全自动发酵罐枯草芽孢杆菌产淀粉酶实验报告

xxxxxx号：系：业：生命学院生物技术xxxxxx号：系：业：生命学院生物技术酶实验

实验时间：2012年6月17日—2012年6月28日

学生姓名：

学

院

专

指导教师：

2012年6月30日

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……………4实验试剂和仪器…………5………………5………………6………6……………………6………………68………9…………………4实验试剂和仪器…………5………………5………………6………6……………………6………………68………9………9…………9……………………10……………………1111461011

一.实验目的要求

二、

1、种子培养基：57＃培养基

2、发酵培养基

3、发酵过程中相关参数的测定

三、实验步骤与方法

1、了解发酵罐系统的结

2、种子培

3、发酵罐空消

4.PH电极与DO电极的首次校正………………

5、发酵培养基的配置

5.1培养基摇瓶试验

5.2种子的摇瓶

6.装

7、实消

8.PH电极与DO电极的再次校正………………10

9、接

10、设定发酵参数，运行发酵指令……………

11、发酵过程中相关参数的记录………………

12、发酵过程中取样及相关参数的测定…………12

（1）参数测定所需的溶液的配置………………12

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…………………1313131414151516

（2）取样…………………1313131414151516

（3）样品处理………………

（4）残糖含量测定（DNS法）………………

（5）生物量的测定（比浊法）………………

（6）淀粉酶发酵活力的测定…………………

（7）葡萄糖标准曲线的制作…………………

（8）麦芽糖标准曲线的制作…………………

13.放料,清洗罐体，空消，保养………………四、实验结果与讨论………17五.实验心得体会…………26

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实验试剂和仪器50g30g2g

一、实验目的要求：实验试剂和仪器50g30g2g

1.掌握机械搅拌通风发酵罐的基本结构

(1)发酵罐主体

(2)蒸汽灭菌系统：正确把握各阀门的操作

(3)通气系统

(4)加热冷却循环系统：各管道联络关系

(5)搅拌动力系统

(6)智能控制系统

2.掌握发酵罐小试的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种，

参数设定

3.掌握发酵过程中的参数测定和在线控制，包括：pH，DO，温度，

搅拌速度，生物量，残糖含量，产物生成量，消泡，CO2。

4.运用所学发酵工程基本理论分析发酵过程中的实验数据，讨论某

一特定菌株的发酵规律。

二、

1、种子培养基：57＃培养基

试剂及药品：麸皮

豆饼粉（牛肉浸膏/粉）

NaCl

蒸馏水、斜面培养的枯草芽孢杆菌

器材：1000ml烧杯、玻璃棒、100ml锥形瓶（20个）、天平、粉碎

机、电热炉、高压灭菌锅、灭菌枪头、1000移液枪、酒精灯、75%

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（3％）70.55g（0.2％）42g4g0.6804g1g320g28g

