生物化学之蛋白质

生物化学课件之蛋白质第1页，课件共121页，创作于2023年2月主要内容[教学时数]4学时[掌握内容]：蛋白质的基本组成单位和平均含氮量。20种氨基酸的名称及三字母英文缩写符号。氨基酸的理化性质。蛋白质一级结构的定义及维系的键、蛋白质二级结构的定义及维系的键，肽单元和蛋白质二级结构的主要类型，模体的概念。蛋白质三级结构的定义及维系的键，结构域的定义。蛋白质四级结构的定义及维系的键，亚基的定义。蛋白质变性的定义及影响因素，蛋白质沉淀及维持蛋白质胶体溶液的稳定因素。蛋白质等电点的定义。[熟悉内容]：氨基酸的分类，肽的概念基本结构，蛋白质一级结构和空间结构与蛋白质功能之间的关系。氨基酸和蛋白质的紫外吸收作用。蛋白质的分离和纯化。[了解内容]：生物活性肽，蛋白质的模序结构，分子病的定义。[自学内容]：蛋白质分类，多肽链中氨基酸的序列分析、蛋白质空间结构测定第2页，课件共121页，创作于2023年2月第一节蛋白质是生命的物质基础蛋白质(protein)是由许多氨基酸(aminoacids)通过肽键(peptidebond)相连形成的高分子含氮化合物。一、什么是蛋白质?第3页，课件共121页，创作于2023年2月二、蛋白质的生物学重要性1.蛋白质是生物体重要组成成分分布广：普遍存在于生物界，动物、植物、微生物主要是由蛋白质构成。所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45％，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80％。第4页，课件共121页，创作于2023年2月1）作为生物催化剂（酶）2）代谢调节作用（激素）3）免疫保护作用（抗体）4）物质的转运和存储（血红蛋白、血浆运铁蛋白）5）运动与支持作用（肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白、肌原蛋白）6）控制生长和分化（核蛋白）7）参与细胞间信息传递（受体蛋白）8)生物膜9)识别和记忆2.蛋白质具有重要的生物学功能3.氧化供能第5页，课件共121页，创作于2023年2月蛋白质的分子组成

TheMolecularComponentofProtein第二节第6页，课件共121页，创作于2023年2月一、组成蛋白质的元素主要有C、H、O、N和S。

有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘

。第7页，课件共121页，创作于2023年2月

各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％。由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%蛋白质元素组成的特点第8页，课件共121页，创作于2023年2月二、氨基酸

——组成蛋白质的基本单位存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属

L-氨基酸（甘氨酸除外）。第9页，课件共121页，创作于2023年2月H甘氨酸CH3丙氨酸L-氨基酸的通式R（一）氨基酸的结构特点1.为a氨基酸（脯氨酸除外为a亚氨基酸）。2.是L型氨基酸（甘氨酸除外）。3.不同的氨基酸，其R侧链不同，对蛋白质的理化性质和空间结构有影响。第10页，课件共121页，创作于2023年2月非极性疏水性氨基酸：脂肪族、芳香族、杂环极性中性氨基酸：羟基、酰胺、含巯基半胱氨酸、甘氨酸3.酸性氨基酸：羧基4.碱性氨基酸：氨基、胍基、咪唑基（二）氨基酸的分类*20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:亲水性氨基酸第11页，课件共121页，创作于2023年2月甘氨酸

glycine

Gly

G

5.97丙氨酸

alanineAlaA

6.00缬氨酸

valineValV

5.96亮氨酸

leucineLeuL

5.98

异亮氨酸

isoleucineIleI

6.02

苯丙氨酸

phenylalaninePheF

5.48脯氨酸

prolineProP

6.30非极性疏水性氨基酸目录第12页，课件共121页，创作于2023年2月色氨酸

tryptophanTryW

5.89丝氨酸

serineSerS

5.68酪氨酸

tyrosineTryY

5.66

半胱氨酸

cysteineCysC

5.07

蛋氨酸

methionine

MetM

5.74天冬酰胺

asparagineAsnN

5.41

谷氨酰胺

glutamineGlnQ

5.65

苏氨酸

threonineThrT5.602.极性中性氨基酸目录第13页，课件共121页，创作于2023年2月天冬氨酸

asparticacidAspD

2.97谷氨酸

glutamicacidGluE

3.22赖氨酸

lysineLysK

9.74精氨酸

arginineArgR

10.76组氨酸

histidineHisH

7.593.酸性氨基酸4.碱性氨基酸目录第14页，课件共121页，创作于2023年2月几种特殊氨基酸

脯氨酸（亚氨基酸）第15页，课件共121页，创作于2023年2月

半胱氨酸

+胱氨酸二硫键-HH第16页，课件共121页，创作于2023年2月（二）氨基酸的理化性质1.两性解离性质2.紫外吸收性质3.茚三酮反应第17页，课件共121页，创作于2023年2月pH=pI+OH-pH>pI+H++OH-+H+pH<pI氨基酸的兼性离子

