滤膜类型：

聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐。

醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶剂。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。

再生纤维素滤膜：蛋白吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂溶剂前处理-过滤第86页，课件共161页，创作于2023年2月

脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡

气泡对测定的影响：

1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积

2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形

3）检测器中的气泡产生基线波动溶剂前处理-脱气第87页，课件共161页，创作于2023年2月0

50

100

乙醇体积(%)100200氧的饱和容量(mL)氧气在1mL水-乙醇混合溶剂中的溶解度溶剂前处理-脱气第88页，课件共161页，创作于2023年2月常用脱气方法超声脱气减压脱气在线脱气第89页，课件共161页，创作于2023年2月目的单元流速范围 特性和应用

LC-20AD0.0001-10ml/min

无脉动，适于半微量LC

和LC-MS分析

LC-20AT0.001-10ml/min

非凡的耐用性，适于常量分析

LC-20AB 0.0001-10ml/min

无脉动，适于半微量LC

和LC-MS分析分析

LC-10ATvp0.001-9.999ml/min

LC-10ADvp

0.001-9.999ml/min岛津液相输液泵第90页，课件共161页，创作于2023年2月LC-20AT串联式柱塞往复泵LC-20AD

并联式微体积柱塞往复泵柱塞泵的基本结构LC-10ATvp

LC-10ADvp

单向阀单向阀单向阀LC-2010第91页，课件共161页，创作于2023年2月LC-20ATLC-20AT第92页，课件共161页，创作于2023年2月LC-20AD第93页，课件共161页，创作于2023年2月LC-20AB第94页，课件共161页，创作于2023年2月泵工作示意图

凸轮柱塞杆柱塞密封圈单向阀

泵头流动相入口流动相出口第95页，课件共161页，创作于2023年2月单向阀结构抛光面

球座宝石球单向阀工作原理吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头单向阀工作原理第96页，课件共161页，创作于2023年2月输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂等度洗脱第97页，课件共161页，创作于2023年2月

A泵进样器色谱柱柱温箱检测器B泵AB时间B

浓度梯度洗脱第98页，课件共161页，创作于2023年2月梯度洗脱装置：高压梯度：用两台高压输液泵将两种溶剂输入低压梯度：在常压下将两种溶剂（或多元溶剂）混合，然后用高压输液泵将流动相输入到色谱柱中。HPGE梯度混合器低压梯度比例阀LPGE高压常压高压/低压梯度系统常压高压第99页，课件共161页，创作于2023年2月分析时间长分离度差

MeOH/H2O=6/4MeOH/H2O=8/2(column:ODS)使用梯度洗脱的原因当等度洗脱时：第100页，课件共161页，创作于2023年2月95%30%甲醇浓度在最短时间内获得最佳的分离使用梯度洗脱的原因当采用梯度洗脱时：第101页，课件共161页，创作于2023年2月梯度洗脱：优点：可提高分离度、缩短分离时间、降低最小检测量和提高分离精度注意事项：溶剂的纯度要高，否则梯度洗脱的重现性差梯度混合的溶剂互溶性要好梯度洗脱应使用对流动相组成变化不敏感的选择性检测器（如紫外吸收检测器或荧光检测器），而不能使用对流动相组成变化敏感的通用型检测器（如示差折光检测器）查看空白实验的数据遵守分析周期（最初的分析数据不采用）梯度洗脱要点第102页，课件共161页，创作于2023年2月1.使用流动相溶解样品

--减少溶剂峰，尤其是组分峰靠近溶剂峰时尤为重要

--保证样品在流动相中的溶解度，避免样品在系统中，尤其在柱中产生沉淀

2.进样前最好使用0.45mm的滤膜进行过滤如果样品很脏，要使用0.22mm的滤膜进行过滤3.对于含有复杂基质的样品，最好前处理后再进样。样品前处理第103页，课件共161页，创作于2023年2月进样器自动进样器手动进样器原理：（六通阀）注入方式：

1）全量注入

2）部分注入第104页，课件共161页，创作于2023年2月手动进样器的原理图load位置inject位置

柱

泵

泵

柱

定量环１２３５４６１２３５４６第105页，课件共161页，创作于2023年2月进样量和检测器响应的关系示意图进样体积

检测器响应值定量环体积的一半3倍定量环体积全量注入部分注入手动进样器的进样体积第106页，课件共161页，创作于2023年2月部分注入：一般要求进样量最多为定量环体积的一半，如20mL的定量环最多进样10mL的样品，并且要求每次进样体积准确、相同全量注入：进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20mL的定量环最少进样60至100mL的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。部分注入和全量注入第107页，课件共161页，创作于2023年2月交叉污染的原因

