基因工程原理课件

6、纪律是自由的第一条件。——黑格尔7、纪律是集体的面貌，集体的声音，集体的动作，集体的表情，集体的信念。——马卡连柯8、我们现在必须完全保持党的纪律，否则一切都会陷入污泥中。——马克思9、学校没有纪律便如磨坊没有水。——夸美纽斯10、一个人应该：活泼而守纪律，天真而不幼稚，勇敢而鲁莽，倔强而有原则，热情而不冲动，乐观而不盲目。——马克思基因工程原理基因工程原理6、纪律是自由的第一条件。——黑格尔7、纪律是集体的面貌，集体的声音，集体的动作，集体的表情，集体的信念。——马卡连柯8、我们现在必须完全保持党的纪律，否则一切都会陷入污泥中。——马克思9、学校没有纪律便如磨坊没有水。——夸美纽斯10、一个人应该：活泼而守纪律，天真而不幼稚，勇敢而鲁莽，倔强而有原则，热情而不冲动，乐观而不盲目。——马克思基因工程原理第六章基因工程原理第一节基因工程的概念及其主要内容第二节基因工程中的工具酶第三节基因克隆的质粒载体第四节目的基因的分离第五节基因与载体的重组与导入受体细胞第六节重组体的筛选第七节目的基因的表达第一节基因工程的概念及其主要内容一、基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.新课改下，初中化学实验的要求有了新的内涵，不能仅仅局限于教学大纲所强调的实验基本技能目标，还应该使学生能够从问题或任务出发，通过实验尝试科学探究、思考和研究化学问题，培养自身科学探究的能力。但当前，农村初中化学实验教学依然无法全面适应新课改的要求，存在着诸多问题。因而，如何有效推进农村初中化学实验教学，大力培养学生科学探究能力，是当前农村初中化学教师值得思考的一个课题。一、新课改下农村初中化学实验教学存在的问题近年来，我国农村地区学校教学条件得到了极大的改善，大都配备有标准的实验室，甚至实验条件一流。然而，纵观当前许多农村初中化学实验的教学，可以发现，实验教学被弱化的现象依旧普遍存在。主要问题有：（1）对新课程化学实验教学不适应。与传统教材相比，新课程教材对演示实验和学生实验的区分并不明显，而是将其分散在“观察活动”和“学生实验探究”栏目中。部分农村化学教师在处理这些实验时，往往无所适从，只能照搬传统的实验教学手段。（2）化学实验教学存在探究泛化的现象。探究性实验教学作为新课改下一种流行的教学方式，备受教师的青睐。然而，很多时候也存在矫枉过正的问题，甚至有部分农村教师将探究性实验与验证性实验对立起来，不管实验本身是否适合探究，都按照探究性实验去教学。（3）教学管理、课时安排不能满足实验的需求。探究性实验教学一般比较耗费课时。有些教师担心会影响教学进度，而压缩实验课时，或者只做些耗时短的演示实验，探究性实验不足，分组实验做得少，缺乏对学生科学研究意识和研究能力的培养。二、农村初中化学实验教学培养学生科学探究能力的有效途径（1）创设探究情境，激发探究兴趣。初中学生好奇心强，对新鲜事物充满兴趣，因而化学实验教学的首要任务是要激发学生的学习兴趣。创设真实的情境，满足学生的好奇心，有助于学生探究兴趣的产生。例如，在设计“CO2溶于水”实验时，教师可以设置这样的情境来引入问题：“大家一定喝过可乐，同学们还记得喝可乐时有什么感觉吗？”学生们开始带着问题回想起来，这时教师就可以引入“CO2溶于水”的实验。教学中，教师可以将一瓶可乐打开倒入玻璃杯中，学生通过透明的玻璃杯可以发现有大量的气体CO2逸出。但怎样演示“CO2溶于水”的实验呢？问题提出后，学生们你一言我一语大胆地表达自己的看法，甚至有些学生开始设计起实验步骤来。有了这样的疑问，学生在思考的过程中，探究兴趣得以激发。（2）深化经典实验，拓宽探究空间。每类实验的原理、装置、操作都有规律可循，因此做好典型实验，深化经典实验，可以让学生触类旁通，将知识技能内化，拓展学生科学探究的空间。例如，在“空气中氧气含量测定”实验教学后，教师可以深化实验，提出问题：“在其他条件一样的情况下，能否用如木炭、硫、铁丝乃至石蜡等物质代替红磷来做这个实验呢？”学生们的探究兴趣被激发起来，开始激烈地讨论。这时，教师可适当给予学生一些引导：要测定空气中氧气的含量，则需要消耗掉空气中的氧气或氮气，同时又不能产生新的气体或者新产生的气体会被反应掉。很快，学生得到了答案，即不能用木炭、硫粉、铁丝、石蜡代替红磷来做该实验。经典实验的深化，使得学生能够进一步理解实验的原理、操作细节，也在一定程度上培养了学生的探究习惯，拓展了学生科学探究的空间。（3）改造演示实验，培养探究能力。为了培养学生探究的能力，在教学相关演示实验时，教师可安排学生自行设计实验方案，使其变为探究性实验。