阳离子阴离子氨基酸是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。1.两性解离及等电点第18页，课件共121页，创作于2023年2月等电点(isoelectricpoint,pI)

在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。除碱性氨基酸外，其余氨基酸的等电点均小于pH7第19页，课件共121页，创作于2023年2月2.紫外吸收色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸的最大吸收峰在

280nm

附近。大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。芳香族氨基酸的紫外吸收第20页，课件共121页，创作于2023年2月3.茚三酮反应氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。第21页，课件共121页，创作于2023年2月蛋白质的分子结构

TheMolecularStructureofProtein

第三节第22页，课件共121页，创作于2023年2月蛋白质的分子结构包括

一级结构(primarystructure)二级结构(secondarystructure)三级结构(tertiarystructure)四级结构(quaternarystructure)高级结构第23页，课件共121页，创作于2023年2月定义蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的种类、数量和排列顺序。一、蛋白质的一级结构主要的化学键肽键，有些蛋白质还包括二硫键。第24页，课件共121页，创作于2023年2月（一）、肽键*肽键(peptidebond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。是氨基酸的连接方式.第25页，课件共121页，创作于2023年2月+-HOH甘氨酰甘氨酸肽键第26页，课件共121页，创作于2023年2月氨基酸残基氨基酸在形成肽链时丢失了一分子水，肽链中的氨基酸分子已不完整,称为氨基酸残基(aminoacidresidue)。第27页，课件共121页，创作于2023年2月（二）肽（peptidepeptide）氨基酸借肽键相连而形成的化合物称肽。根据氨基酸的组成个数可以依次称为二肽、三肽、四肽……寡肽(oligopeptideoligopeptide)由10个以内氨基酸连成的小肽多肽(polypeptide)由更多氨基酸连成的肽蛋白质(protein)就是由许多氨基酸残基组成的多肽链第28页，课件共121页，创作于2023年2月N末端：多肽链中有自由氨基的一端C末端：多肽链中有自由羧基的一端多肽链有两端*多肽链(polypeptidechain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。第29页，课件共121页，创作于2023年2月（三）多肽链有方向性NH2MetPhePheCysSerThrValCOOH氨基末端(Ｎ－端)羧基末端(C－端)书写多肽链时一般把氨基端放在左侧，羧基端放在右侧。蛋-苯丙-苯丙-半胱-丝-苏-缬第30页，课件共121页，创作于2023年2月主链：多肽链中由肽键连接成的长链侧链：各氨基酸残基的侧链基团所构成的短链第31页，课件共121页，创作于2023年2月一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。目录第32页，课件共121页，创作于2023年2月（一）维持蛋白质构象的化学键氢键

疏水键盐键配位键二硫键范德华力二、蛋白质的构象第33页，课件共121页，创作于2023年2月氢键负电性很强的原子（如氧或氮）和与氧或氮共价结合的氢原子相互吸引，这种作用力称为氢键。第34页，课件共121页，创作于2023年2月疏水相互作用

由非极性基团受到水分子排斥相互聚集在一起的作用力。第35页，课件共121页，创作于2023年2月离子键由异性电荷间的静电吸引形成的。第36页，课件共121页，创作于2023年2月目录第37页，课件共121页，创作于2023年2月（二）蛋白质的二级结构蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象

。定义

主要的化学键：

氢键

第38页，课件共121页，创作于2023年2月

蛋白质二级结构的主要形式

-螺旋(-helix)

-折叠(-pleatedsheet)

-转角(-turn)

无规卷曲(randomcoil)

第39页，课件共121页，创作于2023年2月1.肽单元参与肽键的6个原子C1、C、O、N、H、C2位于同一平面，C1和C2在平面上所处的位置为反式(trans)构型，此同一平面上的6个原子构成了所谓的肽单元