酒精、棉球、无菌操作台、封口膜、橡皮筋、恒温摇床、1000ml锥（3％）70.55g（0.2％）42g4g0.6804g1g320g28g

形瓶、标签纸

2、发酵培养基：

试剂及药品：麸皮

12水磷酸氢二钠（0.2％）

硝酸钾

消泡剂（植物油）（0.3％）

蒸馏水

器材：1000ml烧杯、玻璃棒、75%酒精、棉花、一次性口罩、打火

机、厚手套、天平

3、发酵过程中相关参数的测定的药品、仪器：

试剂及药品：无水葡萄糖0.1g

NaOH

3水乙酸钠

淀粉

乙酸、蒸馏水、DNS、PH标准缓冲液、亚硫酸钠

器材：10mL具塞刻度试管（30个）、100ml容量瓶（2个）、200ml

容量瓶（2个）、100ml烧杯、100ml试剂瓶（4个）、100ml锥形瓶

（2个）、玻璃棒、1000ml烧杯、标签纸、电热炉、木夹、试管架、

PH标准试纸、PH计、枪头、1000移液枪、恒温水浴锅、分光光度

计、电子天平、烘箱、冰箱、上海高机SY-3000发酵系统

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三、实验步骤与方法

1、了解发酵罐系统的结构

（1）．罐体

（2）．发酵罐的搅拌系统

（3）．空气供给系统

（4）．温度控制系统

（5）．pH控制系统

（6）．过程变量的测量

（7）．灭菌系统

（8）测量及控制系统：下位机、上位机、网络通讯

2、种子培养

（1）称取麸皮50g、豆饼粉（牛肉浸膏/粉）30g（用粉碎机搅碎为

粉末）,

上述成分混合于1000ml烧杯中，加NaCl2g、蒸馏水1.0L置于电

热炉上煮沸1小时，将pH自然，待温度下降后分装入20个100ml

锥形瓶中，每瓶30ml。将装有培养基的锥形瓶与备好的枪头、玻璃

棒一起放入高温灭菌锅灭菌2小时后取出待用。

（2）将灭菌后的培养基、枪头、移液枪、玻璃棒、无菌水、酒精棉

球、酒精灯放入无菌操作台紫外照射20min后，可将斜面培养的枯

草芽孢杆菌接种到新配置的锥形瓶培养基中，贴好标签，放到30℃

恒温摇床中培养2天。

3、发酵罐空消

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在灭菌之前一定要先将夹套的水排掉。所有罐体上的部件都必须保证是安装可靠的，以防罐压升空罐灭菌时，pH、DO电极应取下，这样可以延长使用寿将罐体及管路上的所用阀门都关闭。调整好液位和消泡电极的位置并旋紧。如果不用，则可拆

在灭菌之前一定要先将夹套的水排掉。所有罐体上的部件都必须保证是安装可靠的，以防罐压升空罐灭菌时，pH、DO电极应取下，这样可以延长使用寿将罐体及管路上的所用阀门都关闭。调整好液位和消泡电极的位置并旋紧。如果不用，则可拆

i.

ii.

高时造成危害。

iii.

命。

iv.

v.

下并用堵头封住；检查蒸汽是否满足要求。

步骤：

（1）发酵罐、空压机电源打开；

（2）打开蒸汽发生装置，发酵罐与蒸汽发生装置的通水阀门打开，

并检查蒸汽发生装置水箱是否满，注意蒸汽发生装置的压力表读数。

打开蒸汽发生装置的旁通阀使冷空气排出，排完即关。

（3）打开发酵罐水阀，使水淹没温度电极，排空夹套水。

（4）当蒸汽发生装置的压力表读数达到0.4～0.7MPa，可开启空消，

下位机参数设置如下：

灭菌温度：121.0℃灭菌时间20min停转温度：90.℃灭菌转速：0rpm结束温度：37.℃结束转速：150rpm结束压力：0.05MPa结束流量：30L/min尾气开度：5%过程流量：5.00L/min

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（5）当罐温达到100℃以上，分别对取样口、轴封、底阀进行消毒，

每项10min。取样口消毒：打开取样蒸汽进气阀—取下取样口螺盖—

取样口出蒸汽—打开取样蒸汽出气阀—拧上取样口螺盖—计时

10min（正常灭菌状态下取样相通管道会发烫），轴封与底阀的灭菌

过程与取样口灭菌操作类似。

（6）空消完成后关闭蒸汽发生装置，降温冷却。

4.PH电极与DO电极的首次校正

（1）配置PH为4.00与6.86的标准缓冲液

（2）配置饱和亚硫酸钠溶液

（3）PH电极的校正：

①.将PH电极放入6.86的标准缓冲液中，在“测量值1”处输

入6.86，“当前电压”稳定后，点击“第一点确认”，系统会

自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压1”处。

②.将PH电极放入4.00的标准缓冲液中，在“测量值2”处输

入4.00，“当前电压”稳定后，点击“第二点确认”，系统会

自动将“当前电压”处的数值记录到“测量电压2”处。

③.电击“自动校正”，系统会自动计算出零位和斜率。

（4）DO电极的校正：

①.将DO电极放入饱和亚硫酸钠溶液中，在“当前电压”稳定

后，点击“第一点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数

值记录到“测量电压1”处。

②.将DO电极放入饱和湿度的空气中（用湿润滤纸包裹电极亦

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100ml×4%=4g100ml×0.2%=0.2goC