例如：在关于“二氧化碳的实验室制法”演示实验中，教师可以先提出这样的问题，实验室制取H2能用HCl代替H2SO4，能用Mg、Fe等金属代替金属Zn，那么制取CO2是否可用H2SO4代替HCl？是否用其他含碳酸根的物质代替石灰石、大理石？接着，给出实验所需的相关药品和仪器，让学生分组进行探究，拟订一个实验方案来制取二氧化碳。最后，师生一起讨论实验方案，并评价实验方案的优缺点。这种教学方式虽然花费的时间可能稍长，但在实际操作中学生能够独立探索、研究，其实验设计能力和动手能力大大得以提升。留守儿童是中国社会转型期过程中产生的特殊弱势群体，随着农民工的进城务工，远走他乡，越来越多的农村留守儿童也在形成，目前，留守儿童家庭道德教育环境较差，只有父母一方或者老人和孩子们生活在一起，家庭本身的重负和他们自身的教育缺陷使得家长对孩子的道德教育出现了真空。留守儿童特殊的生活环境和教育环境不仅造成了家庭温暖和家庭教育严重缺失，也导致农村留守儿童在思想道德方面的一系列问题越来越突出，并滋生了很多社会问题。一、当前农村留守儿童道德教育存在的问题留守儿童正处在思想启蒙和人生观、世界观初步形成的关键时期，由于父母外出打工而无法享受到父母在思想认识上及价值观念上的引导和帮助，农村留守儿童在成长过程中极易产生认识、价值上的偏离和个性、心理发展的异常，他们孤独感较重，思想和心理表现都较为封闭，心灵一般不易被感化，害怕遭到轻视与歧视，有些人甚至会走上犯罪道路。因为父母榜样作用的缺失，农村留守儿童的道德问题要比非留守孩子多。一是人生观不正确。由于父母长期在外打工，残缺的家庭结构很难使留守儿童发展到父母所期望的程度，留守儿童的父母外出回到家乡显示爱的方式往往只限于单纯的资金给予。孩子极易形成打工挣钱可以改变他们的生活现状的思想，把自己的将来过早定格在打工挣钱这个唯一目的上，思想功利化、世俗化甚至庸俗化。二是道德意志薄弱。留守儿童道德意志的薄弱，从一定程度上直接导致了他们在道德上的失范。据调查显示，犯罪的“留守儿童”中，有56.4%与留守的父亲或母亲单独生活在一起，32.2%与祖父母生活在一起，4.1%与亲戚生活在一起，0.9%被寄养在他人家里。其中父母外出打工三年以上的占26%，没去过父母工作地的有65.3%，很少与父母电话联系的有23.3%，非常想念父母的有64.1%。由于家庭教育的缺失，缺乏道德约束，一些留守儿童没有养成良好的生活习惯和道德品行，违法违纪案件呈现上升趋势。三是道德心理不健康。由于正常的心理环境的缺失和农村教育环境的不理想，留守孩子缺乏父母的关爱，缺乏与父母的情感交流，使得农村留守儿童形成不良的个性心理特征，集中表现为任性、冷漠、自卑、敏感、孤独、不安、胆怯和自我封闭等。这些有着强烈自卑感的留守儿童在某种程度上会失去对社会的安全感和对他人的信任感。这些性格缺陷和心里障碍严重影响着留守儿童的身心。调查显示，农村留守儿童存在或轻或重的心理障碍。北京的中国社会调查所公布的调查也显示，超过半数的父母明显感觉到孩子留守后变得沉默、孤僻。二、农村留守儿童道德教育问题的原因分析1.家庭道德教育缺失。多数家长长年在外打工，一年中难得与孩子相见，父母少了与孩子之间正常的感情交流，使家庭教育的功能被人为的弱化，非常容易导致儿童心理和行为的偏差。亲情的缺失使留守儿童对情感的渴望难以得到满足，极易在心理与现实之间形成落差，在现实中表现为情感冷漠，内心封闭，不相信他人，逆反心理强，内心比较敏感，有心事或遇到困难时，没有可倾诉的对象。更有甚者，一些留守儿童由于交友不当，往往被引入歧途。情感缺乏是留守儿童成长最严重也是最现实的问题。留守儿童与父母长期分离，与父母的亲情关系趋于淡漠，无法在良好的亲子关系中与父母进行正常的情感交流，无法获得直接的情感体验，从而难以形成健康良好的道德情感品质，在正常的道德情感方面常常会表现出诸多的偏差。2.学校道德教育不全面。中国现有的学校道德教育还停留在书本上和考试上，没有开展形式多样的道德教育，学校的道德教育甚至还因为应试教育而被人为减少课时，个别农村学校甚至对于道德教育这一块的学习不做考虑和安排，学校老师对于道德教育也没有很好地探索。教育起点的不公平让原本处于弱势地位的留守孩子更加自卑，更加弱势，加上注重应试教育的目的性，极少关注道德教育的过程性，致使农村留守孩子在学校道德教育中就留下了道德隐患。3.道德教育机制不健全。在当前的发展形势下，留守儿童的道德教育，政府应出台相关的政策予以关注和支持，但是，政府和相关教育机构对留守儿童道德教育问题没有制定相关的政策，留守儿童的道德教育权利没有得到应有的保障。政府在留守儿童教育机制的建立健全上没有探索出好的出路，特别是现有户籍制度的改革与经济社会发展形势要求不相一致，留守孩子的道德教育机制出现了问题，致使留守儿童的道德教育出现了困难。