蛋白质分离纯化和表征

蛋白质分离纯化和表征第1页，课件共36页，创作于2023年2月第7章蛋白质的分离、纯化和表征

p290一、蛋白质的酸碱性质二、蛋白质分子的大小与形状三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀四、蛋白质分离纯化的一般原则五、蛋白质的分离纯化方法六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定七、蛋白质性质小结（补充）第2页，课件共36页，创作于2023年2月一、蛋白质的酸碱性质

蛋白质分子由氨基酸组成，在蛋白质分子中保存着游离的α-氨基和α-羧基及侧链上的各种功能团，所以其物理化学性质有些与氨基酸相同。

蛋白质也是一类两性电解质，能和酸或碱发生作用。在蛋白质分子中，可解离基团主要来自侧链上的功能团，这些基团能解离为带电基团，从而使蛋白质带电荷。第3页，课件共36页，创作于2023年2月

在酸性情况下，蛋白质中的各碱性基团接受质子，使蛋白质带正电荷；

在碱性情况下，蛋白质中的各酸性基团解离出质子，使蛋白质带负电荷。

在某一pH值时，白质所带的正电荷与负电荷恰好相等，即净电荷为零，此时溶液的pH值就是蛋白质的等电点。

每种蛋白质都有它特有的等电点，这也是鉴别蛋白质的指标之一。等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类有关中性碱性酸性。第4页，课件共36页，创作于2023年2月蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系

蛋白质酸性氨基酸每摩尔残基数碱性氨基酸每摩尔残基数碱性/酸性等电点37胃蛋白酶60.21.0血清蛋白血红蛋白核糖核酸酶82991.24.753881.76.77202.99.5第5页，课件共36页，创作于2023年2月二、蛋白质分子的大小与形状

(一)根据化学组成测定最低相对分子质量

(二)渗透压法测定相对分子质量（三)蛋白质的扩散和扩散系数

(四)沉降分析法测定相对分子质量

(五)凝胶过滤法测定相对分子质量

(六)SDS酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量

(七)蛋白质分子的形状第6页，课件共36页，创作于2023年2月

(一)根据化学组成

测定最低相对分子质量

用化学分析方法测定出蛋白质某一微量元素（如铁）的含量，并假设蛋白质分子中只有一个铁原子，则可计算出蛋白质的相对分子质量。例肌红蛋白含铁量为0.335%，其最低相对分子质量可按下式计算:

铁的原子量最低相对分子质量=×100

铁的百分含量

=(55.8/0.335)×100=16700

注：真实的Mr(相对分子质量)为最低相对分子质量的n倍(n=1，2，3…

…)第7页，课件共36页，创作于2023年2月(二)渗透压法测定相对分子质量

渗透压:为了制止溶液与纯溶剂之间的净移动所需施加于溶液的压力，它是单位体积内溶质质点数的函数，与溶质的性质和形状无关。

优点:

所用实验装置简单准确度不亚于其他方法

缺点:蛋白质的渗透压受PH影响，只有蛋白质分子处于等电点时，测定的渗透压才不受缓冲液中无机离子的影响。需要纯品。P292图7-1第8页，课件共36页，创作于2023年2月

蛋白质的相对分子量可以直接用沉降系数表示。一般把单位离心场里的沉降速度称为沉降系数。

沉降系数

用s表示。一个s单位：为1×10-13秒,8×10-13秒用8s表示。

超速离心机最初是Svedberg于1940年设计制造的。沉降分析法测定相对分子质量第9页，课件共36页，创作于2023年2月（1）沉降速度法

把蛋白质样品放在离心机中，在离心力的作用下，蛋白质分子沿旋转中心向四周移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋白质的移动速度。在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，分析计算蛋白质的分子量。

第10页，课件共36页，创作于2023年2月

利用沉降平衡法测定分子量是在较低速度的离心力场进行的。以较低速度较长时间离心，使拟分析的物质沉降与扩散间达到平衡，离心期间不形成界面，只表现浓度梯度曲线的曲率。离心开始时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度，因而产生分子扩散作用，扩散力的作用方向和离心力相反。

（2）沉降平衡法第11页，课件共36页，创作于2023年2月三、蛋白质的胶体性质

与蛋白质的沉淀

(一)蛋白质的胶体性质

(二)蛋白质的沉淀第12页，课件共36页，创作于2023年2月(一)蛋白质的胶体性质

蛋白质是高分子化合物，由于相对分子质量大，它在水溶液中所形成的颗粒具有胶体溶液的特征如布朗运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜以及具有吸附能力等。

利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可用羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等来分离纯化蛋白质，这个方法称为透析法。