可），在“测量值2”处输入标准值98，“当前电压”稳定后，100ml×4%=4g100ml×0.2%=0.2goC

点击“第二点确认”，系统会自动将“当前电压”处的数值记

录到“测量电压2”处。

③.电击“自动校正”，系统会自动计算出零位和斜率。

5、发酵培养基的配置：

用天平称取麸皮320g、12水磷酸氢二钠70.55g、硝酸钾28g、

植物油42g，将12水磷酸氢二钠、硝酸钾和植物油用蒸馏水溶于

1000ml烧杯中制成营养盐。

5.1培养基摇瓶试验

5.1.1材料

4%麸皮：

磷酸氢二钠：100ml×0.2%=0.2g

硝酸钾：

5.1.2方法

将上述药品装入250mL的三角瓶中，35oC旋转式摇

床上（150rpm）培养26小时。判断培养基的粘稠度，如

果过于粘稠降低麸皮的含量。

5.2种子的摇瓶

按上述方案配好培养基3份（或2份），进行高温灭菌

30min。再将枯草芽孢杆菌种接入摇瓶培养基中，35旋转式

摇床上（150rpm）培养26小时。

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6.装料：

将配好的营养盐与称好的麸皮从进料口倒入发酵罐，加水（约5

升）至淹没温度电极。

7、实消：

操作步骤与空消类似。区别在于：

（1）下位机参数设置如下：

灭菌温度：121.0℃灭菌时间：30min停转温度：90.0℃灭菌转速：100rpm结束温度：37.0℃结束转速：150rpm结束压力：0.05MPa结束流量：30L/min尾气开度：5%过程流量：5.00L/min

（2）实消完由于要取样故蒸汽发生装置不可关闭。

8.PH电极与DO电极的再次校正

（1）DO电极校正：搅拌速度与发酵过程正常转速一致，通气量与发

酵过程正常通气量一致，标定溶氧为“100”本实验设定118.3%时为

100%溶氧。

（2）取样（参比液）：打开取样蒸汽进气阀—取下取样口螺盖—取

样口排出蒸汽

—关闭夹套蒸汽阀—取样口蒸汽排完—关闭取样蒸汽进气阀—拧松

取样阀（开启方向与正常螺旋相反）—取样口流出发酵液—取样

100ml于灭菌锥形瓶（作为参比液存于4℃冰箱）—打开取样蒸汽进

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p自然

p自然

从取样阀排出—打开取样蒸汽出气阀—拧紧取样阀—灭菌10min—

关闭蒸汽发生装置。

（3）测出参比液PH值，以此数值对PH电极校正，本实验测得参比

液PH值为7.14，故将下位机此时PH值调为该值。

9、接种：

当罐温降低至40℃以下时，采用火圈法接种摇瓶种子。

（1）接种前需将20瓶100ml种子液在无菌操作台上混合成两大瓶，

以便于接种。

（2）用75%酒精擦拭进料口的罐面，用蘸酒精的棉花填满进料口凹

槽，接种人员佩戴好口罩，点燃进料口棉花（在接种过程中保持或

不灭），将菌液倒入罐中。

（3）接种完成后加入蒸馏水时发酵液体积达到规定液面。

10、设定发酵参数，运行发酵指令

（1）设置参数:

温度：37℃通气量：10L/min维持正压0.05MPa搅拌速250rpm

运行指令

（2）发酵起始参数：

罐温37.4℃转速150rpmPH7.36DO231.3%流量14.12L/m罐压

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pH5.60.05M乙酸/乙酸钠缓冲液的配置：

0.054MPapH5.60.05M乙酸/乙酸钠缓冲液的配置：

11、发酵过程中相关参数的记录

制定值班表，自发酵开始每半小时记录一次（深夜除外），记录

的内容有：罐温、转速、PH值、DO值、流量、罐压、发酵液颜色、

发酵液浊度、泡沫高度、泡沫大小、发酵罐进气压力、发酵罐尾气

压力。

发酵过程中的注意事项：

①.发酵罐压力（进气、尾气）应小于0.15MPa

②.出现一般异常情况可临时关闭蒸汽发生装置，但不可关闭发

酵罐与空压机电源

③.发酵过程中，取样前应打开蒸汽发生装置，待其压力达到

0.4～0.7MPa时才能取样。

12、发酵过程中取样及相关参数的测定

（1）参数测定所需的溶液的配置：

①

利用公式pH=pKa+lg([AC]/[HAC])