三农村留守儿童道德教育的实践策略1.完善政府在农村留守儿童道德教育中的角色。留守儿童道德问题之所以日益严重，其很大一部分原因是因为制度和机制的不健全，致使进城务工人员与留守儿童之间产生了监护困难，这些困难其实是可以通过改善和健全机制来予以解决的。譬如说，可以通过设立留守儿童探亲假，让在外务工的父母可以享受必要的时间，让孩子与父母能定期聚会。可以通过制定相应的户籍改革制度，对于那些在某个城市工作五年以上的，有稳定收入的农民工，予以解决城市户口，让他们的妻儿老小能够顺利进城，让他们的孩子能够顺利到他们务工的城市上学，并且能够享受相应的城市人待遇。同时，还可以在外出务工人员较多的农村乡镇通过政府补贴，成立相应的留守儿童心理辅导中心，聘请有文化、有爱心的人士当留守孩子的临时父母，履行父母职责。2.完善家庭在农村留守儿童道德教育中的责任。家长要十分重视对孩子进行文明礼貌、尊老爱幼、诚实守信、与人为善、助人为乐等优秀品德的教育，从而约束和制止不文明、不道德、不守法的行为的发生，培养孩子向上、向善、向美的优良品格。由于留守儿童问题是子女与父母联系过少、缺乏沟通管教引起的，首先应该使留守儿童的父母对该问题有一定的熟悉和了解，为了能够让子女健康成长，作为父母，应做到与孩子多些情感的交流。父母应多了解孩子的生活、学习情况，多鼓励孩子们自行独立，多听听孩子的心声，多解开孩子心中的结，让孩子时刻感受到父母就在身边，感受父爱、母爱的温暖。有意识地培养孩子奋发向上的精神。父母应多向孩子讲讲外面打工的艰辛，世界的精彩，知识的重要性，让孩子从小树立学好知识的思想，要使孩子养成艰苦朴素的好品德。留守儿童的父母要加强与子女的临时监护人、老师的联系沟通，把子女的教育监护权利更多地给予临时监护人，让他们尽可能地及时解决留守儿童心理出现的问题。3.创造农村留守儿童道德教育的良好环境。农村留守儿童道德教育的最大问题是没有一个良好的道德教育环境，创造良好的环境是搞好道德教育的当务之急，只有创造一个良好的农村儿童道德教育环境才能真正做到提升农村留守儿童的道德水平，促使农村留守儿童健康成长。一是创建一个有父爱、母爱、兄弟姐妹之爱的完整家庭。父母可通过合理选择临时监护人的方式，通过结构上的父母来创建事实上较为完整的家庭。即父母在外出前，合理选择熟悉孩子、有爱心的、能给孩子营造良好家庭氛围的、能保障孩子健康成长的监护人。尽量避免隔代管教和盲目托管现象的发生。二是创造一个良好的学校生活环境。现有农村孩子大多从小学开始就要寄宿，学校在孩子道德教育上起着十分大的作用，要提高农村中小学校教师的素质，有意识地选派有能力有素质的城市教师到农村结对帮扶，做好德育教育工作。要加大学校道德教育的重视力度，加大道德教育的课时，提高道德教育的质量，开展好形式多样的道德教育活动，将道德教育提高到与应试教育相同的位置上予以考核，对不重视道德教育的学校领导和相关老师予以严惩。真正在学校营造起重视德育教育的良好氛围。三是创造一个全社会关心留守儿童成长成才的环境。要通过加大宣传力度，促使全社会都来关心帮助留守儿童，红十字会、民政救助相关部门都要帮助农村留守儿童，还要成立相关基金帮助留守儿童，青年志愿者协会应多组织志愿者下农村与留守儿童结对子，帮助他们树立良好的价值观和人生观。促使留守儿童在一个良好的社会环境下成长，感受到社会的爱心。第六章基因工程原理第一节基因工程的概念及其主要内容第二节基因工程中的工具酶第三节基因克隆的质粒载体第四节目的基因的分离第五节基因与载体的重组与导入受体细胞第六节重组体的筛选第七节目的基因的表达第一节基因工程的概念及其主要内容一、基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程(geneengineering)常和以下名称混用遗传工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)克隆(clone):作名词时指含有某目的DNA片段的重组DNA分子或含有该重组分子的无性繁殖系.作动词时是指基因的分离与重组过程。二、基因工程的主要内容或（步骤）1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。三、基因工程技术及其应用转基因植物转基因动物作为生物发生器基因本身也是一个产业Rockfeller大学将人肥胖基因出售0.2亿美元（1995年3月）Amgen公司将FKBP神经免疫因子配体转让达3.29亿美元（1997年）Millennium公司以4.65亿美元向Bayer公司转让225种基因的开发权（1998年9月）蛋白质工程的概念

