真菌及四体 真菌

真菌及检验

一类具有典型细胞核，有核膜和核仁，胞浆内有完整的细胞器，无根、茎、叶，不含叶绿素，无光合色素，细胞壁含几丁质和纤维素的单细胞或多细胞异养真核细胞型微生物。延时符真菌的生物学性状一、形态与结构

真菌按形态、结构可分为单细胞真菌和多细胞真菌两大类。1.单细胞真菌酵母菌：孢子，无菌丝类酵母菌：芽生孢子，假菌丝单细胞真菌形态类酵母菌—白假丝酵母菌芽生孢子假菌丝2.多细胞真菌丝状菌（霉菌）：菌丝和孢子多细胞真菌形态菌丝hypha在环境适宜情况下由孢子长出芽管，逐渐延长呈丝状，称菌丝。1.根据生长在培养基上的菌丝的功能不同分为：营养菌丝气生菌丝生殖菌丝2.根据菌丝有无隔膜分为：有隔菌丝：多数为致病性真菌无隔菌丝孢子（spore)：

真菌的繁殖器官。一条菌丝可长出多个孢子。在适宜条件下，孢子可发芽伸出芽管形成菌丝。区别要点真菌孢子细菌芽胞大小较大较小形态多种多样圆形或椭圆形抵抗力不强,60℃~70℃短时间即死强,煮沸短时间不死数目一条菌丝可产生多个孢子一个细菌体只形成一个芽胞作用为繁殖方式之一不是繁殖方式位置可在细胞内和细胞外形成只在细胞内形成真菌孢子与细菌芽胞的区别孢子的分类有性孢子：同一或者不同菌体上两性细胞融合减数分裂而成无性孢子：菌丝上细胞分化生成，不发生细胞融合。无性孢子分生孢子叶状孢子孢子囊孢子芽生孢子厚膜孢子关节孢子小分生孢子大分生孢子大分生孢子芽生孢子厚膜孢子孢子囊孢子二、真菌的繁殖与培养（一）繁殖方式1.无性繁殖

芽管繁殖分裂繁殖出芽繁殖生隔繁殖

2.有性繁殖

有性繁殖过程一般包括下列三个阶段：质配、核配和减数分裂（二）培养特性1.生长特点营养要求不高低温度（浅部真菌）低PH(4.0-6.0）高湿度和氧2.培养基沙保(Sabouraud)培养基类酵母型菌落酵母型菌落3.菌落1.单细胞真菌酵母型菌落类酵母型菌落（假菌丝）2.多细胞真菌丝状菌落丝状菌落三、真菌的抵抗力与变异性抵抗力较强，但不耐热60℃1h可被杀死。对2%石炭酸、2.5%碘酒、0.1%升汞或10%甲醛溶液较敏感。

灰黄霉素、制霉菌素B、克霉素、酮康唑、伊曲康唑等对真菌有抑制作用。

形态、结构变异、菌落变异和抗药性变异。四、真菌的感染致病性真菌感染条件致病性真菌感染超敏反应性疾病毒素中毒毒素与致癌

延时符真菌感染的检验一、标本的采集和处理

1.标本的采集——根据真菌感染部位采集不同的标本。取毛发、皮屑、指（趾）甲等标本取痰液、脓汁、血液、脑脊液等标本深部真菌感染浅部真菌感染标本来源要适宜用药前采集标本严格无菌操作标本量要充足立即送检2.标本采集注意事项临床标本分离培养直接检查免疫学检查观察菌落生化反应染色镜检直接镜检3.检验程序核酸检测其他鉴定试验形态学检查病理组织标本动物实验镜检PASHE二、检验方法(一)直接镜检标本处理液：（1）KOH溶液：适于检查致密的难以透明的材料。（2）生理盐水：用于观察真菌的出芽现象。（3）水合氯醛-石炭酸-乳酸封固液：透明力较强，只限于不透明标本。镜检（加温）毛发或皮屑等注意真菌与其他混杂物的鉴别标本+标本处理液革兰染色：各种真菌均为革兰阳性（图1）。乳酸酚棉蓝染色：染成蓝色（图2）。墨汁染色：背景染成黑色，菌体不着色（图3）。荧光染色：荧光显微镜下发出荧光。糖原染色：多糖成分呈红色，核为蓝色，背景为淡绿色。（图1）（图3）（图2）（一）基本条件1.常用工具平皿、试管、接种针、接种环、接种钩、培养箱等。三、分离培养与鉴定2.培养基真菌营养要求不高，最适pH4.0～6.0。常用的培养基培养基名称培养基用途沙氏培养基真菌的常规培养放线菌酮-氯霉素琼脂真菌的常规培养玉米粉吐温-80琼脂观察白假丝酵母菌的厚膜孢子马铃薯葡萄糖琼脂

