样品前处理技术基础理论

样品前处理技术基础理论第1页，课件共64页，创作于2023年2月培训概要

样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三

固相萃取技术四第2页，课件共64页，创作于2023年2月

样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三

固相萃取技术四第3页，课件共64页，创作于2023年2月样品前处理的重要性重要性

样品前处理在色谱分析过程中是一个既耗时又极易引进误差的步骤，样品处理的好坏直接影响色谱分析的最终结果，因此，为了提高分析测定效率，改善和优化色谱分析样品制备方法和技术是一个重要问题。由于食品样品属于复合基质体系,多含有蛋白、油脂,碳水化合物、色素等成分,复杂的基质背景会对被分析目标化合物的提取、分离、净化和测定等带来很大的麻烦,因此食品的样品前处理不仅复杂困难,而且对于分析结果的准确可靠和灵敏具有决定性作用。第4页，课件共64页，创作于2023年2月为何需要样品前处理?色谱分析的误差来源

第5页，课件共64页，创作于2023年2月为何需要样品前处理?样品前处理所消耗时间

第6页，课件共64页，创作于2023年2月对于LC/MS/MS高灵敏度的仪器,适当的样品前处理对于减少基质干扰和富集组分至关重要！为何需要样品前处理?60%以上的工作和费用花费在样品前处理上

三个目的:

除去样品基质中的干扰物

富集组分

增强仪器的性能第7页，课件共64页，创作于2023年2月样品前处理原则原则①制备过程中避免组分发生化学变化；②要防止和避免欲测定组分的沾污；③尽可能减少无关化合物引入制备过程；④尽可能简单易行。第8页，课件共64页，创作于2023年2月

样品前处理的重要性及原则一样品前处理一般性步骤二样品前处理方法及比较三

固相萃取技术四第9页，课件共64页，创作于2023年2月样品处理一般性步骤离心过滤液-液萃取

SPESPME……根据样品类别和被分析物的结构、极性等理化性质选择合适的提取溶剂GCGC-MSHPLCLC-MSCE……提取净化测定第10页，课件共64页，创作于2023年2月

样品前处理的重要性及原则一样品前处理方法及比较二样品前处理方法及比较三

固相萃取技术四第11页，课件共64页，创作于2023年2月样品预处理技术分析被测物在样品基质中提取第12页，课件共64页，创作于2023年2月样品预处理的目的除去微粒减少干扰杂质浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果有利于色谱柱及仪器的保护溶剂置换第13页，课件共64页，创作于2023年2月样品的预处理重要性占样品分析时间的比例样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间占分析的消耗总成本最大消耗大量的溶剂及其他化学品实验的重复性及准确性最差的环节影响实验结果好坏的最重要因素

是决定性的步骤第14页，课件共64页，创作于2023年2月常见样品前处理方法常见样品前处理包括:液液萃取稀释固相萃取离心过滤样品前处理沉淀第15页，课件共64页，创作于2023年2月样品前处理的各种方法方法 选择性基础沉淀 溶解度液—液萃取 样品在两相中的分配固相提取 样品在吸附剂上的吸附与分配渗析/超滤 分子量与体积电泳 电荷/淌度蒸馏/蒸发 沸点与蒸气压第16页，课件共64页，创作于2023年2月传统的样品前处理方式

液液萃取(LLE)根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差异来将分析物从一相提取至另一相中。

装置简单

操作容易

常被认定为成本低廉费时费力常因乳化效益使相间分层不彻底，使得重复样的分析结果存在显著偏差(常在10%~20%之间)

若需萃取的样品体积大（如环境分析中），则可能消耗大量的有机溶剂。由此可能在购买、储藏、处置溶剂时花费庞大*。注:大量储存、使用和处置溶剂可对操作者的长期健康产生负面影响，并可带来火灾隐患有机层水层第17页，课件共64页，创作于2023年2月传统的样品前处理方式

蛋白质沉淀法(PPT)1-吸取200L血浆2-加入400-600l乙腈3-高速混合4-离心取上清液5-以水稀释后进样在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使样品中的蛋白质沉淀，然后经离心去除