在基因工程技术对编码蛋白质的基因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析，进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻译后的修饰等手段改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。蛋白质工程主要内容主要目标蛋白质氨基酸序列的分析蛋白质晶体结构分析蛋白质功能预测和分析蛋白质组分析酶工程的概念是酶学与工程学的相互渗透和结合所发展起来以酶为研究对象，改造并应用酶的特异催化功能。目标就是通过工程化技术大规模生产和转化相应原料成为有用物质的技术。传统的酶工程主要是指天然酶制剂在工业上的大规模生产与应用。随着科学的发展，尤其是基因工程技术的日趋完善，为酶工程赋予了新的内容，特别是利用DNA操作技术，修饰改造酶分子的结构或活性位点、酶与底物作用位点，重组酶的生产，模拟酶的人工设计与合成等成为新的内容。

酶工程的主要内容酶的分离纯化酶与细胞的固定化技术及反应器酶制剂的发酵生产酶分子化学修饰、遗传突变及结构改造酶抑制剂与激活剂开发与研究人工设计与合成模拟酶及酶分子发酵工程概念

发酵工程属于生物技术的下游技术，是工业化大规模培养细胞、生产生物制品的一种技术。传统的发酵工程主要用于微生物。现代生物技术还包括动物、植物细胞和工程菌的发酵培养。