观察真菌菌落色素，用于鉴别尿素琼脂生化反应鉴别培养（红色癣菌和石膏样癣菌）心脑浸液葡萄糖血琼脂显色鉴定培养基深部真菌培养真菌的培养与鉴定（二）培养方法仅用于培养生长繁殖较快真菌。观察真菌结构及生长发育过程。多用于菌种传代接种与保存。试管培养法大培养法小培养法玻璃棒载玻片培养基盖玻片无菌蒸馏水(三)生长现象

类酵母型菌落丝状菌落观察菌落生长速度、菌落大小、表面形态、性质、颜色、边缘、底部等。酵母型菌落糖（醇）类发酵试验检测真菌对单糖、多糖、醇类等发酵情况。同化碳源试验检测真菌对糖类中的碳源利用能力的试验，主要用于鉴定酵母菌。同化氮源试验检测真菌对氮源利用能力的试验，主要用于鉴定酵母菌。明胶液化试验某些真菌具有明胶酶，可分解明胶蛋白，使其失去凝胶性质而不能凝固。尿素分解试验某些真菌具有尿素酶，可分解尿素。1、常用生化试验(四)真菌的鉴定方法2、免疫学检查皮肤试验提取真菌抗原，进行皮内注射或斑贴试验，观察注射或试验部位有无红肿硬结出现。血清学检测检测真菌的抗原或抗体，例如：胶乳凝集试验、酶联免疫吸附试验、免疫荧光技术、放射免疫分析等。3、其它鉴定诊断方法(l)厚膜孢子形成试验接种玉米粉吐温-80琼脂

25℃孵育1~3天待测菌每天于显微镜下观察应用：白假丝酵母菌的鉴定。方法：结果：白假丝酵母菌在72小时内可观察到丰富的假

菌丝，假菌丝顶端见1～2个厚膜孢子。厚膜孢子假菌丝2.芽管形成试验

方法：待测菌+0.5～1ml血清37℃水浴2～3小时镜检应用：白假丝酵母菌的鉴定。3、其它鉴定诊断方法结果：绝大部分白假丝酵母菌可形成典型放大镜柄状芽管。芽管3、其它鉴定诊断方法

动物接种病理组织检查核酸检测真菌毒素的检测用于分离病原性真菌、确定致病性、研究抗真菌药物。用于深部真菌感染的诊断。用于真菌的分型鉴定。有ELISA、薄层层析法、高效液相色谱法等多种方法。G试验用于念珠菌、曲霉菌等深部真菌感染的早期诊断。（四）真菌药物敏感性试验药敏试验目的指导临床用药。监控耐药菌株的发生和耐药性变化。预期研究新药的潜在疗效。(一)临床常用抗真菌药物据化学结构分类多烯类：如两性霉素B、制霉菌素等。吡咯类：如酮康唑、伊曲康唑等。其他：如氟胞嘧啶。据作用机制分类作用于真菌细胞膜：如两性霉素B等。作用于真菌细胞壁：如尼可霉素Z等。干扰真菌DNA合成：如5-氟胞嘧啶等。其他：如大蒜新素及冰醋酸等。（二）酵母菌药敏试验方法——微量稀释法1．试验前准备RPMI1640培养基（含L-谷氨酰胺、酚红，不含碳酸氢钠）培养基以培养基依次作10倍稀释，浓度范围：原液~10倍于试验终浓度。药液稀释配成最高试验浓度的10倍（水溶性药物）或100倍（脂溶性药物）。药物原液配制用培养基稀释成1×103～5×103CFU/ml待检菌液制备2．方法稀释药物将药液加至无菌96孔微量板各孔接种0.1ml工作浓度的菌液35℃孵育48h（假丝酵母菌）或72h（新型隐球菌），观察结果3．结果判断

4.质量控制

采用标准菌株作为每次测定质控菌株，其MIC应落在预期值范围内。MIC通常指完全抑制待测菌生长（孔内液体完全透明）的最低药物浓度。吡咯类和氟胞嘧啶：与对照孔相比50%生长被抑制的最低药物浓度。（二）酵母菌药敏试验方法——纸片扩散法1．试验前准备培养基商品化含药物纸片药物纸片用无菌生理盐水调整至0.5麦氏单位待检菌液制备含葡萄糖和亚甲蓝的M-H琼脂（二）酵母菌药敏试验方法——纸片扩散法2．方法用无菌棉签蘸取菌液

