生物制药-基因工程制药-课件

生物技术制药

BiotechnologicalPharmaceutics第二章基因工程制药1ppt课件基因工程制药主要内容

基因工程的主要技术方法

基因工程制药的基本过程

基因工程药物的生产工艺

重组蛋白的复性技术

常见的几种基因工程药物的生产实例要求掌握基因工程制药的过程结合具体生产实例掌握几种具有代表性的基因工程药物的生产工艺和技术路线2ppt课件基因工程制药基因工程

DNA重组（DNArecombinant）技术3ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法1.1基因工程的工具酶限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶常用的II型限制性内切酶，识别DNA序列中的回文结构切割后形成粘性末端或平末端4ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.1基因工程的工具酶常见限制性核酸内切酶的来源及其作用位点酶识别序列与作用位点5’3’来源AluIAGCT（平末端）ArthrobacterluteusBamHIGGATCCBacillusamyloliquefaciensEcoRIGAATTCEscherichiacoliRye13HaeIIIGGCCHaemophilusaegyptiusHindIIIAAGCTTHaemophilusinfluenzaeHpaIGTTAAC（平末端）HaemophilusparainfluenzaeKpnIGGTACCKlebsiellapneumoniaePstICTGCAGProvidenciastuartiiSmaICCCGGG（平末端）SerratiamarcensXbaITCTAGAXanthomonasbadriiXhoICTCGAGXanthomonasholicola5ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.1基因工程的工具酶

DNA连接酶（DNAligase）连接具有互补粘性末端的DNA片段连接平末端（T4DNA连接酶）的DNA片段注意连接酶只封闭缺乏磷酸二酯键的缺口（nick），不能封闭缺失核苷酸的裂口（gap）6ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.1基因工程的工具酶

DNA聚合酶（DNApolymerase）DNA聚合酶I（PolI）：5’3’聚合酶活性、5’3’核酸外切酶活性、3’5’核酸外切酶活性

Klenow片段：保留了PolI的5’3’聚合酶活性和3’5’核酸外切酶活性

TaqDNA聚合酶：热稳定性的DNA聚合酶，其最适活性温度为72oC，适用于PCR扩增7ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.1基因工程的工具酶逆转录酶（reversetranscriptase）依赖于RNA的DNA聚合酶以mRNA为模板和含3’-OH的寡聚DNA引物产生的是mRNA与cDNA互补的杂合双链8ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.1基因工程的工具酶基因工程用酶主要功能限制性内切酶在特异性的碱基序列部位切割DNADNA连接酶将两条DNA分子或片段连接成整体DNA聚合酶向3’-端逐一增加核苷酸，填补双链DNA上的单链裂口逆转录酶以mRNA为模板合成互补的cDNA链多核苷酸激酶把磷酸分子加到多核苷酸链的5’-OH末端末端转移酶将同聚物尾巴加到单链或双链

DNA的3’-OH末端核酸外切酶从DNA链的3’-端移去核苷酸残基碱性磷酸酶催化DNA链的末端移去末端的磷酸基S1核酸酶催化RNA和单链DNA降解成5’-单核苷酸9ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.2基因工程的载体的要求在宿主细胞内能独立复制分子量尽可能小，便于从细胞中分离纯化

含有多种限制性内切酶的单一酶切位点载体内含有不影响其复制、生长的非必要区域，在此区域内可以插入、接受外源DNA具有多种选择性标记，作为区分重组和非重组转化子的指标抗药性标记营养缺陷型标记形成噬菌斑能力10ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.2基因工程的主要载体——质粒细菌中独立于染色体在能自主复制的遗传成分一般是环形DNA

pBR322质粒图谱pBR322质粒分子长度4361bp，含Ampr和Tetr两个抗性标记。11ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.3常用的技术手段 ——PCR扩增双链DNA变性

94oC，1min退火，引物结合

54oC，45s链延伸

72oC，2min12ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.3常用的技术手段——PCR扩增13ppt课件基因工程制药基因工程的主要技术方法