发酵工程技术发酵对象：传统微生物发酵、基因工程菌发酵、动物细胞培养、植物细胞培养发酵类型：液体发酵、固体发酵、固定化培养、流式发酵发酵技术设备生物技术的应用领域医药：生物制药；基因治疗；人工器官农业和畜牧业

转基因植物：抗病虫害新品种、抗逆新品种、高品质新品种

转基因动物：生产有用蛋白质和高品质的畜产品

生物反应器：利用动植物细胞或组织作为生物反应器，直接生产有用蛋白质轻工与食品新型食品；营养食品；保健食品；轻工用酶

环境

污染治理；废物利用；污染物生物降解生物技术产业化生物技术产业：利用细胞和生物分子进行药品、农产品生产开发和环境治理的产业，该产业技术由医药生物技术、农业生物技术和环境生物技术共同组成医药生物技术重点攻克癌症、艾滋病、老年痴呆症、帕金森病、心脏病、糖尿病等危害人类的顽疾农业生物技术着眼于提高农产品的产量和质量。环境生物技术重点用于清除危险废弃物

生物制药产业化特点高技术：高层次人才，高新技术手段，多学科渗透高投入：在国外，一个生物药品平均要投入1~3亿美元，并随着开发难度的增大,有逐步增高的趋势长周期：国际上，一个新的生物药品需要6~8年时间高风险:一个新药品的开发，经过一系列的程序-研发、中试、动物实验、I~III期临床实验，上市和严格的药政监督管理。每一步都可能失败，而前功尽弃高回报:开发成功一个新的生物药品,回报很高。如美国Amgen公司，首次开发上市的EPO、G-SCF到1997年的销售额分别接近和达到20亿美元基因工程试剂的高回报碱性成纤维细胞生长因子231元/ug红细胞生成素1072元/ug白细胞介素-2410元/ug巨细胞粒细胞集落刺激因子1960元/ug胰岛素10.2元/mg美国生物技术产业发展情况

美国生物制药产品种类及数量（PHRAM）疾病种类产品数量疾病种类产品数量感染性疾病39心脏病26神经系统疾病28呼吸系统疾病22艾滋病及相关疾病19自主免疫系统疾病19皮肤病19移植13消化系统疾病11遗传疾病11血液疾病9糖尿病及并发症7不育症5眼病3生长发育不良症3骨质疏松2妊娠预防2肿瘤疾病175

基因治疗人数情况生物技术产业化—农业领域已有35个科120多种植物获得转基因植物，一些重要的农作物获得商品化的转基因品种。种植面积迅猛发展。采用的基因正在从抗除草剂、抗菌素、抗病虫害基因到抗逆境、高品质方向发展。由单个质量性状基因向多基因数量性状转变。植物反应器生产稀有蛋白。世界转基因作物大田释放情况

(1987.1-1998.4)转基因作物特性批准项数所占比例抗除草剂129729.6%抗虫104623.8%提高产品质量88620.2%抗病毒4369.9%改善农学性状2114.8%抗真菌病2084.7%其他3036.9%总计4387100%转基因作物种植面积生物技术与传统中药中药现代化——核心是建立与现代基因学说相应的现代中药理论现代中药理论的建立——确立中药与基因表达的关系

中药药靶（基因）或作用位点基因的寻找

中药化学组：中药有效成分包括较单一的成分和多种成分

中药临床药效的科学评价与分析方法生物技术的应用

中药基因组——利用现代生物技术研究分析中药对人体（细胞）基因表达（蛋白质）的影响。技术平台：大规模基因表达分析（基因芯片、SAGE、蛋白质组等技术）以及相关信息数据库的建立

中药化学组——利用现代仪器分析技术分析有效成分及其药物代谢、动力学。技术平台：色谱及色谱-质谱，色谱-波谱，波谱-波谱联用等分析技术与层析、临界萃取等分离技术

中药新剂型第二节基因工程中的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等一、限制性内切酶（一）、限制修饰系统的种类（二）、限制性内切酶的定义、命名（三）、限制酶的特点（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）（五）、限制酶的用途（一）、限制修饰系统的种类1.