简单快速可被自动化，适用于高通量分析若检测限要求不高时较适用属快速但粗糙的净化技术，仅可去除约90-95%的蛋白质，而基质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除（此为LC/MS分析时遭遇离子抑制的根源!）分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗导致样品稀释,不适合用于超痕量分析场合进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无内标，分析重现性不佳)第18页，课件共64页，创作于2023年2月固相萃取技术(SPE)

先进的样品前处理方法可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物并浓缩样品分析结果呈高度可靠性使得检测灵敏度和选择性大大提高明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少分析结果的精密度提高(偏差常<5%)

多样化的产品设计迎合不同样品通量要求

依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将其从液相提取至固定相中（本质上为色谱分离方法）第19页，课件共64页，创作于2023年2月

样品前处理的重要性及原则一样品前处理方法及比较二

样品前处理一般性步骤三

固相萃取技术四第20页，课件共64页，创作于2023年2月概念

固相提取（SolidPhaseExtraction，SPE)是一种重要的样品前处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展起来的。利用固相吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。第21页，课件共64页，创作于2023年2月原理及特点利用杂质或目标化合物与样品基体溶剂和吸附剂之间亲和力的相对大小差异实现净化分离。与传统的液液萃取相比具有明显的优势。特点回收率、富集倍数高有毒溶剂用量少两相分离操作简单、易自动化更有效的是分析物与杂质分离第22页，课件共64页，创作于2023年2月应用领域已被广泛的应用于：化学、化工行业制药行业临床医学研究食品安全领域烟草行业环境保护中草药研究……第23页，课件共64页，创作于2023年2月固相提取技术

SolidPhaseExtraction(SPE)色谱填料颗粒填装小柱1978年由Waters首次推出商品化产品：“Sep-PakCartridges”SampleEnrichment&Purification非常成熟的技术数千化合物的参考文献洗脱剂废液0.01to1000克多种规格第24页，课件共64页，创作于2023年2月梨的色谱分析：SPE的作用

不同提取过程的结果比较乙腈提取未净化乙腈提取用水稀释Oasis®HLB提取乙腈提取用水稀释Oasis®HLB提取用Sep-Pak®氨基小柱净化©1999WatersCorp.第25页，课件共64页，创作于2023年2月固相提取技术

SolidPhaseExtraction(SPE)两相——液相与固相容易分离多种吸附剂可供选择反相－最常用！正相离子交换具有高选择性的新型吸附剂溶剂消耗少—与液液提取相比减少人力与时间—容易自动化液相色谱基础第26页，课件共64页，创作于2023年2月HPLC与SPE之区别HPLCSPE颗粒直径~5µm40-80µm柱床效率

high

low柱外体积

low

high柱长5-30cm~1cm塔板数(N)~10,000<50Bottomline:HPLCcanseparatesimilarcompounds.SPErequiresasignificantselectivitydifferencebetweencompoundsforseparation.CompoundsnotwellresolvedbyHPLCcannotbeseparatedbySPEwithasimilarretentionmechanism.第27页，课件共64页，创作于2023年2月分离效率比较-HPLC与SPE00.20.40.60.810510152000.20.40.60.8105101520Elutionvolume(mL)Normalizedconcentration第28页，课件共64页，创作于2023年2月常见固相提取小柱的构造色谱柱床(吸附剂)柱体过滤膜/筛板插口/出液口第29页，课件共64页，创作于2023年2月SPE产品常见形式

萃取小柱:小柱体积1~35ml,吸附剂重量10mg~6g

为中等数量样品设计食品安全、环境分析和研究实验室

96-孔板:吸附剂重量2~60mg

为高通量分析设计（DMPK/BA/BE实验室）

μElution板用于微量样品和高灵敏度分析在线SPE净化柱:

柱芯式(需SentryGuard套件)和标准柱由切换阀和软件控制，无需人工操作第30页，课件共64页，创作于2023年2月固相提取技术的基本要求样品必须呈液态驱动力(DrivingForces)－操作方式重力压力真空第31页，课件共64页，创作于2023年2月SPE技术的驱动力：重力重力第32页，课件共64页，创作于2023年2月SPE技术的驱动力：压力压力第33页，课件共64页，创作于2023年2月SPE技术的驱动力：压力注射器接头—adaptor提取小柱压力第34页，课件共64页，创作于2023年2月ResevoirwithAdapterSPE技术的驱动力：真空第35页，课件共64页，创作于2023年2月SPE技术—填料颗粒基质硅胶基质—键合各种官能团如，{C18,C8,NH2,QMA...}不规则填料小柱(Cartridges)：40-80mDisks：8-10m活性碳(AC2)表面衍生剂涂层(DNPH)聚合物基质(最新技术)—Oasis球形填料30/60m第36页，课件共64页，创作于2023年2月SPE填料的类型正相填料溶剂：正己烷填料：硅胶（Silica）氧化铝,Florisil®,氨基,二醇基,……反相填料溶剂：MeOH/水填料：C18/C8/OasisHLB离子交换填料溶剂：缓冲液/盐流动相填料：AccellCM/AccellQMA/OasisMCX/MAX/WAX/WCX第37页，课件共64页，创作于2023年2月SPE各种填料固定相官能团C18–Si(CH3)2C18H37

tC18–SiC18H37

C8–Si(CH3)2C8H17

tC2–SiC2H5PorapakRDX-divinylbenzene/vinylpyrrolidoneAminopropyl–Si(CH2)3NH2Cyanopropyl–Si(CH3)2(CH2)3CNDiol–Si(CH2)3OCH2CH(OH)CH2OHAccellPlusCM–COO2–Na+AccellPlusQMA-–C(O)NH(CH2)3N(CH3)+Cl–DNPH-dinitrophenylhydrazineOasisHLBOasisMCXOasisMAXOasisWCX,WAX-divinylbenzene/vinylpyrrolidone-divinylbenzene/vinylpyrrolidone+SO3H-divinylbenzene/vinylpyrrolidone+CH2N+R3Cl-SilicaFlorisilAlumina正相反相Sep-Pak系列Oasis系列第38页，课件共64页，创作于2023年2月分离模式反相正相离子交换复合模式第39页，课件共64页，创作于2023年2月分离模式反相萃取（极性液体相，非极性改良固体相）疏水性相互作用非极性—非极性相互作用范德华力或色散力

硅胶键合C18,C8,C4，C2,-苯基等，可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。第40页，课件共64页，创作于2023年2月分离模式正相萃取（非极性液体相，极性改良固体相）亲水性相互作用极性—极性相互作用氢键π-π相互作用偶极－偶极相互作用偶极－诱导偶极相互作用

极性键合相，如硅胶键合－NH2、－CN，-Diol（二醇基）；极性吸附剂，如Silica、Florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等，可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。第41页，课件共64页，创作于2023年2月正相溶剂洗脱强度己烷异辛烷四氯化碳氯仿二氯甲烷四氢呋喃乙醚乙酸乙酯丙酮乙腈异丙醇甲醇水溶剂极性图反相溶剂洗脱强度第42页，课件共64页，创作于2023年2月分离模式离子交换

带有电荷的化合物靠静电吸引到带有电荷的吸附剂表面按键合的离子基团的性质分类： 阳离子交换柱 阴离子交换柱按在水溶液中解离的程度：

强酸性(SCX,Strongcationexchange)

弱酸性(WCX,Weakcationexchange)

强碱性(SAX,Stronganionexchange)

弱碱性(WAX,Weakanionexchange)第43页，课件共64页，创作于2023年2月分离模式反相吸附原理离子交换原理复合模式第44页，课件共64页，创作于2023年2月Oasis®

系列固相萃取吸附剂的演变:

从纯反相保留模式到复合保留模式(IE+RP)