第13页，课件共36页，创作于2023年2月蛋白质溶液是胶体溶液（如血清、蛋清）胶体条件：

1.大小：1-100nm2.有水膜：表面有许多极性、亲水基团(-NH3、-COOH、-OH、-SH、-CONH2等）。

3.带相同的电荷（同性相斥）第14页，课件共36页，创作于2023年2月(二)蛋白质的沉淀反应

如果在蛋白质溶液中加入适当的试剂，破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀。

1、加高浓度盐类

2、加有机溶剂

3、加重金属盐

4、加某些酸类或生物碱试剂

5、加热变性沉淀第15页，课件共36页，创作于2023年2月加高浓度盐类

硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象，称为盐析。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法。根据各种蛋白质的颗粒大小、亲水性的程度不同，在盐析时需要盐的浓度也不一致。因此，这种调节中性盐的浓度使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出的方法称分段盐析法。

第16页，课件共36页，创作于2023年2月加有机溶剂

酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀反应。第17页，课件共36页，创作于2023年2月加重金属盐

氯化高汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等，因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。碱性条件下第18页，课件共36页，创作于2023年2月加某些酸类或生物碱试剂

酸性条件下

加苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如鞣酸、苦味酸、碘化钾等。酸性条件下第19页，课件共36页，创作于2023年2月加热变性沉淀

几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量的盐类促进蛋白质加热凝固。当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全最迅速。加热变性引起蛋白质凝固沉淀的原因可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了水化层。第20页，课件共36页，创作于2023年2月五、蛋白质的分离纯化方法蛋白质的分离纯化依据（一）根据分子大小不同的纯化方法（二）利用溶解度差别的纯化方法（三）根据电荷不同的纯化方法（四）利用选择性吸附的纯化方法第21页，课件共36页，创作于2023年2月（一）根据分子大小不同的纯化方法

1、透析和超过滤：利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离。

2、密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。

3、凝胶过滤第22页，课件共36页，创作于2023年2月凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。大分子

小分子葡聚糖小株第23页，课件共36页，创作于2023年2月（二）利用溶解度差别的纯化方法1、等电点沉淀和PH过滤2、蛋白质的盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀，即盐析。3、有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水膜水。4、温度对蛋白质溶解度的影响：低温稳定，高温不稳定。在0~40℃，大部分球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。第24页，课件共36页，创作于2023年2月

一、测定含量方法：

1.凯氏定氮法：灵敏度较低

2.双缩脲法0.21.7mg/L；

3.Folin-酚法（Lowry法）：25g250g/ml4.紫外吸收法、染料结合法和胶体金测定法等。二、测定纯度方法：

六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定第25页，课件共36页，创作于2023年2月样品量0.21.7mg/L；双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物。将尿素加热到180℃，则两分子尿素缩合成一分子双缩脲，并放出一分子氨。

双缩脲在碱性溶液中能与硫酸铜反应产生红紫色络和物，此反应称双缩脲反应

双缩脲法第26页，课件共36页，创作于2023年2月

在碱性条件下磷钼酸、磷钨酸混合试剂与酪氨酸上的酚发生反应，生成蓝色化合物，将其与双缩脲法结合起来，蛋白质形成两种颜色的混合物老绿色，在650nm具有特定的吸收。

Folin-酚法（Lowry法）第27页，课件共36页，创作于2023年2月考马斯亮蓝法（Bradford法）

考马斯亮蓝G250是一种带有负电荷的染料，在酸性条件下，可与蛋白质上的正电荷结合，形成蓝色化合物，在595nm具有特定吸收，反应简便、快速、灵敏度高，550g/ml。

第28页，课件共36页，创作于2023年2月

由于核酸在260nm具有光吸收，对测定干扰较大，可采用280nm、260nm同测法。

蛋白质浓度（mg/ml）＝1.45A280-0.74A260

紫外吸收法第29页，课件共36页，创作于2023年2月（二）蛋白质纯度鉴定

纯度和分子量的测定：采用电泳（如聚丙烯酰胺凝胶电泳，梯度凝胶电泳等）、高速离心、分子筛层析、高效液相色谱等技术测定。等电点的测定：利用等电聚焦方法测定。亚基个数的测定：采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定。第30页，课件共36页，创作于2023年2月加入的固体的蛋白质的量溶解的蛋白质的量恒定浓度法鉴定蛋白纯度纯的蛋白一个拐点第31页，课件共36页，创作于2023年2月七、蛋白质性质小结1、蛋白质的分子量2、蛋白质的两性电离及等电点3、蛋白质的胶体性质4、蛋白质的沉淀反应5、蛋白质的变性6、蛋白质的颜色反应(补充）第32页，课件共36页，创作于2023年2月蛋白质的变性

天然蛋白质分子受到某些物理因素如：热、紫外线、高压和表面张力或化学因素的作用时，生物活性丧失，溶解度降低，不对称性增高以及其他的物理化学因素发生改