I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸），无特异切割位点。2.

II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。3.

III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是独立存在的。

上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。（二）、限制性内切酶的定义、命名

1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.

influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—Escherichiacoli

RI

HindⅢ—Haemophilus

influensaedⅢSacI(II)—Streptomyces

achromagenes

I(Ⅱ)（三）、限制酶的特点

1.识别顺序和酶切位点

１）识别４-8个相连的核苷酸

MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC：PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGG

FokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起

２）富含ＧＣ

３）对称性—双对称

EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’

４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.

末端种类

１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸

PstI

5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’

２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸

EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOH

PAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAP

HOG-5’

粘性末端能与另一个相同的粘连末端相连接，任何两个具有相同识别位点的DNA分子经限制酶切割后能够重新连接成新的重组DNA分子。在进行DNA重组时，应用限制酶同时切割目的基因和载体DNA，使之产生相对的粘性末端，然后再将二者连接成重组DNA分子３）

平齐末端

SmaI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’

４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI

FokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI

AvaI

5’-CPyCGPuG-3’

CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG

（四）、异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割位点的异同

KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG

（五）、限制酶的用途

1.

DNA重组2.

限制酶（物理）图谱绘制3.

突变分析（RFLP分析）4.限制酶的部分酶切与完全酶切附：IIS型限制酶的特点1.

具有特异型核苷酸顺序识别能力，但该顺序不具有对称结构。2.

酶切位点与识别位点不一致，切点常在识别位点的一侧，1--20nt。3.

酶切后的末端经补平后又可发生酶切反应。4.

产生粘性末端可以是1--5个核苷酸。5.

均为单体，分子量为47—108kD。酶切图谱的构建（a）请构建该环状DNA分子的酶切图谱酶切图谱的构建（b）二、DNA甲基化酶

（一）、甲基化酶的种类与识别顺序1.

限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤。在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同可不同。如：M.EcoRI

GA

mATTCC

EcoRI

GAATTC

不同

M．HpaI

C

mCGG

HpaI

CCGG相同2.

II型甲基化酶对限制酶活性的影响

１）

抑制同种限制酶的活性

M.BamHIGGATmCC—BamHI(GGATCC)M.EcoRIGAmATTC—EcoRI(GAATTC)

２）

抑制不同种限制酶的活性a.顺序完全重叠如：M.ClaI（ATCGmAT）----TaqI（TCGmA）b.顺序边界重叠如：M.BamHI（GGATmCC）----MepI（mCCGG）

３）

抑制不同种限制酶的部分活性M．TaqI（TCGmA）---HindII（GTPyPuAC）：GTCAAC，GTTAAC，GTCGmAC，GTTGAC3.

甲基化酶的用途

１）

改变某些限制酶识别顺序的特异性，以便重组体的形成２）

在建立基因文库时，可先使DNA分子部分甲基化，然后再用限制酶切M.RECH3CH3CH3RERERERERERERERERERERECH3CH3CH3与载体相连甲基化酶人工接头RE用于基因组文库的建立用于cDNA的连接RERERE三、核酸酶

（一）、外切酶III（ExoIII）

1.一般特点：

来自于E.coli，分子量28,000kD

2.催化反应类型

1)外切酶活性：3’→5’，产生5’-单磷酸核苷酸和具各种结构的ds-DNA，pH7.6-8.52)核酸酶H活性：除去DNA-RNA杂交分子中的RNA分子，pH7.6-8.53)3’-磷酸酶活性：除去3’-磷酸基后形成3’-OH端，有利于DNA聚合酶反应，pH6.8-7.44)内切酶活性：在无嘌呤或无嘧啶处将DNA键切开，pH7.6-8.53.

外切酶活性特点

1)反应底物：互补ds-DNA2)碱基释放速度：C>>A-T>>G3)反应产物：5’-单磷酸核苷和具缺口或5’-端突起的ds-DNA，过度反应将导致DNA降解

4.

用途

1)

核酸（DNA）标记2)

基因突变----缺失3)

DNA序列测定时作顺序缺失

5.