NOOasis®HLBWaterwettableStableacrosspH1-14NosilanolinteractionsHydrophilicRetentionofPolarsLipophilicRPRetentionNOSO3-Oasis®MCXpKa<<11meq/gOasis®WAXNONNNNHHH++HpKa~60.6meq/gNOCH2N-C4H9CH3CH3+Oasis®MAXpKa>180.25meq/gNOCOOHOasis®WCXpKa~50.75meq/gCOO-+H+第45页，课件共64页，创作于2023年2月OHNCH3CH3普萘洛尔HH+反相作用强阳离子交换作用（碱性药物）MCX吸附剂NOSO-3SO-3MixedModeCationeXchangerOasis®MCX吸附剂上碱性化合物的作用模式:Mixed-ModeCationic-eXchanger

pKa<<1第46页，课件共64页，创作于2023年2月OasisMCXSPE吸附剂净化和富集碱性化合物的强有力工具pH02468101214k’Acids(HA)NeutralBases(BH+)A-B清洗2:100%MeOH(强烈清洗)样品预处理活化/平衡:MeOH/Water上样清洗1:2%甲酸水溶液(目标锁定)洗脱:2%NH4OH-MeOH(目标释放)溶剂蒸发/重新定容(选项)(OasisMCX在所有pH下均带负电)第47页，课件共64页，创作于2023年2月O对乙酰氨基酚反相作用强阴离子交换作用（酸性药物）MAX吸附剂NO-OHNOCH3CH2N(R3)Cl-CH2N(R3)Cl-++QuatenaryamineOasis®MAX吸附剂上酸性化合物的作用模式:Mixed-ModeAnionic-eXchangerpKa>18第48页，课件共64页，创作于2023年2月OasisMAXSPE吸附剂净化和富集酸性性化合物的强有力工具pH02468101214k’Acids(HA)NeutralBases(BH+)A-B清洗2:100%MeOH(强烈清洗)样品预处理活化/平衡:MeOH/Water上样清洗1:2%氨水(目标锁定)洗脱:2%甲酸-MeOH(目标释放)溶剂蒸发/重新定容(选项)(OasisMAX在所有pH下均带正电)第49页，课件共64页，创作于2023年2月若想在OasisMCX/MAX吸附剂上净化和富集永久性带电的物质

(如季铵碱及其盐，有机磺酸及其盐，有机膦酸及其盐)，能否成功?！第50页，课件共64页，创作于2023年2月永久性带电分析物带来的挑战…k’Acids(HA)NeutralQ.Base(Q+)A-Q.Base(Q+)带永久性正电的季铵盐在OasisMCX上时…pHk’NeutralBases(BH+)BRSO3-

带永久性负电的有机磺酸盐在OasisMAX上时…Bases(BH+)BA-Acids(HA)RSO3-第51页，课件共64页，创作于2023年2月Oasis®WCX&Oasis®WAX(2004)专为永久性带电分析物所设计的吸附剂

Oasis®WCX:MixedModeWeakCationicExchanger

Oasis®WAX:MixedModeWeakAnionicExchanger

第52页，课件共64页，创作于2023年2月阳离子交换作用反相作用

戊沙溴铵

（季铵盐）NOCOO-COO-季铵盐在Oasis®WCX吸附剂上的作用模式羧酸的pKa5pH3吸附剂为电中性状态pH7吸附剂呈完全负电状态

OasisWCXMixed-Mode

WeakCationeXchanger第53页，课件共64页，创作于2023年2月OasisWCXSPE吸附剂净化和富集季铵盐和碱的最佳工具pH02468101214k’NeutralBases(BH+)Q+BQ+WCX带负电WCX不带电Acids(HA)A-清洗2:100%MeOH(强烈清洗)样品预处理活化/平衡:MeOH/Water上样清洗1:2%氨水(目标锁定)洗脱:2%甲酸-MeOH(目标释放)溶剂蒸发/重新定容(选项)第54页，课件共64页，创作于2023年2月WAXsorbentMixed-Mode

WeakAnioneXchanger阴离子交换作用反相作用哌嗪基团的pKa6pH>8

吸附剂为电中性状态pH<4吸附剂呈完全正电状态磺酸盐

(StronglyAcids)有机磺酸盐在Oasis®WAX吸附剂上的作用模式第55页，课件共64页，创作于2023年2月OasisWAXSPE吸附剂净化和富集磺酸盐、磷酸盐的最佳工具pH02468101214k’NeutralBases(BH+)RSO3-BWAX不带电WAX带正电Acids(HA)A-RSO3-清洗2:100%MeOH(强烈清洗)样品预处理活化/平衡:MeOH/Water上样清洗1:2%甲酸(目标锁定)洗脱:2%NH4OH-MeOH(目标释放)溶剂蒸发/重新定容(选项)