1.3常用的技术手段 ——DNA测序

Sanger双脱氧链终止法

DNA聚合酶的应用双脱氧核苷酸掺入导致终止14ppt课件基因工程制药

基因工程制药的基本过程15ppt课件基因工程制药基因工程制药的基本过程

1)切从供体细胞中分离出基因组DNA，并将外源基因DNA和载体分别酶切

2)接用DNA连接酶将含有目的基因的DNA片段连接到载体分子上，形成重组DNA分子

3)转将重组的DNA分子导入能够正常复制的宿主细胞16ppt课件基因工程制药基因工程制药的基本过程

4)增培养转化的细胞，以扩增重组DNA或使其整合到宿主细胞的基因组中

5)检筛选和鉴定转化的细胞，获得使外源基因高效稳定表达的工程菌或细胞

6)培养基因工程菌在适宜条件下培养发酵，表达出目标蛋白

7)分离收获目标蛋白，采用一系列分离纯化手段获得高纯度的产品17ppt课件基因工程制药基因工程制药的基本过程8)精制对目标蛋白进行过滤除菌，以及除去热原和致敏性物质等

9)鉴定制成特定的制剂，并进行半成品或成品鉴定，鉴定合格后，进行包装、运输、上市销售前5个步骤是上游过程后4个步骤是下游过程18ppt课件基因工程制药2.1目的基因的获得

逆转录法从真核细胞中提取产生该蛋白质的mRNA并纯化（oligo-dT亲和层析法）借助于逆转录酶，以mRNA为模板，以oligo-dT为引物，进行第一链cDNA的合成酶解除去mRNA链；通常在合成cDNA第一链后直接PCR扩增，即“逆转录－PCR法”19ppt课件基因工程制药

2.1目的基因的获得逆转录法20ppt课件基因工程制药

2.1目的基因的获得从基因组中直接分离随机断裂法：将基因组DNA用内切酶切成多个片段，然后将这些片段混合物随机重组入适当载体、转化、扩增，再筛选出所需的基因片段21ppt课件基因工程制药

2.1目的基因的获得化学合成法目前已经可以在DNA合成仪上自动完成前提是已知DNA碱基序列或蛋白质的氨基酸序列合成的基因片段长度受限制，一般仅适用于分子较小的多肽的基因合成专一性较差，合成的片段越长，产率越低遗传密码的简并性为密码子的选择带来困难22ppt课件基因工程制药

2.2基因载体的选择质粒载体

——pET-32a(+)

E.coli中表达的优良载体。pET-32a(+)具有Ampr抗性，酶切位点丰富。含T7lac启动子；含有T7.Tag和His-Tag融合标签，便于检测和纯化目标蛋白。23ppt课件基因工程制药

2.2基因载体的选择质粒载体——pPIC9K巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达的优良载体，是真核表达常用载体，可在酵母及原核生物中表达。pPIC9K具有Ampr和Kanr抗性标记，含ColE1复制起始位点；具有4个多克隆位点；含强启动子AOXI，能被甲醇诱导；含-因子信号肽序列，为分泌型表达。24ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统原核细胞及表达系统大肠杆菌（E.coli）枯草芽孢杆菌（B.subtilis）链霉菌属（Streptomyces）真核细胞及表达系统酵母（Yeast）丝状真菌（FilamentousFungi）

哺乳动物细胞

*

昆虫细胞

*25ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统大肠杆菌E.coli

表达系统目前仍然是采用最多的原核表达系统，其基因组图谱已经完全绘制出，且其基因的功能和调控系统也已经深入了解26ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统大肠杆菌表达系统特点遗传背景清晰繁殖快，表达量高，对培养基要求低，容易操作克隆载体和突变型宿主菌选择性范围广

缺乏翻译后修饰加工，不能糖基化一般为胞内表达，形成包涵体（inclusionbody）表达产物前端的信号肽不能被切除27ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统真核基因在大肠杆菌中的表达形式融合蛋白蛋白较稳定，在宿主细胞内不易降解含原核多肽序列，具有免疫原性，一般不能用于注射非融合蛋白操纵子改造：细菌/噬菌体启动子——细菌SD序列——真核起始密码子——结构基因——终止密码蛋白在宿主体内易被降解分泌型表达将外源基因融合到编码E.coli信号肽的DNA序列下游进入细胞周质后被信号肽酶切除信号肽蛋白折叠正确，保持活性28ppt课件基因工程制药2.3宿主细胞与表达系统重组蛋白不同表达策略的优缺点表达策略优点缺点分泌表达至细胞外1)