使用注意事项

1)

正式使用前，测定在一定条件下酶的反应速度2)

在一定条件下，ExoIII不能作用GC富集区(来自于cDNA加尾)ds-DNA结构:切口,缺口,断口缺口(gap)切口(nick)断口(cut)3'HOP5'3'HOP5'5'P5'P5'P5'P5'P3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HO3'HOOH3'OH3'OH3'OH3'P5'P5'P5'P5'P5'P5'P5'3'HOP5'OH3'P5'RNaseHExoIII的外切酶和RNaseH的作用1234abc1234abc1234abc1234abc1234abc234abc34abc4abcabcExoIII用于顺序缺失ExoIII

ExoIII

[α-32P]

[α-32P]

dCTP

dCTP

5'PP5'5'PP5'3'HOOH3'3'HOOH3'ExoIII用于DNA标记（二）、Rnase（三）、RNaseH（二）、RNase

大部分用于RNA的核苷酸序列分析或除去DNA样品或蛋白质合成系统中的RNA分子。

1.RNaseA分离自牛胰脏，对热稳定，抗去污剂（100℃加热15min仍具活性）,用于除去DNA样品中的RNA分子

2.核酸酶S7，亦称微球菌核酸酶，对RNA敏感，用于除去蛋白质合成系统中的内源mRNA

（三）、RNaseH

作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。

（四）、DNaseI1.特点：具内切酶活性，作用于ds-DNA，但无核苷酸序列特异型，产生5’-P低聚核苷酸;Ca2+,Mg2+或Ca2+,Mn2+可使酶活达最大值当酶浓度很低时，ds-DNA分子上将形成切口，不同类型二价阳离子对两条链上切口位置形成有以下影响：Mg2+存在时，两条链上的切口独立无关，Mn2+存在时，两条链上的切口几乎在同一位置

2.用途

1)切口移位，制备DNA探针2)制备RNA样品时除去DNA分子3)基因突变时产生切口

Mn++存在时

Mg++存在时

DNaseI作用特点DNaseIHOP5’3’5’3’5’3’DNaseI与PolI的切口移位PolI四、DNA聚合酶（一）、E.coliDNA聚合酶I（polI）

1.E.coli的DNA聚合酶系统

PolI参与DNA修复,具3’→5’和5’→3’外切酶活性polII同上具3’→5’外切酶活性polIII参与DNA复制,具3’→5’和5’→3’外切酶活性

2.E.colipolI的特点

1）具两种外切酶活性和DNA聚合酶活性，在蛋白酶作用下，该酶分裂成两个大小不同的片段，其中小片段具5’→3’外切酶活性，大片段具3’→5’外切酶活性(大片段亦称为Klenow片段,polIK)2）聚合酶活性，5’→3’,要求3’-OH引物和模板DNA，其延续性受反应条件的影响3）外切酶活性

3.用途

1）除去3’-端突起的单链DNA（在无dNTP时）2）补齐5’-突起端3）合成第二条cDNA4）切口移位制备探针其中用途2)和3)常用大片段（二）、T4DNA聚合酶

1.特点：

5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为polI的两倍3’→5’外切酶活性，可作用于ss-DNA和dsDNA,其切除速度分别为40和4000nt/min

2.

用途：

制备高比活性探针(1010cpm/μgDNA);DNA末端修饰---缺失

外切酶活性

聚合酶活性

无dNTPdNTP（三）、TaqDNA聚合酶1.特点：

分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性2.用途：

主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA分子因而可被扩增4×106倍。DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，它包括以下三个步骤：DNA模板变性(95℃)→与DNA引物退火(45℃)→

引物延伸(75℃)

TaqPol和PCR

5’3’变性

3’5’

5’3’引物

3’5’复性

5’3’5’3’

3’5’引物3’5’5’3’延伸

5’3’3’5’

3’5’

五、连接酶（一）、T4DNA连接酶

1.特点：

只连接ds-DNA分子，要求3’-羟基和5’-磷酸基

2.用途：

1)相同或相容粘性末端的连接2)平整末端的相连DNA平端来源：限制酶作用结果;限制酶与其它酶共同作用结果。平端的连接比粘性末端的连接要困难得多，所需的酶量也多

5’-AAGCTT-3’5’-AOH

PAGCTT-3’PAGCTTAOH3’-TTCGAA-5’3’-TTCGAP

HOA-5’HOATTCGAP

退火5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’或

5’-AHOPAGCTTAHOPAGCTT-3’3’-TTCGAPOHATTCGAPOHA-5’

