目的基因的PCR扩增

实验三、目的基因的PCR扩增1、掌握PCR反应的基本原理与实验操作技术2、学习PCR扩增仪的使用一、实验目的聚合酶链式反应(PCR)是一种体外DNA扩增技术，具有灵敏度高、特异性强、操作简便和应用广泛等特点。PCR工作原理类似于DNA的体内复制过程，是将待扩增的DNA片段和与其两侧的已知序列合成两个与模板DNA互补的寡核苷酸,将该寡核苷酸作为引物，引物序列将决定扩增序列片段的特异性和片段长度。二、实验原理PCR（聚合酶链式反应）包括3个基本步骤：⑴模板变性（92℃-96℃）：目的双链DNA片段在94℃下解链；⑵退火（37℃-65℃）：寡核苷酸引物在适当温度（50℃左右）下与模板上的目的序列通过氢键配对，形成局部双链；⑶延伸（72℃）：在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板，dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。

由这3个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25—35轮循环就可使DNA扩增达106倍。Melting94oCMelting94oCAnnealingPrimers50oCExtension72oCTemperature100050Time30x5’3’3’5’3’5’5’5’3’5’3’5’5’5’5’5’3’3’5’3’5’5’3’5’3’5’ddH2O10×PCRbuffer(withMgCl2+)dNTPTaq酶模板DNA引物DNAMarker琼脂糖6×DNA上样缓冲液三、实验试剂（一）PCR反应所用溶液融化后置于冰上。依次混匀下列试剂：四、操作步骤（1）按序将如下成分混合置于Eppendorf管内a.2.5μl10×PCRbuffer(withMgCl2)b.0.5μldNTPmixc.0.5μl引物1d.0.5μl引物2e.1μl模板DNAf.1μlTaq酶

g.19μlddH2O1.PCR反应体系（2）混匀（手指轻弹Eppendorf管底部离心2-5s）（3）加石蜡油少许封住溶液表面（4）PCR扩增T(℃)DurationCycle942min1940.5min30560.5min721min7210min142hrstorage2.PCR扩增反应参数设定

（二）电泳3.结果观察取10μl扩增产物用1%琼脂糖胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。

M1C12345678C291011121314M

转gutD/mtlD双价基因植株的PCR检测（秀水11）M:250bpLadderMarker;C1、C2:未转基因对照;1-7:转mtlD/gutD基因不同植株DNA的mtlD基因PCR扩增产物(1.15kb);8-14:转mtlD/gutD基因不同植株DNA的gutD基因的PCR扩增产物(0.88kb)五、注意事项1、PCR反应非常灵敏，操作应尽量控制在无菌环境下操作。2、吸头、离心管应高压灭菌，每次吸头用毕应更换，防止试剂的相互污染。3、PCR结果若出现非特异性的扩增条带，有必要进一步优化反应条件，包括改变退火