增强正确二硫键的形成2)降低表达蛋白被降解的几率3)可获得确定的N-端4)显著减少杂蛋白水平，简化纯化5)无需细胞破碎1)表达水平低2)多数蛋白不能分泌表达3)表达蛋白需浓缩细胞周质空间表达1)增强正确二硫键的形成2)可获得确定的N-端3)显著减少杂蛋白水平，简化纯化1)一些蛋白不能分泌进入细胞周质2)没有大规模选择释放周质空间蛋白的技术3)周质蛋白酶可引起重组蛋白的降解胞内包涵体表达1)包涵体易于分离2)保护蛋白质不被降解3)蛋白无活性，不影响宿主细胞生长，表达水平较高1)需要体外复性，复性得率不高2)具有不确定的N-端胞内可溶性蛋白表达1)不需要体外溶解和复性2)一般具有正确的结构和功能1)高水平表达一般难得到2)纯化过程较复杂3)蛋白易被酶解4)具有不确定的N-端29ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素

a.外源基因的剂量一般而言细菌内基因拷贝数增加，基因表达产物也增加

b.外源基因表达效率启动子的强弱：外源基因在E.coli

内必须受控于E.coli

的启动子，常用的强启动子有lac、trp、tac、PL、T7

等核糖体结合位点：必须保证在核糖体结合位点及其附近不含潜在的二级结构

SD序列和起始密码子的间距应合适密码子的组成：偏爱性（选择E.coli

偏爱的密码子）30ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素

c.表达产物的稳定性——提高产物稳定性的措施构建融合基因，产生融合蛋白利用信号肽，进行分泌型表达位点特异性突变，改变蛋白中二硫键位置，增加稳定性采用蛋白酶缺陷型E.coli，减少降解

d.细胞的代谢负荷将宿主细胞生长与重组质粒复制分开将细胞生长与外源基因表达分成两个阶段形成包涵体，减轻外源蛋白对宿主的毒害

e.工程菌的培养条件——培养条件优化31ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统酵母表达系统最简单的真核生物单细胞32ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统酵母表达系统的特征细胞壁厚，转化实验要提取原生质体对多种抗生素一般不敏感，通常采用遗传缺陷型标记筛选重组体外源基因重组到穿梭质粒载体中，利于外源基因在酵母中的表达和操作能对蛋白质进行正确加工、修饰、折叠，具有糖基化能力，有利于真核基因的表达缺陷：产物蛋白可能不均一，形成多聚体；信号肽加工不完全；蛋白产物被降解常用的有酿酒酵母（S.cerevisiae）、巴斯德毕赤酵母（P.pastoris）等33ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统嗜甲醇酵母工程菌能以甲醇为唯一碳源，控制这些基因表达的启动子是酵母中最强且严格的启动子（如pPIC9K质粒的AOXI）毕赤氏酵母属（Pichia）、汉森酵母属（Hansenula）、假丝酵母属（Candida）、球拟酵母属（Torulopsis）34ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统酵母中目的基因表达的影响因素外源基因剂量外源基因的表达效率启动子：组成型和诱导型。诱导型启动子的表达受诱导物或诱导条件的特异性影响，可在较大范围内改变表达效率分泌信号：酵母能利用异源的分泌信号，但效率一般低于酵母自身的分泌信号终止序列（如polyA序列）：在酵母中表达的人工合成基因一般不含终止序列，须借用外加终止序列或载体上现有的终止序列35ppt课件基因工程制药

2.3宿主细胞与表达系统酵母中目的基因表达的影响因素外源蛋白糖基化

N-糖基化（Asn连接）

O-糖基化（Ser或Thr连接）宿主菌株的影响宿主菌的生长力要强宿主菌内源蛋白酶活性应较低宿主菌的性能应稳定，避免使用回复突变率高的菌株应有较强的分泌能力36ppt课件基因工程制药

2.4基因工程菌的培养培养方式分批培养（batchculture）单批次培养，是最简单的培养方式补料分批培养（fedbatchculture）溶氧控制与流加补料相结合连续培养（continuousculture）两阶段连续培养透析培养（dialysisculture）除去代谢产物，减小对菌体的生长抑制固定化培养（immobilizedculture）提高质粒稳定性，简化分离过程37ppt课件基因工程制药

2.4基因工程菌的培养

a.培养基成分碳源和氮源：需考虑菌体的利用速率以及产生的副产物的种类，对调控基因的诱导或抑制作用，以及对下游分离纯化的影响微量元素的特殊作用（例如无机磷浓度水平降低有利于提高重组蛋白的产率和浓度）