红色表示残留样品第108页，课件共161页，创作于2023年2月手动进样方法一般的方法

1.在进样状态下清洗针口

2.在装填状态下插入微量注射器

3.注入样品

4.切到进样状态第109页，课件共161页，创作于2023年2月便捷的方法（不需清洗）

1.进样状态下插入微量注射器

2.切换到装填状态

3.注入样品

4.切换回进样状态手动进样方法第110页，课件共161页，创作于2023年2月液相色谱检测原理

液相色谱检测器是用于连续监测被色谱系统分离后的柱流出物的组成和含量变化的装置。

检测器的性能好坏直接关系着定性定量的可靠性和准确性第111页，课件共161页，创作于2023年2月检测器分类

按测量信号性质的不同

浓度敏感型检测器响应正比于溶质在流动相中的浓度，与峰高响应流动相流速无关，峰面积响应与流速呈反比。峰面积与流速乘积为常数。大部分的液相检测器为浓度敏感型检测器

质量敏感型检测器响应正比于单位时间内通过检测器的溶质的物质的量，即正比于质量流速。峰面积响应流动相流速无关，峰高响应与流速呈反比。库仑检测器为质量敏感型检测器

液相色谱检测器第112页，课件共161页，创作于2023年2月检测器分类按测量原理光学检测器电学检测器电化学检测器热学检测器液相色谱检测器第113页，课件共161页，创作于2023年2月理想的检测器应具备的特点1、灵敏度高，2、对所有样品都有响应3、不受温度和流动相流速变化的影响4、线性范围宽5、噪音低、漂移小，对流动相组分的变化不敏感。6、死体积小，不引起柱外谱带扩张效应，以保持高的分离效能液相色谱检测器第114页，课件共161页，创作于2023年2月7、对样品无破坏性8、响应快，能快速，精确地将流出物检测9、能给出定性的信息10、稳定、可靠，重现性好，使用方便11、价格便宜12、良好的气密性液相色谱检测器第115页，课件共161页，创作于2023年2月1、噪声（N）无溶质通过检测器时，检测器输出信号的变化。是与被测样品无关的检测器输出信号随机扰动变化。短噪声，因信号频率波动引起。不影响色谱峰的分辨，但对检测限有影响。来源于仪器电子系统和泵的脉动，可以加适当的滤波器降低或消除长噪声，有规律的波动，基线呈波浪型，或无规律的波动。会引起色谱峰分辨的困难。由于检测器本身部件不稳定，流动相含有气泡或被污染，温度或流速引起液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第116页，课件共161页，创作于2023年2月2、漂移基线随时间的增加朝单一方向的偏离造成漂移的原因是电源电压不稳，温度及流动相流速缓慢变化，固定相从柱子冲刷下来，更换的新溶剂在柱中尚未达到平衡液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第117页，课件共161页，创作于2023年2月3、灵敏度S

是检测器的主要性能指标一定量的物质通过检测器时所给出的信号大小叫做该检测器对该物质的灵敏度。

S=△R/△m

△m

为样品量增值，△R为信号的增值

响应信号可以是电压、电流、电导、吸光度AU、折光率RI等液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第118页，课件共161页，创作于2023年2月检测器的响应曲线液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第119页，课件共161页，创作于2023年2月1、同一检测器上，A、B两种物质斜率不同，斜率越大，灵敏度越高。检测器的灵敏度和样品性质有关，因此该方法给出灵敏度时，需同时说明何种样品及何种溶剂。2、检测器限制了最大允许进样量（mmax），超过此限，响应信号不再与样品呈线性关系。3、灵敏度越高，检出限越低液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第120页，课件共161页，创作于2023年2月

灵敏度的定义只考虑了样品响应信号的大小，并没有考虑检测器的噪声。当检测器响应与噪声大小相近时，就无法区分信号。而且信号可以用电子放大器任意放大，这样似乎可以任意提高检测器灵敏度。但放大信号同时也放大了噪声，因此灵敏度并不能很好的衡量检测器的质量。

需要更全面的衡量指标－检测限液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第121页，课件共161页，创作于2023年2月4、检测限（detectability）D

又叫敏感度，为响应值3倍噪声时所需的样品量

D=3S/N

检测限实际上为信噪比，它考虑了噪声的影响，因而更能全面的反映检测器的质量。检出限越小，检测器的检测能力越强。注意：计算检出限时，噪声与信号的单位要一致，并且要在同一衰减水平。

液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第122页，课件共161页，创作于2023年2月5、线性范围（linearrange）为检测信号与被检测物质的质量呈线性关系的范围，以呈线性响应的样品量的上限和下限比值表示。线性范围的下限规定为噪声的两倍值时的样品量。线性范围的上限由实验测知，为信号与样品量不呈线性的转折点。线性范围为比值，无量纲。希望线性范围尽量大，可以同时测定大量和痕量的组分。非线性是由于电子和机械的缘故产生的。液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第123页，课件共161页，创作于2023年2月6、最小检测量（mmin）和最低检测浓度Cmin

最小检测量产生的信号等于3倍噪声时的进样量

mmin＝3S/N

最低检测浓度为一定色谱条件下，最小检测量与进样体积之比。

Cmin=mmin/V

液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第124页，课件共161页，创作于2023年2月最小检测量与检出限的区别1、影响因素不同最小检测量除与检测器性能有关外，还与色谱条件有关。检测限与色谱条件无关，同一物质只与检测器性能有关。一般最小检测量要比检出限高1~2个数量级，色谱峰越窄，两者相差越小。2、它们的单位不同检测限单位为g/mL或g/s

