液相色谱方法的开发

液相色谱方法的开发第1页，课件共57页，创作于2023年2月开发液相色谱方法液相色谱方法即液相色谱实验所需的基本参数,包括以下各项内容:流动相:种类及配比(等度或梯度)固定相:色谱柱类型及内径,长短流动相输送系统参数:流速检测器参数:检测波长,灵敏度等温度控制进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称

色谱条件第2页，课件共57页，创作于2023年2月评价液相色谱方法的标准问题∶什么样的分离结果是好的?分离度?第3页，课件共57页，创作于2023年2月什么是液相色谱的分离度？分离度的定义：R:分离程度的量度第4页，课件共57页，创作于2023年2月影响分离度的因素K′,α,N分离度方程∶

K′是容量因子，表达了被分离组分与柱填料的作用强弱

α是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度,是化学因素

N是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度第5页，课件共57页，创作于2023年2月容量因子k改变k'值的方法∶调节流动相的极性、pH、离子强度等梯度淋洗与峰高的关系与R的关系第6页，课件共57页，创作于2023年2月分离因子α定义∶

α=1时两组分分不开改变α的途径

改变固定相改变流动相改变温度改变样品的本身性质第7页，课件共57页，创作于2023年2月色谱柱的柱效N理论塔板数计算公式：W σ 方法Wtan 16 切线法Wh 5.54 半峰高W3σ 9 3σW4σ 16 4σW5σ 25 5σ第8页，课件共57页，创作于2023年2月α，k'，N∶如何控制分离度?第9页，课件共57页，创作于2023年2月开发方法的其它考虑因素分离度是色谱分离中主要考虑的因素除分离度之外,在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考虑: 灵敏度载样量分析速度溶剂损耗成本容易使用色谱柱寿命效率第10页，课件共57页，创作于2023年2月方法开发:第一步干什么?想办法得到各种信息向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法查文献，如CA(化学文摘)仪器制造商的文献，如Waters对色谱柱有足够的了解掌握分离机理，自己开发方法充分了解自己的样品第11页，课件共57页，创作于2023年2月参照文献方法时的注意事项采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度…),否则不能重现文献结果注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能重现文献的梯度方法注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类和浓度…)注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创新,尽可能采用HPLC新技术第12页，课件共57页，创作于2023年2月一般的具体步骤先用一根短的色谱柱用相对较高的流速使用尽可能高纯度的标准品先用高强度的洗脱液调节k′值改变保留值调节α值改变选择性调节柱长度改变柱效及分离速度第13页，课件共57页，创作于2023年2月反相色谱方法开发实例1色谱柱:C18,4mmx30cm流动相:甲醇,1%醋酸,80/20流速:2.5ml/min样品:1)扑热息痛2)咖啡因3)水杨酰胺4)阿斯匹林检测器:UV254nm,0.05AUFS理论上等度方法的开发应从强溶剂开始,它能在柱空体积处或接近空体积处洗脱每一个组分.第14页，课件共57页，创作于2023年2月色谱柱:C184mmx30cm流动相:甲醇,1%醋酸,60/40流速:2.5ml/min样品:1)扑热息痛2)咖啡因3)水杨酰胺4)阿斯匹林检测器:UV254nm,0.05AUFS反相色谱方法开发实例1洗脱液中水(弱溶剂)的加入可稍微增加k值第15页，课件共57页，创作于2023年2月色谱柱:C184mmx30cm流动相:甲醇,1%醋酸,40/60流速:2.5ml/min样品:1)扑热息痛2)咖啡因3)水杨酰胺4)阿斯匹林检测器:UV254nm,0.05AUFS反相色谱方法开发实例1弱溶剂再增加20%

时,导致使分离更加改善的保留第16页，课件共57页，创作于2023年2月色谱柱:C184mmx30cm流动相:甲醇,1%醋酸,30/70流速:2.5ml/min样品:1)扑热息痛2)咖啡因3)水杨酰胺4)阿斯匹林检测器:UV254nm,0.05AUFS反相色谱方法开发实例1再增加

10%

的水,得到最终的优化分离条件第17页，课件共57页，创作于2023年2月反相色谱方法开发实例2色谱条件∶色谱柱：C18，4mm×30mm流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱流速：2ml/min样品：①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)第18页，课件共57页，创作于2023年2月实例2:改变容量因子K'实例1谱图第19页，课件共57页，创作于2023年2月通过改变流动相改变选择性同样强度的不同溶剂改变色谱柱的影响会更大实例2:改变选择性(α)第20页，课件共57页，创作于2023年2月离子抑制色谱离子型化合物在反相色谱柱上不保留改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离适用于弱酸性化合物的分离降低流动相的pH值，使样品降低离子化使用硅胶基质C18填料使用条件应在填料基质的安全范围内硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）之间H++Ac-HAc在稀溶液中:第21页，课件共57页，创作于2023年2月离子抑制色谱实例在乙腈/水及pH=7时，

多数保留时间很短，无

法完全分离。第22页，课件共57页，创作于2023年2月常用缓冲液及其pH值第23页，课件共57页，创作于2023年2月离子对色谱法在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂与样品中可电离的组份形成“对离子”目的:在反相色谱柱上分离离子型化合物离子对试剂的类型PICA：磷酸季丁铵，适用于酸性组份PICB：烷基磺酸盐，适用于碱性组份烷基长度不同，形成对离子的能力不同通常有：B5，B6，B7，B8PICD4：磷酸二丁胺，适用于弱碱第24页，课件共57页，创作于2023年2月离子对色谱机理第25页，课件共57页，创作于2023年2月离子对色谱的应用抗组胺及减充血剂药物的分析CCCCOOOHOHNNCHCH2NHCH3HONHCCH3OOCH2CH3CHCHHOCH3NH2OCH3CH2NNCH2CH2NCH3CH31.马来酸