b.接种量接种量小，菌体延迟期较长，影响外源基因表达接种量增大，菌体生长快接种量过大，代谢副产物积累过多，影响菌体生长38ppt课件基因工程制药

2.4基因工程菌的培养

c.培养温度温度在菌体生长、基因表达等各方面均有影响温敏扩增型质粒，升温后质粒拷贝处于失控状态表达蛋白的活性和包涵体形成受温度影响

d.溶氧有氧发酵中氧的供给直接决定了菌体生长情况溶氧直接影响蛋白的表达量和代谢产物的种类调整反应器结构，加大通气量，提高搅拌转速39ppt课件基因工程制药

2.4基因工程菌的培养

e.诱导时机和诱导表达程序诱导时间一般选择在对数生长期后期分批发酵时的诱导须控制一定的菌体密度流加培养可以获得高密度的表达热诱导时应迅速升温，避免过多地诱发宿主体内热激蛋白的合成，造成分离的困难

f.pH值菌体利用碳源发酵产酸，使培养基pH下降外源蛋白表达时的pH值一般比菌体生长时的pH值低40ppt课件基因工程制药

2.4基因工程菌的培养质粒的不稳定性——

质粒丢失

分裂不稳定：工程菌分裂时出现一定数量的不含质粒的子代菌的现象不含质粒的子代菌产生的频率、质粒丢失率——

与宿主菌、质粒特性、培养条件有关丢失质粒的菌体在非选择性培养基中生长速度明显高于含质粒的菌体，因此逐渐占据优势结构不稳定：外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所导致的工程菌性能改变稳定性分析方法从非抗性培养基影印到抗性培养基，统计长出的菌落数41ppt课件基因工程制药

2.4基因工程菌的培养提高质粒稳定性的方法选择遗传特性稳定的宿主菌选择拷贝数适中的质粒载体，控制比生长速率

增加选择的压力，如添加抗生素等抑制丢失质粒的菌体的生长（对结构不稳定性无改善）分阶段控制培养，将菌体生长与基因表达分开控制培养条件：不含质粒的菌体对环境变化的敏感性较高固定化培养，提高稳定性的同时也能提高蛋白的产率42ppt课件基因工程制药基因工程药物的生产工艺上游基因工程菌的构建（基因获得、载体和宿主的选择）工程菌的培养下游中试研究——从实验室规模到工业生产的放大发酵生产产物分离纯化药物制剂、包装成品（略）43ppt课件基因工程制药

3.1基因工程菌的中试什么是“中试”从实验室研究到产业化必须经过中间放大试验的系列工艺研究和验证，这种中间放大试验简称“中试”中试研究就是将基因工程药物从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中间阶段目的是建立一条完全模拟实际生产条件的的小型生产流水线，并对一系列参数和条件进行优化中试不是简单的数量级的线性放大关系，而是各种研究技术的系统集成和放大优化44ppt课件基因工程制药

3.1基因工程菌的中试发酵工艺中试

工程菌

——

符合工业生产要求：高产、价廉、易得、非致病菌、生长代谢过程可控

反应器

——

罐体设计、配套设备的选择、空气系统、消毒方法、检测仪表

培养基组成优化——

中试过程培养基组成与摇瓶培养存在差异，碳源、氮源和各种营养物质的比例不一样工艺过程和参数的优化分离纯化中试产品处理量决定了分离方法和分离设备的选择45ppt课件基因工程制药

3.1基因工程菌的中试中试设备，一般5～30L46ppt课件基因工程制药

3.2基因重组蛋白的发酵生产——高密度发酵发酵条件改进培养基成分应容易被利用（如选择甘油代替葡萄糖），各组分的浓度相应增加流加培养：适时补充营养物质，保证菌体生长提高供氧能力，减少产酸构建产酸（乙酸）能力弱的工程菌利用代谢工程手段阻断代谢途径；限制进入产酸代谢途径的碳代谢流构建蛋白水解酶活力低的工程菌构建rpoH基因缺陷突变的E.coli（此基因编码RNA聚合酶r32亚基，此亚基对蛋白酶活力具有正调控作用）47ppt课件基因工程制药

