引物设计实例分析

引物设计实例分析第1页，课件共23页，创作于2023年2月引物设计基本原则引物长度（primerlength）产物长度（productlength）序列Tm值(meltingtemperature)G+C含量（composition）引物二聚体及发夹结构（duplexformationandhairpin）阅读框第2页，课件共23页，创作于2023年2月1.引物的长度一般为18-30bp，常用的是20bp左右，但不能大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于72℃，即Taq酶的最适温度第3页，课件共23页，创作于2023年2月2.扩增片段的长度扩增片段长度在普通PCR以200～500为宜；实时荧光PCR则为50～150bp。第4页，课件共23页，创作于2023年2月3.引物溶解温度（Tm值）引物的Tm值一般控制在55-60度,尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)第5页，课件共23页，创作于2023年2月4.引物的GC含量

有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高（非特异性扩增0或过低（扩增效率不高）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。第6页，课件共23页，创作于2023年2月5.引物自身

引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败;

引物3’端碱基，最好为G或C，形成GC夹子，提高引发效率，并提高扩增的特异性第7页，课件共23页，创作于2023年2月任务用绿色荧光蛋白(GFP)标记蛋白NR1第8页，课件共23页，创作于2023年2月SPpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第9页，课件共23页，创作于2023年2月SPBamHIpcDNA3.1NR1Plasmid1:Plasmid2GFP第10页，课件共23页，创作于2023年2月SPBamHI(GGATCC)pcDNA3.1NR1-1aGFP第11页，课件共23页，创作于2023年2月121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcgggtcgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgctgtgcccggagctcatgag241caccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgaccactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggcttctacagaatccctgtcctgggactgac601tacccgaatgtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccagtccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctgcagtttgacccaggaaccaa

NR1的编码序列(~4000bp)红色为信号肽,蓝色为BamHI酶切位点,下划线标出酶切位点的阅读框第12页，课件共23页，创作于2023年2月ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTCGGCTACGGCCTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAAGFP序列(~700bp)第13页，课件共23页，创作于2023年2月引物要求PCR扩增GFPGFP两边添加BamHI酶切位点保证NR1的阅读框不改变第14页，课件共23页，创作于2023年2月5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’3’

TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’GFP序列5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

3’

TACCACTCGTTCCCGCTCCTCG……………CGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………………..AGAGCCGTACCTGCTCGACATGTTCATT5’Primer2Primer1:5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’

TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’

ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….第一步：扩增GFP基本序列变性,引物复性第15页，课件共23页，创作于2023年2月第二步：GC比值；Tm值Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA…………..Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGA…….Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）第16页，课件共23页，创作于2023年2月第三步：酶切位点Primer1:5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA（GC:60%,Tm：64）Primer2:5’CTTGTACAGCTCGTCCATGCC（GC:57%,Tm：66）BamHI:ggatccPrimer1:5’

ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5’

ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCC第17页，课件共23页，创作于2023年2月第四步：阅读框atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcg

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cccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct…..Primer1:5’

ggatccATGGTGAGCAAGGGCGAGGANR1序列：Primer1:5’

ggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA第18页，课件共23页，创作于2023年2月atgagcaccatgcacctgctgacattcgccctgcttttttcctgctccttcgcc

cgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacctNR1序列：5’ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC…………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA3’

GFP序列cgcgcg

gatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC

……………TCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG??ggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctgtcacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacct插入GFP后的组合序列第19页，课件共23页，创作于2023年2月Primer2:5’

ggatccCTTGTACAGCTCGTCCATGCCPrimer2:5’

ggatccct

CTTGTACAGCTCGTCCATGCC第20页，课件共23页，创作于2023年2月第五步保护序列不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目有要求酶寡核苷酸序列链长切割率%2hr20hrAflIIICACATGTG

CCACATGTGG

CCCACATGTGGG8

10

12