(peptideunit)

。蛋白质空间结构的基本组成单位—肽键平面（肽单元）（peptideunit)第40页，课件共121页，创作于2023年2月肽单元（肽键平面、酰胺平面）肽键中的Ｃ＝Ｏ和Ｃ－Ｎ均不能自由旋转，肽键(-CONH-)中的４个原子和２个α碳原子(Cα)被约束在一个刚性平面（即肽键平面）上，构成一个肽单元(peptideunit)。第41页，课件共121页，创作于2023年2月肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。C-N具有双键性质，不能自由旋转组成肽键的原子处于同一平面。肽单位是刚性平面C-N相连的氢和氧与两个a碳原子反向分布第42页，课件共121页，创作于2023年2月2.-螺旋目录以肽键平面为单位,以α-碳原子为转折盘旋形成右手螺旋第43页，课件共121页，创作于2023年2月a.以肽键平面为单位,以α-碳原子为转折盘旋形成右手螺旋b.主链原子构成螺旋的主体,侧链(R基团）在其外部。c.每3.6个氨基酸旋转一周，螺距为0.54nm，每两个氨基酸之间的垂直距离为0.15nm，肽键平面与螺旋长轴平行。d.氢键是a-螺旋稳定的主要次级键，一个肽单位N上的氢原子与第四个肽单位羰基上的氧原子形成氢键，所有的肽键都可以形成氢键。作用：增强了机械强度，具有弹性第44页，课件共121页，创作于2023年2月d.α-螺旋参数：每3.6个氨基酸残基绕成一个螺圈(3600)螺距为0.540.54nmnm每个氨基酸残基上升0.54/3.6=0.150.15nmnm第45页，课件共121页，创作于2023年2月2.β-折叠（β-pleatedsheetsheet）肽键平面呈伸展的锯齿状排列形成的结构称β－折叠。第46页，课件共121页，创作于2023年2月-折叠结构特点：1.形状2.稳定键3.R基团影响第47页，课件共121页，创作于2023年2月3.β-转角(β-turn)肽链出现1800回折的转角处结构称为β-转角。*常见于球状蛋白质分子表面*第一个残基的C=O与第四个残基的N-H形成氢键*第二个残基常为脯氨酸Pro第48页，课件共121页，创作于2023年2月4.无规卷曲(randomcoil)没有确定规律性的肽键构象常见于球状蛋白质分子中，在其它类型二级结构肽段之间起活节作用，有利于整条肽链盘曲折叠第49页，课件共121页，创作于2023年2月（三）超二级结构在多肽链内顺序上相邻的二级结构常常在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体，被称为超二级结构（模体(motif)）。主要有三种形式α螺旋组合（α

α

），β折叠组合（βββ），α螺旋组合β折叠组合（βαβ）。主要是侧链残基作用的结果。第50页，课件共121页，创作于2023年2月钙结合蛋白中结合钙离子的模体

锌指结构第51页，课件共121页，创作于2023年2月纤连蛋白分子的结构域（四）结构域大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain)。第52页，课件共121页，创作于2023年2月一级结构对二级结构侧链原子的影响的影响R基的电荷性质-多个带相同电荷的氨基酸在肽链中连续出现（polyLys，polyGlu）R基的基团大小-侧链基团较大的氨基酸残基的集中部位(polyIle)脯氨酸，羟脯氨酸

都会妨碍α-螺旋的形成

β－折叠要求氨基酸残基的侧链较小第53页，课件共121页，创作于2023年2月（五）蛋白质的三级结构疏水键、离子键、氢键和VanderWaals力等。主要的化学键整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。1定义二硫键(共价键)次级键：第54页，课件共121页，创作于2023年2月

肌红蛋白(Mb)

N端C端第55页，课件共121页，创作于2023年2月2.分子伴侣分子伴侣(chaperon)通过提供一个保护环境从而加速蛋白质折叠成天然构象或形成四级结构。*分子伴侣可逆地与未折叠肽段的疏水部分结合随后松开，如此重复进行可防止错误的聚集发生，使肽链正确折叠。*分子伴侣也可与错误聚集的肽段结合，使之解聚后，再诱导其正确折叠。*分子伴侣在蛋白质分子折叠过程中二硫键的正确形成起了重要的作用。第56页，课件共121页，创作于2023年2月亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。(六）蛋白质的四级结构由两个或两个以上的亚基之间相互作用，彼此以非共价键相连而形成更复杂的构象，称为蛋白质的四级结构。有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基(subunit)。第57页，课件共121页，创作于2023年2月血红蛋白的四级结构