3.2重组蛋白的发酵生产工厂用发酵设备，300L以上，大型发酵罐甚至可达几吨至几十吨48ppt课件基因工程制药

3.2基因重组蛋白的发酵生产发酵生产流程示意图49ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化建立分离纯化工艺需了解的各种因素发酵液的特点产物浓度较低，组成复杂不同菌种、不同培养基和不同工艺条件下得到的发酵液成分存在差异不同类型产品的物化性质和生物学性质差异料液中杂质的种类和性质产品用途和质量要求纯度、活性、比活性、杂质含量控制要求产品剂型、给药途径要求贮存、运输条件要求50ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化流程收集细胞细胞破碎固液分离（包涵体复性）粗分离纯化精制制剂51ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化细胞破碎——物理法高压匀浆法：细胞悬浮液通过针形阀，因高速撞击和突然减压而破裂。适用于多种细胞，但不适用于丝状菌高速珠磨法：将细胞悬浮液与玻璃珠混合高速研磨，利用剪切力破裂细胞。产生热量较大，需冷却超声破碎法：利用超声波在液体中的空化作用，产生空穴，破裂后产生极大的冲击力和剪切力使细胞破裂。不易放大，产生热量较大，需冷却，一般仅限于实验室使用冻融破碎法：将细胞反复冻融数次，因冰晶生成导致细胞壁、膜受损，使细胞裂解52ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化细胞破碎——化学法渗透冲击：利用细胞内外渗透压差的突然改变，使细胞大量吸水而胀破。要求细胞壁比较脆弱增溶法：利用表面活性剂增大细胞壁、膜的通透性，从而释放胞内物质脂溶法：细胞壁、膜上的脂质能与某些有机溶剂作用，导致细胞壁、膜膨胀、破裂，释放胞内物质，常用辛醇、甲苯等脂溶性较强的溶剂细胞破碎——生物法（目前仅限于实验室使用）酶溶解法：用酶消化降解细胞壁和细胞膜（不同的菌种选用不同的酶）自溶法：利用微生物自身产生的酶来溶菌53ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化——层析分离凝胶过滤层析/分子筛层析（gelfiltrationchromatography）凝胶过滤层析/分子筛层析依据：蛋白质分子的大小不同凝胶/筛：不带电荷的惰性多孔网状物小分子：被网孔拦截，流出速度慢大分子：不进入筛孔，被排出在外部，流出速度快缺点：对分子大小差异不显著的蛋白质分离效果差54ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化层析分离——纯化阶段凝胶过滤层析55ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化离子交换层析（ion-exchangechromatography,IEC）原理：置换反应，固定相的离子与溶液中的分子进行交换离子交换原理56ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化离子交换层析（ion-exchangechromatography,IEC）不同的蛋白质分子有不同的等电点（pI）蛋白质的电荷性质不同的蛋白质分子在某一特定pH时所带电荷不同，与基质的结合能力不同基质：带电荷的树脂或纤维素57ppt课件基因工程制药

蛋白质的离子交换层析分离：阳离子交换模式58ppt课件基因工程制药

蛋白质的离子交换层析分离：阴离子交换模式59ppt课件基因工程制药

3.3重组蛋白的分离纯化亲和层析（affinitychromatography,AC）利用固定化配体与目标蛋白之间特异性的生物亲和力进行可逆吸附，从而实现与杂蛋白分离的层析方法生物亲和力酶——底物/抑制剂激素——受体抗原——抗体生物素——凝集素最显著的优点：分辨率高60ppt课件基因工程制药

3.3分离纯化方法的选择依据产物表达形式分泌型产物：一般先浓缩处理，尽快缩小样品体积胞内可溶性表达产物：破胞后优先选用亲和分离法细胞周质表达产物：经低浓度溶菌酶处理，采用渗透压休克法来获得蛋白产物（破坏外膜，尽量不破坏内膜）细胞内不溶性表达产物：形成包涵体，能较容易地与可溶性蛋白分离，但须经过复性过程61ppt课件细胞周质革兰氏阳性细菌中，位于内膜和外膜之间的结构部分杂质蛋白少没有蛋白水解酶氧化环境有利于蛋白正确折叠缺点：产率低62ppt课件基因工程制药

3.3分离纯化方法的选择依据分离单元的衔接

先：使用低分辨率、大处理量、廉价快捷的分离手段实现粗分离（如沉淀、超滤等）后：将最昂贵、最费时、分辨率最高的手段放在分离步骤的最后用于精制（层析）63ppt课件基因工程制药重组蛋白的复性技术

4.1包涵体（inclusionbody）形成重组蛋白合成速度太快，没有足够的时间进行折叠，过多的蛋白间的非特异性结合，形成不溶的包涵体E.coli体内缺乏外源蛋白折叠过程中所需的酶和辅助因子（折叠酶、分子伴侣）64ppt课件基因工程制药重组蛋白的复性技术

