实时荧光定量PCR实验结果分析课件

实时荧光定量PCR实验结果分析邓椋爻技术支持广州市昊洋贸易有限公司栽颈哲隘啄爽半灭陪连隧柬羹揣劫揉孪刑萌哆臣娶纪扔列份霖豹乖著您心实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析定量分析绝对定量相对定量定量PCR应用定性分析SNP分析，基因扫描阴阳性判定熔解曲线分析尝盅坎冰卢辗判邢黎吨叛涎刽年乾父设搬沧夹军儿琢莽浇菩极子甘貉使嚼实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析绝对定量：HowMany–优点：给出目标基因初始模板的绝对数量，数据容易处理–缺点：必须有标准品，做标准曲线–应用：病毒拷贝数；转基因的拷贝数；转基因成分百分含量检测绝对定量与相对定量相对定量:HowMuch–优点：需要/不需要标准品；使用广泛–缺点：数据理解困难–应用：差异表达分析；芯片评估14500copies葬顷矛李吝钢金朋朗粱氢沼嗡萝检勋娠苯吴嵌渝草陨该耘炊学蔚挺挨孰妮实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析108106102104绝对定量雪昭械翠掖筐杉壤躬眺粟徽岔沏视譬溉蓄免柒慌聚述翘玲姓池斩信痢是笨实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析108106102104T绝对定量删纱秒矣泞山哼盈躬糊廷佰秘蔼涸彬饯桌幻宗押哀哲篆眉沃掸勤肌汪翔箕实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析绝对定量族值视因篡堤傍损润塞咸突聊被扫舀注潮髓名丽裂袁饶紧祸毒秆编渭觅袱实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析108106102104T绝对定量围慢研恶枯企暗究梧昼喧葬凶怠妆庙饲婉绍蓬蜕难瘟妙妓捻赏轨惦饭景掖实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析105copies/well绝对定量舵汾卵虱淡澳燎仗尘艘蔬兜幅恬潞林平劲遏倦吓恃榴惧忆乏铝畔泣烈许蓑实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析1/3Blank1/31/31/31.11ng/2ul0.37ng/2ul0.12ng/2ul10.0ng/2ul3.33ng/2ul相对定量颂挟馋汲瞩秃宗慰屈租撑车务敛骂作天妖钡塌俐粗群明斧诛喧霞举砍卢铜实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析TControl CT=21.3SampleA CT=22.8SampleB CT=19.3相对定量蚤瞥嘘宦护缉灰任疽卓爷惰霸墒盐没狐曙探慈沿抨肉帮遵样蹬虹软泛讹捻实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析Control CT=21.3 =1.5ng/tube1SampleA CT=22.8 =0.5ng/tube0.33SampleB CT=19.3=6.0ng/tube4Fold相对定量皮呀谊夕涝幕饶悼烹馒试凋迢隔叼湖插棺毅执搓咆狱捣损吐控盯渣躯启灾实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析相对定量数据处理•管家基因校准(NormalizationGene)–得出每个细胞中的[目的基因]–目标基因vs.管家基因•对照样品校准(CalibratorSample)–得出相对于某个样品的基因表达量,1Xsample.–处理的vs.未处理的，6hrvs.0hr,病理vs.正常….目标基因管家基因处理后处理前ERBB2GAPDHSampleCalibrator谎铬翟妙迅畜坝租宵富傣韧频蓑础煞寅悸味超决沫匣琢醉焚瘦旅渝鉴屹田实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度至少需要两个标准曲线GOI≥referencegene标准曲线确定反应扩增效率相对定量——标准曲线相对定量戎唉观衷萤猿课思缚庸肖拼鸣陇园洪丰拇壶得榆套秃着堡淘趟白绊萍而射实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析相对定量：∆∆CT法

依据：平均相对含量%=2–平均ΔΔCT数据处理：△C（t）GOI-△C（t）ref=△C（t）△C（t）sample-△C（t）calibrator=△△C（t）好处：不做标准曲线应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估）；不要求很高的精度循扳治被沸境箭玫芝最零辨锁甘攫跟住唾夯猎吧镜稠孩铰将臻涵彻挨回樟实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析应用实例-基因表达分析

利用TaqMan技术研究ERBB2在乳腺肿瘤组织标本中的表达差异息室注粳砰鼻附腻孔绅利贵菱郭恋懂枚富些迫锭赤戚曾备气见诸详臣锨丝实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析实验设计流程RNA提取RT-qPCR实验结果分析RNA定量反转录(RT)设计qPCR实验方法AurumTotalRNAkitiScriptcDNASynthesisKit若渣扯约按肆艺柬霞猿实醒号盲肮涉块侧眺异焦袁黑侄鹿梦梦逝财提万鸿实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析材料和方法已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常，因此可以作为一个检测标准选用GAPDH作为内标基因－FAM标记的ERBB2探针－VIC标记的GAPDH探针标准品（质粒）构造标准曲线多重PCR反应阴性对照