第58页，课件共121页，创作于2023年2月第59页，课件共121页，创作于2023年2月蛋白质结构与功能的关系TheRelationofStructureandFunctionofProtein第四节第60页，课件共121页，创作于2023年2月（一）一级结构是空间构象的基础一、蛋白质一级结构与功能的关系牛核糖核酸酶的一级结构二硫键第61页，课件共121页，创作于2023年2月

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性第62页，课件共121页，创作于2023年2月（二）一级结构与功能的关系1一级结构相似的多肽或蛋白质，空间结构及功能相似。

胰岛素2.一级结构不同，生物学功能各异。加压素N-半胱-酪-苯丙-谷胺-天胺-半胱-脯-精-甘催产素----------亮--------------------------3.一级结构中关键部分相同其功能也相同。促肾上腺皮质激素（ACTH)39肽1----------------24------------33-----39

活性必需部分种属特异性4.一级结构中关键部分变化，其生物学活性也改变。基因突变、化学修饰定向改造关键氨基酸---药物开发5.一级结构可帮助了解生物进化。亲缘关系越远，氨基酸组成差异越大6.一级结构变化与疾病第63页，课件共121页，创作于2023年2月一级结构与功能的关系1.一级结构相似的蛋白质功能相似一级结构不同的蛋白质功能不同表1-2哺乳类动物胰岛素氨基酸序列的差胰岛素氨基酸残基序号

B30A10A6A5AlaIleSerThr马

AlaValSerAla羊

AlaValGlyAla牛

SerIleGlyThr兔

AlaIleSerThr狗

AlaIleSerThr猪

ThrIleSerThr人第64页，课件共121页，创作于2023年2月ACTH促肾上腺素皮质激素MSH促黑激素第65页，课件共121页，创作于2023年2月第66页，课件共121页，创作于2023年2月N-val·his·leu·thr·pro·glu·glu·····C(146)HbSβ肽链HbAβ肽链N-val·his·leu·thr·pro·val

·glu·····C(146)例：镰刀形红细胞贫血

这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。例：糖尿病24位苯丙氨酸被亮氨酸取代第67页，课件共121页，创作于2023年2月HbS与HbA的区别第68页，课件共121页，创作于2023年2月（一）蛋白质的前体活化（二）蛋白质的变构现象1.肌红蛋白与血红蛋白的结构

二、蛋白质空间结构与功能的关系目录血红素结构第69页，课件共121页，创作于2023年2月肌红蛋白与血红蛋白的结构第70页，课件共121页，创作于2023年2月变构效应(allostericeffect)蛋白质空间结构的改变伴随其功能的变化，称为变构效应。第71页，课件共121页，创作于2023年2月（三）蛋白质构象改变与疾病蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。第72页，课件共121页，创作于2023年2月蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。第73页，课件共121页，创作于2023年2月疯牛病中的蛋白质构象改变疯牛病是由朊病毒蛋白(prionprotein,PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。正常的PrP富含α-螺旋，称为PrPc。PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为β-折叠的PrPsc，从而致病。PrPcα-螺旋PrPscβ-折叠正常疯牛病第74页，课件共121页，创作于2023年2月第五节蛋白质的理化性质与分离纯化ThePhysicalandChemicalCharactersandSeparationandPurificationofProtein第75页，课件共121页，创作于2023年2月一、蛋白质分子大小、形状及分子量的测定分子筛层析法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳生物质谱第76页，课件共121页，创作于2023年2月二蛋白质的变性、沉淀和凝固*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。第77页，课件共121页，创作于2023年2月

造成变性的因素•物理因素：高温、高压、紫外线、剧烈振荡•化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、生物碱、尿素、重金属

变性的本质——

破坏非共价键和二硫键，不改变蛋白质的一级结构。蛋白质的空间结构被破坏，但不改变蛋白质的一级结构第78页，课件共121页，创作于2023年2月

应用举例临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。此外,防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。

变性作用的特征1生物活性的丧失2某些理化性质的改变第79页，课件共121页，创作于2023年2月若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation)。蛋白质的复性第80页，课件共121页，创作于2023年2月