4.3蛋白的复性过程包涵体的收集：破胞、离心包涵体的纯化：用缓冲液洗涤，除去粘附的膜蛋白包涵体溶解——

蛋白肽链的伸展

加入变性剂：盐酸胍、尿素（8mol·L-1）还原剂、表面活性剂、金属离子螯合剂肽链的重折叠——

回复天然构象变性剂去除：从完全伸展状态恢复到正常的折叠结构还原剂去除：使二硫键正常形成65ppt课件基因工程制药重组蛋白的复性技术

4.3肽链重折叠的方法稀释复性、透析复性凝胶过滤层析复性添加小分子物质促进复性：抑制肽链聚集分子伴侣或折叠酶促进的复性谷胱甘肽氧化还原系统66ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例

重组人胰岛素（recombinanthumaninsulin）

重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 （recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，rhGM-CSF）67ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）胰岛素（insulin）胰岛素是由胰腺中兰氏岛（Langerhans）的-细胞分泌的激素68ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）胰岛素（insulin）胰岛素是调节血糖水平的重要激素，通常维持血糖水平在限定范围内（3.5～8.0mmol·L-1）胰岛素降血糖的机理促进葡萄糖从血浆转运至细胞内，降低血糖浓度促进细胞对糖原的合成，有助于糖在细胞内的储存抑制分解代谢通路，抑制糖原分解I型糖尿病（胰岛素依赖型糖尿病，IDDM），一般需定期皮下注射胰岛素69ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）人胰岛素的理化性质胰岛素由A、B两条肽链组成，A链含21个氨基酸残基，B链含30个氨基酸残基，分子量5807Da，pI＝5.3肽链中的Cys对胰岛素四级结构的维持具有重要的作用，它们之间形成3对二硫键，连接A、B两条肽链

A6—S—S—A11（链内）

A7—S—S—B7（链间）

A20—S—S—B19（链间）70ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）胰岛素原（preproinsulin）人体分泌表达的胰岛素都是以胰岛素原的形式生成的，特征是B链前端有一段信号肽序列，A、B链之间通过含34个氨基酸残基的C链连接。用蛋白酶水解，切除C链，得到成熟的胰岛素71ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）胰岛素原（preproinsulin）72ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）重组DNA技术生产胰岛素（重组人胰岛素）

最初采用的方法：分别将编码胰岛素A链和B链的外源基因序列插入两组质粒中，转化到两组不同的E.coli

菌株中，分别进行发酵培养，得到含两条胰岛素链的蛋白序列。而后在适宜的条件下将A、B两肽链混合，促进链间二硫键形成，得到重组人胰岛素。73ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）重组DNA技术生产胰岛素（重组人胰岛素）在E.coli工程菌中插入编码人胰岛素原的基因序列，经过扩增表达后纯化胰岛素原，在体外通过蛋白酶水解切除信号肽和C链，得到重组人胰岛素只需一次发酵过程，在生产中效率较高，比双肽链表达法使用更为广泛74ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）重组DNA技术生产胰岛素（重组人胰岛素）表达系统大肠杆菌：表达量高，形成包涵体，可诱导酵母菌：优点：可以形成正确的二硫键，不需要复性

缺点：表达量低，酵母生长周期长75ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（一）重组DNA技术生产胰岛素（重组人胰岛素）改造后的胰岛素原编码基因+载体质粒转化大肠杆菌培养2hIPTG诱导4h收集包涵体上游尿素变性DTT、GSSG复性阴离子交换层析重组人胰岛素原酶切、纯化重组人胰岛素下游76ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（二）重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

（recombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，rhGM-CSF）

集落刺激因子（CSF）：造血因子，是刺激造血细胞的增殖和分化，促使其活化为成熟细胞，促使集落形成的低分子量糖蛋白77ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（二）

GM-CSF的生物学功能

维持造血前体细胞和成熟血细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核巨噬细胞）的存活

促进造血前体细胞增殖分化增强中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，并促进这些吞噬细胞释放活性氧杀灭异源物质78ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（二）

GM-CSF的临床应用

治疗肿瘤化疗所致的造血障碍：恢复化疗后减少的白细胞、中性粒细胞，提高肿瘤治疗效果

AIDS辅助治疗：增加AIDS患者外周血白细胞、中性粒细胞数量和功能，对HIV具有一定对抗作用

治疗骨髓异常增生综合症（MDS）和再生障碍性贫血：主要与中性粒细胞、单核粒细胞、嗜酸性粒细胞的升高作用有关

骨髓移植辅助用药：加快骨髓造血功能重建，促进外周血白细胞恢复，减少并发症，提高骨髓移植成功率

增强人体免疫力：激活单核巨噬细胞合成，释放抗肿瘤因子，作为化疗的辅助治疗79ppt课件基因工程制药基因工程药物生产实例（二）

GM-CSF的分子结构和理化性质