最小检测量为g

液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第125页，课件共161页，创作于2023年2月注意：流动相的流速、压力、温度以及其干净程度对检测器的噪声、漂移、响应值等参数都有很大的影响。液相色谱检测器

－评价检测器的性能指标第126页，课件共161页，创作于2023年2月1、池体积增大就增大了死体积。池体积大，使样品被流动相稀释，不仅降低了检测灵敏度，而且使峰变宽。2、池的结构也会影响峰展宽。一般检测池的体积应该小于色谱峰体积的十分之一。常规分析：检测池体积为8mL

小体积高效柱：检测池体积应小于5mL

微量色谱柱：检测池体积减小到1mL液相色谱检测器

－检测池对检测器的影响第127页，课件共161页，创作于2023年2月

为应用最广的检测器，属于浓度敏感型检测器优点：

1、灵敏度高，噪声低，线性范围宽

2、对流动相基本无响应，受操作条件和外界环境变化影响小，流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。

3、对样品无破坏性，可以用于制备色谱或与其他检测器串连。

4、结构简单，使用方便紫外检测器第128页，课件共161页，创作于2023年2月缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质流动相必须选择无紫外吸收特性的检测器紫外检测器第129页，课件共161页，创作于2023年2月紫外检测器原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收定量基础：比耳定律，A=ξCL测量时一般选择在对样品有最大吸收的波长下进行，以获得最大的灵敏度和抗干扰能力，同时要考虑流动相的紫外吸收性质。第130页，课件共161页，创作于2023年2月紫外/可见光检测器EinEoutA=eCl

=-log(Eout/Ein)lC:浓度

朗伯－比尔定律(A:吸收)池第131页，课件共161页，创作于2023年2月紫外/可见光检测器样品池参比池光电二极管光电二极管EinEinEin光栅D2/W灯lEout第132页，课件共161页，创作于2023年2月一些常用溶剂的紫外截至波长紫外检测器紫外检测器流动相的选择第133页，课件共161页，创作于2023年2月影响紫外检测器噪声和漂移的因素灯能量光学元件气泡流动相和检测池温度变化泵的流量及压力波动紫外检测器第134页，课件共161页，创作于2023年2月影响紫外检测器线性范围的因素

1）单色器的色散能力

2）光电转换元件和其他电子元件的灵敏度

3）狭缝宽度狭缝宽度大，光通量大，有利于灵敏检测，但线性范围小。狭缝过窄，会降低灵敏度。

4）波长的选择。最好选择在被测物的最大吸收波长处，线性范围宽，而且检测的精确度、准确度都高。紫外检测器第135页，课件共161页，创作于2023年2月二极管阵列检测器（SPD-M20A）二十一世纪标准紫外检测器色谱定性依据：

保留时间常规紫外检测器峰纯度二极管阵列检测器二极管阵列检测器第136页，课件共161页，创作于2023年2月样品池二极管阵列光栅D2/W灯每一组分可在每一波长处得到一吸光度值二极管阵列检测器第137页，课件共161页，创作于2023年2月二极管阵列检测器时间长波吸收色谱图光谱图第138页，课件共161页，创作于2023年2月检验分离参数时可使用光谱图2311:壬二酸2:安息香酸3:硝基安息香酸30%15%乙腈浓度min第139页，课件共161页，创作于2023年2月光谱鉴定洗提顺序Peak1Peak2Peak3乙腈30%15%AzelaicacidBenzoicacidNitrobenzoicacid第140页，课件共161页，创作于2023年2月优点：1）采集三维谱图，可同时得到多个波长的色谱图2）可实时记录每个色谱峰的光谱图，并计算最大吸收波长3）峰纯度检验4）光谱库检索定性5）可以发现单波长检测时未测到的峰6）可以选择适当的测定波长，使两个没有分开的峰中的一个产生抑制，从而实现未分离峰的准确定量二极管阵列检测器缺点：

二极管阵列检测器要比紫外检测器的灵敏度低第141页，课件共161页，创作于2023年2月原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点：

1）灵敏度极高，是最灵敏的检测器之一比紫外检测器约高2～3数量级

2）选择性好，避免了不发荧光的基体成分对勘测的干扰

3）对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱

4）线性范围宽，约为104～1055)受外界影响小荧光检测器第142页，课件共161页，创作于2023年2月荧光检测池的设计第143页，课件共161页，创作于2023年2月衍生化试剂OPA伯胺衍生化试剂CHOCHOo-phthalaldhyde(OPA)+R-NH2N-RAAADAM脂肪酸衍生化试剂CHN29-anthryldiazomethane(ADAM)+R-COOHCH2OCOR第144页，课件共161页，创作于2023年2月影响荧光强度的因素

1、pH值对某些可离子化的荧光化合物影响很大

2、溶剂的极性，极性增大，荧光增强

3、溶液的温度，温度升高，荧光减弱

4、样品浓度，浓度增大会引起样品分子间的猝灭效应增大。荧光检测器第145页，课件共161页，创作于2023年2月缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质，应用范围窄可检测物质：多环芳烃、霉菌毒素、酪氨酸、色氨酸、卟啉、儿茶酚氨等（具有对称共轭体系