MaleelcAcid2.去氧肾上腺素

Phenylephrine3.N-去甲麻黄碱

Phenylpropanolamine4.盐酸萘甲唑啉

Naphazooline5.菲那西丁

Phenacetin6.新安替根

Pyrilamine第26页，课件共57页，创作于2023年2月使用五烷基磺酸盐(PICB5)第27页，课件共57页，创作于2023年2月使用六烷基磺酸盐(PICB6)第28页，课件共57页，创作于2023年2月使用七烷基磺酸盐(PICB7)第29页，课件共57页，创作于2023年2月样品浓度对分析的影响0.02AU0.2AUPIC-B7的浓度很低,为0.001M,在样品浓度较大时,第③号峰由于PIC不足而分叉,见右图第30页，课件共57页，创作于2023年2月离子对色谱分析水溶性维生素第31页，课件共57页，创作于2023年2月用不同的离子对试剂色谱柱∶mBondaPakC183.9mm×300mm溶剂∶1.MeOH/H2O,PIC-B72.MeOH/H2O,PIC-B53.MeOH/H2O,PIC-B7/B5②①③④1.如用PIC-B7，在②③分开的情况下，保留时间太长②①③④2.如用PIC-B5，峰①②④分不开②①③④3.如用PIC-B7加B5，各组份分开，且保留时间合适第32页，课件共57页，创作于2023年2月离子对色谱-水溶性维生素第33页，课件共57页，创作于2023年2月对氨基苯甲酸与PICA试剂色谱柱:µBondapakC184mmx30cm流动相:MeOH:H2O,50:50含PICA流速:2.0ml/min检测器:UV,254nm第34页，课件共57页，创作于2023年2月对氨基苯甲酸与PICB7试剂色谱柱:µBondapakC184mmx30cm流动相:MeOH:H2O,50:50含PICB-7流速:2.0ml/min检测器:UV,254nm第35页，课件共57页，创作于2023年2月离子对色谱的优缺点优点:可用反相色谱分析离子离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善,特别是对中性和离子型溶质缺点:PIC试剂的平衡较慢推荐专用色谱柱作离子对分析当心

PIC试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀当心用过的离子对试剂的化学污染第36页，课件共57页，创作于2023年2月用离子对？还是离子抑制？第37页，课件共57页，创作于2023年2月什么是梯度方法90/10,CH3CN/H2O80/20,CH3CN/H2O梯度:流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化第38页，课件共57页，创作于2023年2月梯度洗脱的特点优点单位时间的分离能力增加检测灵敏度提高缺点仪器设备要求高不适合某些检测方式色谱柱需再生定量分析的重复性较低第39页，课件共57页，创作于2023年2月梯度洗脱的方式高压梯度及低压梯度溶剂A溶剂B泵A泵B混合器A高压梯度溶剂A溶剂B比例阀（溶剂混合点）混合器B低压梯度（溶剂混合点）泵第40页，课件共57页，创作于2023年2月梯度滞后:系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意∶滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路比例阀检测器进样器ABCD色谱柱溶剂输送系统(泵)低压梯度阻尼器混合器第41页，课件共57页，创作于2023年2月滞后体积大小的影响滞后体积太大会引起梯度变化的延迟例如∶滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min实际梯度会比设置值晚2分钟响应，没有问题对微柱色谱影响更大，如上例，流速0.1ml/min实际梯度会比设置值晚20分钟响应，不能接受滞后体积的不同会使方法转换麻烦滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现普通HPLC的滞后体积为2~4ml对分析型HPLC没有影响对作微柱实验用梯度时影响较大，因此应选滞后体积小的液相色谱仪，以适应梯度实验第42页，课件共57页，创作于2023年2月梯度洗脱的可变参数A,B液的化学特性和配比梯度的起终点及陡度梯度变化的路径(梯度曲线形状)第43页，课件共57页，创作于2023年2月梯度曲线的变化∶凹线第44页，课件共57页，创作于2023年2月梯度曲线的变化∶凸线第45页，课件共57页，创作于2023年2月梯度平衡时间的影响10分钟的梯度，6分钟的平衡时间色谱图不重复第46页，课件共57页，创作于2023年2月梯度平衡时间的影响平衡时间从6到7分钟，第一个峰的保留时间有明显的变化，说明6到7分钟的平衡时间不足，而8到9分钟变化不大因而大于这个时间时，平衡充足第47页，课件共57页，创作于2023年2月水中有机污染物的影响50ml超纯水的有机物污染状态第48页，课件共57页，创作于2023年2月水中有机污染物的影响典型的“实验室水”有大量的有机污染物不适合高灵敏度梯度分析第49页，课件共57页，创作于2023年2月梯度方法开发实例-第一步Curve60-100%开发一个有9个烷基苯酮化合物的梯度方法，用C18柱，在最初的条件下(0-100%乙腈-水)，分离不理想。整个色谱峰组保留时间太长，分离度也不好。第50页，课件共57页，创作于2023年2月梯度方法开发实例-第二步Curve650-100%为使色谱峰前移，提高起始时乙腈的比例(50-100%，乙腈-水),分离得到改善。但是9个化合物出了10个色谱峰，说明有杂质存在，很可能是流动相水中的第51页，课件共57页，创作于2023年2月梯度方法开发实例-