HAC的pKa=4.74

代入得[AC]/[HAC]=7.24

所以只要醋酸钠和醋酸的物质的量之比为7.24即可。

得出需乙酸0.00397ml，3水乙酸钠0.6804g，将3水乙酸

钠0.6804g溶于适量水中，加入冰乙酸0.00397mL，用水定容

至100mL。

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1MNaOH溶液的配置：1％1MNaOH溶液的配置：1％淀粉溶液的配置：pH5.6的柠檬酸缓冲

于100ml烧杯中加入适量的水（能够溶解就好），称取NaOH4g，

慢慢加入水中，边加边搅拌，直至溶解。再将之移入100ml的容

量瓶中，用少量水清洗烧杯，将清洗的水倒入容量瓶中，最后定

容至100ml。

③

方法1.取可溶性淀粉0.5g，加水5ml搅匀后，缓缓倾入100ml沸

水中，随加随搅拌，继续煮沸2分钟，放冷，倾取上层清液，即得。

（本液应临用新制）

方法2.称取1g淀粉溶于100ml0.1mol/L

液中。

（2）取样：

每隔12小时取样一次，进行相关参数测定

发酵过程中取样具体操作：

①.提前打开蒸汽发生装置；

②.待其压力达到0.4～0.7MPa，进行取样口灭菌10min；

③.灭菌时间到达后可取样20-30mL（操作同步骤9取参比液相

同）；

④.取样后取样口灭菌10min；

⑤.关闭蒸汽发生装置。

（3）样品处理：

将取样发酵液4层无菌纱布过滤，取滤液为待测液，贴好标签。

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取10mL刻度试管2支（标记取10mL刻度试管2支（标记为A、B），分别加入0.5mL待在B管中加入0.5mL1MNaOH灭酶活，A管中加入0.5mLpH40℃恒温水浴锅准确反应5minA管加入0.5mL1MNaOH灭酶活。两管加显色剂DNS试剂2.0用分光光度计再540nm处比色，用B管作为对照，测定OD根据葡萄糖标准曲线计算葡萄糖含量（G）和发酵液中酶活力。

①取10mL刻度试管2支标记A、B，分别加入DNS试剂3.0mL，

A管加入0.5mL待测发酵液，B管加入0.5mL蒸馏水作为空

白对照。

②沸水反应5min，反应后迅速冷却定容至10mL，用分光光度

计在540nm处比色，测定OD540nm值。用B管作为对照消零。

③计算残糖量：根据葡萄糖标准曲线方程，计算并记录残糖量

（5）生物量的测定（比浊法）

以参比液为空白对照，测定待测液OD590nm处的吸光值，以OD

值标示枯草芽孢杆菌的生物量。

（6）淀粉酶发酵活力的测定

①

测酶液。

②

5.60.05M乙酸/乙酸钠缓冲液。然后在两管同时加入0.5mL

1％淀粉溶液作为反应底物。

③

④

mL，沸水反应5min，反应后迅速冷却定容至10mL。

⑤540nm值。

⑥

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酶活力定义：40℃，每分钟催化可溶性淀粉水解生成1mg葡201.80葡萄糖标准曲线制作第15页30.21.60.240.41.40.450.61.20.660.81.00.871.00.81.081.20.6酶活力定义：40℃，每分钟催化可溶性淀粉水解生成1mg葡201.80葡萄糖标准曲线制作第15页30.21.60.240.41.40.450.61.20.660.81.00.871.00.81.081.20.61.21.41.4

萄糖所需要的酶量为一个活力单位（U）

计算公式：

单位体积发酵液的酶活力＝G（mg/mL）/5（min）*2＝(G/5)*2

(U/mL)