天然状态，有催化活性

尿素、β-巯基乙醇

去除尿素、β-巯基乙醇非折叠状态，无活性第81页，课件共121页，创作于2023年2月三、蛋白质的两性电离与等电点蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。

第82页，课件共121页，创作于2023年2月*蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。第83页，课件共121页，创作于2023年2月四、蛋白质的胶体性质蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。*蛋白质胶体稳定的因素颗粒表面电荷水化膜第84页，课件共121页，创作于2023年2月+++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质水化膜++++++++带正电荷的蛋白质－－－－－－－－带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用溶液中蛋白质的聚沉第85页，课件共121页，创作于2023年2月

五、蛋白质沉淀

在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。机制：中性盐沉淀反应、有机溶剂沉淀反应、加热沉淀反应、重金属盐沉淀反应、生物碱制剂沉淀反应*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。

第86页，课件共121页，创作于2023年2月六、蛋白质的呈色反应⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)

蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。⒉双缩脲反应(biuretreaction)蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。3.酚试剂反应在碱性条件下，酪氨酸、色氨酸可与酚试剂生成；蓝色化合物，蓝色程度与蛋白质的量成正比。第87页，课件共121页，创作于2023年2月七、蛋白质的紫外吸收由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。第88页，课件共121页，创作于2023年2月八、蛋白质的免疫学性质1抗原2抗体3蛋白质免疫学性质的应用第89页，课件共121页，创作于2023年2月一、蛋白质的提取1材料的选择2组织细胞的破碎

3提取第六节、蛋白质的分离和纯化的基本原理第90页，课件共121页，创作于2023年2月二、蛋白质的分离和纯化1、透析及超滤法2、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀3、电泳4、层析5、超速离心第91页，课件共121页，创作于2023年2月（一）透析及超滤法*透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。第92页，课件共121页，创作于2023年2月超滤法应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。第93页，课件共121页，创作于2023年2月有机溶剂沉淀法作用原理:使蛋白质脱去水化层,又能降低溶液的介电常数使蛋白质表面电荷减少，导致蛋白质分子聚集而沉淀。常用有机溶剂:甲醇、乙醇、丙酮缺点：常会使蛋白质变性注意事项:必须在低温下操作，尽量缩短处理的时间，及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去。（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀第94页，课件共121页，创作于2023年2月丙酮沉淀*使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。第95页，课件共121页，创作于2023年2月盐析法(saltingout)定义:向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等作用原理:盐离子与水亲和力极强夺去蛋白质的水化层,减少分子间静电斥力特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。第96页，课件共121页，创作于2023年2月调节盐析所用的盐浓度和溶液的pH值，可将溶液中混合的各种蛋白质逐个分开。称为分段盐析法血浆清蛋白血浆球蛋白半饱和(NH4)2SO4饱和(NH4)2SO4第97页，课件共121页，创作于2023年2月*

免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。第98页，课件共121页，创作于2023年2月（三）电泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)

。根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。第99页，课件共121页，创作于2023年2月几种重要的蛋白质电泳*SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。*等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。*双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。第100页，课件共121页，创作于2023年2月1：菌体(插入原核翻译增强子)2：菌体(未插入原核翻译增强子)3：蛋白A+OGP4：Marker原核翻译增强子的作用第101页，课件共121页，创作于2023年2月（四）层析层析(chromatography)分离蛋白质的原理待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的。第102页，课件共121页，创作于2023年2月蛋白质分离常用的层析方法*离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。凝胶过滤(gelfiltration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。亲和层析：根据配基特异性的分离纯化方法第103页，课件共121页，创作于2023年2月目录第104页，课件共121页，创作于2023年2月目录第105页，课件共121页，创作于2023年2月N-内含肽-C

几丁质结合蛋白

几丁质

19肽19肽

一次性获得19肽

目的蛋白

载体蛋白层析介质亲和层析原理

:第106页，课件共121页，创作于2023年2月几丁质杂蛋白19肽（目的蛋白）载体蛋白123第107页，课件共121页，创作于2023年2月（五）超速离心*超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。*蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentationcoefficient,S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关。第108页，课件共121页，创作于2023年2月因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。第109页，课件共121页，创作于2023年2月三、蛋白质的分离与纯化的类型根据溶解度不同的分离纯化方法1等电点沉淀2盐析沉淀3低温有机溶剂沉淀法4温度对蛋白质溶解度的影响第110页，课件共121页，创作于2023年2月根据分子大小不同的分离纯化