35℃孵育18~24小时若生长不良可延长至48小时贴上药物纸片均匀涂布接种M-H琼脂药物纸片接种菌液

质量控制——

标准质控菌株的抑菌环直径必须质控允许范围。（二）酵母菌药敏试验方法——纸片扩散法

结果判断读取<80%抑制生长时的抑菌环直径，环内的微小菌落（20%）可忽略不计。据抑菌环直径判断结果。延时符常见病原性真菌及检验

浅部感染真菌一、皮肤癣真菌分表皮癣菌属、毛癣菌属和小孢子癣菌属3个属，可侵犯皮肤、指（趾）甲和毛发，引起人类的体癣、股癣、手癣、足癣、甲癣、头癣等。体癣股癣手癣一、皮肤癣真菌头癣足癣甲癣表皮癣菌属对人致病的是絮状表皮癣菌。镜检可见大分生孢子、菌丝较细有分隔、厚膜孢子。絮状表皮癣菌菌落絮状表皮癣菌大分生孢子、厚膜孢子絮状表皮癣菌菌落毛癣菌属常见的致病菌有红色毛癣菌、紫色毛癣菌、须毛癣菌、断发毛癣菌和许兰毛癣菌。红色毛癣菌菌落正面红色毛癣菌菌落背面紫色毛癣菌菌落2.毛癣菌属：须毛癣菌菌落断发毛癣菌菌落许兰毛癣菌菌落毛癣菌属显微镜下可见大分生孢子、小分生孢子；菌丝形态多样。红色毛癣菌小分生孢子紫色毛癣菌菌丝红色毛癣菌大分生孢子2.毛癣菌属：断发毛癣菌小分生孢子及菌丝许兰毛癣菌菌丝须毛癣菌大、小分生孢子3．小孢子癣菌属常见的致病菌有铁锈色小孢子菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌等。铁锈色小孢子菌菌落石膏样小孢子菌菌落犬小孢子菌菌落3．小孢子癣菌属镜下可见菌丝、厚壁梭形大分生孢子。犬小孢子菌大分生孢子石膏样小孢子菌大分生孢子铁锈色小孢子菌菌丝（二）微生物学检验1．标本采集采集皮屑、甲屑、病发。2．检验方法直接镜检：查找菌丝和孢子。分离培养与鉴定：观察菌落颜色和形态；毛发穿孔试验、脲酶试验和特殊营养需要试验。深部感染真菌一、念珠菌（一）生物学特性在沙培养基上呈类酵母型菌落，菌体呈圆形或卵圆形，G+，可形成假菌丝、厚膜孢子。白假丝酵母菌菌落芽生孢子与假菌丝假菌丝与厚膜孢子（二）微生物学检验1．标本采集分泌物、痰、尿、粪、血或脑脊液等。2．检验方法直接镜检分离培养鉴定试验：芽管形成试验、厚膜孢子形成试验、TTC试验、糖同化或发酵试验。（二）微生物学检验♦其他检测

♦药敏试验

芽管形成试验厚膜孢子形成试验显色培养基（三）临床意义可引起：①皮肤假丝酵母菌病；②黏膜假丝酵母菌病；③内脏假丝酵母菌病；④中枢神经系统白假丝酵母菌病。鹅口疮指间念珠菌病二、新型隐球菌（一）生物学特性墨汁负染色后，可见圆形或卵圆形菌体，外周有宽厚荚膜，形成酵母型菌落。新型隐球菌菌落新型隐球菌荚膜（二）微生物学检验1．标本采集脑脊液、痰液、尿液、脓汁等。2．检验方法直接镜检分离培养鉴定试验

：酚氧化酶试验、脲酶试验、糖同化及发酵试验。其他检测药敏试验（三）临床意义经呼吸道侵入人体，引起肺部感染。由肺经血行播散时可引起亚急性或慢性脑膜炎。肺新型隐球菌感染三、其他重要真菌（一）曲霉在沙保培养基上形成丝状菌落，由于产生分生孢子而渐呈现不同颜色。烟曲霉菌落黄曲霉菌落黑曲霉菌落构巢曲霉菌落土曲霉菌落