（7）葡萄糖标准曲线的制作

1.浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液的制备：在电子天平上准确称取

100mg无水葡萄糖放入100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入

100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存

（可用12～15天）。

2.取8支洗净烘干的10mL具塞刻度试管，编号后按表1加入标准

葡萄糖（G）溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。

充分摇匀后，向各试管中加入2.0mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，

取出冷却后用蒸馏水定容至10mL，充分混匀。在540nm波长下，以

1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值

并记录结果。

3.以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，绘

制出葡萄糖标准曲线。

管号1试剂葡萄糖标液（mL）蒸馏水（mL）2.0葡萄糖含量（mg）表1

201.802麦芽糖标准曲线制作30.21.60.240.41.40.450.61.20.660.81.00.871.00.81.081.20.61.21.41.4

201.802麦芽糖标准曲线制作30.21.60.240.41.40.450.61.20.660.81.00.871.00.81.081.20.61.21.41.4

1.浓度为1mg/ml的麦芽糖标准液的制备：在电子天平上准确称取

100mg无水麦芽糖放入100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入

100mL容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。4℃冰箱中保存

（可用12～15天）。

2.取8支洗净烘干的10mL具塞刻度试管，编号后按表1加入标准麦

芽糖溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的麦芽糖溶液。充分摇

匀后，向各试管中加入2.0mLDNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出

冷却后用蒸馏水定容至10mL，充分混匀。在540nm波长下，以1号

试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并

记录结果。

3.以麦芽糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，绘

制出葡萄糖标准曲线。

管号1试剂麦芽糖标液（mL）蒸馏水（mL）2.0麦芽糖含量（mg）

表

13.放料,清洗罐体，空消

打开HV1.1和HV1.2，对底阀进行灭菌，保持10～20分钟左右，

之后关闭HV1.2、HV1.1。旋下放料口帽，用容器接或用软管引，打

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20030.20.19640.40.56350.60.8561.1721.43560.81.6521.773720030.20.19640.40.56350.60.8561.1721.43560.81.6521.77371.081.21.4

洗罐体。

四、实验结果与讨论一、摇床阶段

1葡萄糖标准曲线（大组数据）

管号1试剂葡萄糖标液（mL）540nmOD

2麦芽糖标准曲线（大组数据）

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200生物量1.7961.7962.0272.4452.63130.20.287OD残糖0.4070.4080.4150.4210.45140.40.647PH5.56.06.06.56.050.61.0211.301OD酶活0.0810.1260.2010.6650.62760.81.5741.8241.959麦芽糖0.0160.0470.099200生物量1.7961.7962.0272.4452.63130.20.287OD残糖0.4070.4080.4150.4210.45140.40.647PH5.56.06.06.56.050.61.0211.301OD酶活0.0810.1260.2010.6650.62760.81.5741.8241.959麦芽糖0.0160.0470.0990.4170.39171.081.21.41试剂麦芽糖标液（mL）540nmOD3摇床数据整理与分析

取样时间

12h

24h

36h

48h

60h

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发酵时罐间h温℃09:00:00.010:00:00.011:00:00.012:00:00.013:00:00.014:00:00.015:00:00.016:00:00.转速rpm4848484848484949罐压PH0:028.20:027.40:067.710:037.60:0370:036.80:3833.21:38发酵时罐间h温℃09:00:00.010:00:00.011:00:00.012:00:00.013:00:00.014:00:00.015:00:00.016:00:00.转速rpm4848484848484949罐压PH0:028.20:027.40:067.710:037.60:0370:036.80:3833.21:3833.4流量Mpa0099.6100100100200200L/m147.787.1347.0647.0957.0947.0316.9790.0010.0020.0390.0780.0680.0660.0470.0430030.3830.330.3229.555.4595.746行稀释。做酶活时由于稀释倍数不够，造成对照组并没有达到灭活的要求，后来测的OD差太少。二、发酵阶段

1.发酵下位机数据：

下位机读取的各项数据发酵批次

2012/06/252012/06/252012/06/252012/06/252012/06/252012/06/252012/06/252012/06/2

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