T4DNA连接酶5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’或

5’-AAGCTTAAGCTT-3’3’-TTCGAATTCGAA-5’T4DNA连接酶的连接反应(两种插入方向)

+第三节分子克隆的质粒载体

一、质粒的一般生物学特性；二、质粒DNA的分离与纯化；三、质粒载体的构建及类型；四、常用质粒载体举例；一、质粒的一般生物学特性（一）、质粒DNA1、质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。2、编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。2、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。3、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。4、环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：共价闭合环状DNA（cccDNA），开环DNA（ocDNA），线性DNA（cDNA），具有不同的电泳迁移率，可在琼脂糖凝胶电泳中分开。（二）、质粒的拷贝数与不亲和性1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。二、质粒DNA的分离与纯化（放在实验中讲）三、质粒载体的构建及类型（一）质粒载体的发展概况；（二）质粒载体的特点（基本条件）；（三）遗传标记基因（四）质粒载体的类型（一）发展概况

1.

第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101,colE1,pCR,pBR313和pBR322(1977,Bolivaretal)

2.

第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。

3.第三阶段：进一步完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。

（二）载体特点1、至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。2、

至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。3、

至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。注：前三个特点必不可少。（三）遗传标记基因1、标记基因的作用1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞这种指示可以是选择性的（Ampr，Tetr，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ）2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。*这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS，

lacZα），绝大多数为后者。

**有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。2、

标记基因的种类

1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）主要是抗生素抗性基因:Ampr，Tetr，Cmlr，Kanr，Strr2）生化标记基因

其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ3、常用的遗传标记基因及其作用机制

1)四环素抗性基因（Tetr，Tcr）

Tetracycline可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。

2)氨苄青霉素抗性基因（Ampr，Apr）

Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨苄青霉素失活。3)氯霉素抗性基因（Cmlr，Cmr）

Chlorophenicol可结合在核糖体50S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。4)卡那霉素(Kanr),新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因

Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ和lacZα）

β—半乳糖苷酶基因有1021AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。

lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZα-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。β—半乳糖苷酶基因的优点:

a.

酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观b.

lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性c.lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大

PLacZαLacZβ

转录

翻译

αβLacZ基因的结构与产物pUC18BamHI片段重组DNA分子转化E.coli外源DNABamHI片段

涂布在含X-Gal和Ap的平板上,白色菌落为重组子，兰色菌落为原载体利用LacZ基因筛选重组子（四）、质粒载体的类型1、根据载体的分子生物学特性划分

（1）.

质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制（2）.

病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒（3）.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性

2、根据载体功能划分

（1）.普通型载体1)特点:至少有一个以上的克隆位点和两个标记基因，其中一个用于转化体选择，另一个用于重组子检测。2)用途:基因组或cDNA文库的构建;次克隆(subcloning)或限制酶谱分析；外源DNA扩增。例子:pBR322和pUC载体。

上述两例中的非重组子来源有两个：

a.

酶切反应时仍未被作用的pBR322或pUC18分子b.酶切后的载体分子经自我连接又形成载体分子普通型载体pBR322的结构图pUC18和pUC19载体（2）、表达型载体（expressionvector）1)

特点:

a.

基因的启动子序列和终止子序列；b.

一般无检测标记基因；c.

克隆位点是确定的（即位于启动子序列后）；d.

重组分子用凝胶电泳检出（依赖于分子量差异）。2)

结构:

a.

转化单元--宿主细胞转化b.

表达单元--外源基因表达3)类型:

Ⅰ型：转录起始区（调控序列+启动子）+终止子

Ⅱ型:转录起始区终止子+翻译起始区（核糖体结合序列和起始密码子）+终止子

Ⅲ型:转录起始区+翻译起始区+信号肽链编码区+终止子（常称之为表达分泌型载体）三种表达型载体结构图显然,不同类型载体中所缺少的部分必须由外源基因提供。换言之,被表达的外源基因