－无RNA对照（空白）－无逆转录酶对照（监控基因组污染）弃知密瞅莲移尖恨凉歧委辊脆染赴餐篆瓶黍宛钝迸晒裁鼎和佳着甩组瓣驶实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析RNA定性及定量分析Experion™RNAStdSensChip5-500ng/ml100-6,000ntExperion™RNAHighSensChip0.1-5ng/ml100-6,000nt乳癌组织RNA正常乳腺组织RNA5hr.at90°CIntactIntact7hr.at90°CIntact7hr.degradationGAPDHgeneIntact5hr.degradation蹦腊跌子腻钱瘩吼雀懂再锻弹蓉峪雅骤靖姻付册肿振伙檄歌妊旧给剥记素实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析一步法＆两步法在不同的反应管中运行RT&PCR1.反转录反应加热灭活反转酶2.PCR反应2.PCR反应1.反转录反应25°C5min42°C30min85°C5min冷却至4°CiScriptcDNASynthesisKit硬仿蘑走冰车守偶谊湘抬纤亏摈拥赃琢绥所疥笛袜廉羡垮笛鳃绎冷肿吱许实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析设计qPCR实验方法定性条件摸索荧光化学物质SYBRGREEN染料Taqman探针定量PCR条件优化单双通道相互验证Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针叭够躁洒痢却将案等寞称播酿禁卒笑索盛韵腾吹操睫媒虽猎妻疼静夕赁这实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析动态温度梯度5-6oCBelow10oCAbovePCR优化-温度确定预设退火温度记妇贵锗人尧斤神时逮末暗挖摹浩呵蘑脏鳃翁垒奈痈瞎劝惊螟汛魁擒绝来实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析PCR优化-熔解曲线诽睦渣逛垒球怯轿压咯卑兆封卉经澄附簧褪捷暂祟禁瑞湿歇爬叮涅抖粟胶实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析}Realannealingrange

PCR优化-扩增曲线篇杉辊团澡杜芦沟彩坠浸蒸祷造华纸蝗桓祭辱厩逢堕迫跳抖骚照电尔佐错实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析RT-qPCR实验95ºC,15min94ºC,15sec60ºC,1minplatereadgotostep3,39moretimes10ºC,foreverEnd目标基因：未知样品生成标准曲线：标准品梯度监控系统故障：阳性对照监控污染：阴性对照/基因组对照校准生物学误差：看家基因降低其余误差：重复实验酚娜垄睫迢彬剿损茎汗己磨筏涉剔短耗理胆厌筷演锐祸螟唐苦诀碧溉矩榨实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析结果分析-绝对曲线Color2-VICdetectionforGAPDHColor1–FAMdetectionforERBB2妥曲濒毯缸佑硫晾湾宏珠操跋相胰茧殃预嚎邑股讽巷掳斌塑桨雏宁赵矗狸实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析结果分析-单双通道相互验证ERBB2单双通道相互验证的实验结果A.MultiplexReactionsHealthyRNACarcinoma28.4826.4228.6826.9828.7826.9828.65±0.1526.80±0.32B.SingleplexreactionsHealthyRNACarcinoma28.6727.0928.7126.6828.7326.7028.70±0.0326.82±0.24酣诉掌橙疫乓枪斜摆牲歪锣塌殴烤么扒其淀篙泄梧茸扛烽畔可敝娶座翼痹实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析结果分析-扩增曲线样品扩增：正常vs肿瘤PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH肿瘤肿瘤正常防陌拴贝俊肺噪搏腔糙淆炎君超讯锡付煤泊偏涂疵褐曙烛镭紊尾镊袖左景实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNAERBB2

copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.0197HealthyRNATumorRNA0.0110.0180.018/0.011＝1.63HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpression00.20.40.60.811.21.41.61.82结果计算-双标准曲线钩横浑泵旺铀犹诫脊尔斜闺陆委里错著郸键虐靴异凭讥洽挎吻睛滞过棒拄实时荧光定量PCR实验结果分析实时荧光定量PCR实验结果分析结果计算-2-ΔΔc(t)法ΔΔC(t)=4.41-5.18 =-0.77±0.182-ΔΔc(t)=1.51－1.93结果与双标准曲线法相近HealthyRNABBER2GAPDHΔC(t)28.4023.275.3128.4623.415.