第二章原料的预处理课件

第二章原料预处理一、学习目的与要求通过本章学习，要求了解细胞分离、目标产物的释放的各种基本方法，了解各种方法的优缺点和应用范围。二、学习指南

（一）细胞分离

了解：重力沉降、离心沉降和过滤的概念。

理解：离心分离与过滤原理以及提高分离效率的方法。

应用：采用不同的离心分离、过滤设备对不同的细胞进行分离。

（二）细胞破碎

理解：各种细胞破碎方法原理、优缺点及其适用范围。

应用：采用不同的细胞破碎方法对不同细胞进行不同程度的破碎。

微生物发酵或动植物细胞培养后培养液与细胞的分离，结晶体与母液的分离，浸取液与药源固体的分离都需要固液分离，在制药工程中将菌体或细胞与培养液分离是生物分离过程的第一步。1.1悬浮液的基本特性生物细胞培养液基本上属于悬浮液,其中大部分是水,培养液中水的特性与固液分离有密切的关系。第一节细胞分离1.极性：

水分子由于正负电荷的中心不重合，为极性分子。水分子之间由于氢键会发生强烈的缔合作用，如与固体物料表面发生氢键作用，则会强化水分子在物料表面的附着状态而不利于固液分离的进行。

2.粘性：

反映了流体分子间的相互作用，它是温度的函数，改变温度会对分离效率产生显著的影响。

3.表面张力:

表面张力随温度的升高而降低。液体介质的表面张力越大，固液分离越困难，因此，降低水的表面张力，是提高固液分离的有效途径之一。1.2悬浮液的预处理：

1.预处理的目的：

（1）改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分离固形物的

速度，提高固液分离的效率。

（2）尽可能使产物转入便于后处理的某一相中。

（3）去除发酵液中部分杂质，便于后续操作。

2.预处理的方法：

（1）加热法：可降低悬浮液的粘度，加速聚集作用以除去杂

蛋白，破坏凝胶状结构，增加滤饼孔隙度，提高分离效

率。

（2）调节悬浮液的pH值：促进凝聚作用。

（3）凝聚和絮凝：将化学药剂预先投加到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可分离的絮凝体，在进行分离。特点：使颗粒尺寸增加，增大颗粒的沉降或浮选速率，提高滤饼的渗透性或在深床过滤时产生较好的颗粒保留作用。凝聚：在投加的化学物质（如铝、铁的盐类或石灰等）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成1mm大小块状凝聚体的过程。絮凝：使用絮凝剂（天然或合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。1.3重力沉降（适用于分离较大的颗粒）

重力沉降的先决条件是固相和液相间存在密度差。重力沉降过程中固体颗粒受到重力、浮力和摩擦阻力的作用。根据斯托克思定律，当浮力、摩擦阻力和重力达到平衡时，球形固体颗粒均速沉降，沉降速度为：由于菌体细胞的直径很小，沉降速度很慢，因此常需向菌体的料液中加入絮凝剂，使菌体细胞凝聚成较大颗粒后过滤除去。1.4离心沉降（适用于分离较小的颗粒）广泛应用于固液、液液相的分离。1.离心沉降速度S=从该式中可看出：①当ρs＞ρL，则S＞0，粒子顺着离心方向沉降。②当ρs＝ρL，则S＝0，粒子到达某一位置后达到平衡。③当ρs＜ρL，则S＜0，粒子逆着离心方向上浮。离心沉降时，颗粒的相对分子质量越大，沉降系数越大，离心沉降速度越大。令：S为沉降系数2.离心分离法（1）差速离心分离：

原理:利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别（大而重的颗粒沉降最快，最先到达底部），在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分级沉淀。

操作过程：一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。优点：操作最简便，使用最广泛。缺点：差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。（2）区带离心根据离心操作条件不同，可分为差速区带离心和平衡区带离心。

差速区带离心法：在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加，待分离的样品铺在梯度液的顶部，同梯度液一起离心。离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大，但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρs＞ρL。

这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。梯度液在离心过程中以及离心完毕后，取样时起着支持介质和稳定剂的作用，避免因机械振动而引起已分层的粒子再混合。用于差速区带离心分离的物质密度必须大于梯度液中最大密度，离心过程必须在被分离物区带到达管底前停止。由于ρs＞ρL，可知S＞0，因此该离心法的离心时间要严格控制，既有足够的时间使各种粒子在介质梯度中形成区带，又要控制在任一粒子达到沉淀前。如果离心时间过长，所有的样品可全部到达离心管底部；离心时间不足，样品还没有分离。由于此法是一种不完全的沉降，沉降受物质本身大小的影响较大，一般是应用在物质大小相异而密度相同的情况。常用的梯度液有Ficoll、Percoll及蔗糖。)平衡区带离心（等密度离心法）:在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρL＞ρs时粒子上浮；在弯顶处ρs＞ρL时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρs＝ρL，此时粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，区带与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。3.离心分离设备实验室用离心机以离心管式转子离心机为主。生化用离心机一般为冷却式，可在低温下操作，称为冷冻离心机。工业离心分离设备常用的有管式和碟片式两大类。管式离心机：应用：A、液-液分离(连续式)，

B、低固体含量(<1%)的固-液分离(间歇式)。主要技术指标：

A、离心管直径40-150mm，长径比4-8；

B、离心强度8000—15000g；

C、处理能力100-400L/h；

D、适应的颗粒直径0.01-100mm，固液密度差大于0.01g/cm3，固体含量小于1%优点：A、结构简单，价廉，

B、分离效果好，分离因数高8000—15000g缺点：A、处理能力有限，间歇操作;

B、低固体含量的悬浮液(<1%)碟式离心机：化学、制药和生化工业应用最广泛

特点：

A、10-100个锥顶角为60-100°的锥形碟片；

B、碟片距离很短0.5-2.5mm，沉降距离极短，分离效果高；

C、碟片多，沉降面积大，增加分离效果；

D、抗对流效果高。分类：

Ａ、人工排渣式;

Ｂ、喷嘴排渣式;

C、活塞排渣式。1.5过滤定义：利用多孔性介质截留固液悬浮液中的固体粒子，进行固液分离的方法。由于制药工程中过滤的对象大部分是生物体，发酵液中的微生物细胞等均是易变形的柔软体，一经压缩就会变形；并且发酵液的粘度也很大，因而发酵液的过滤操作就显得十分困难。过滤滤饼过滤：深层过滤：固体粒子在过滤介质表面积累，很短时间内发生架桥现象，沉积的滤饼也起过滤介质作用固体粒子在过滤介质的孔隙内被截留，固液分离发生在整个过滤介质内部滤饼过滤：过滤基本方程：

对于可压缩滤饼生物过程中，可压缩滤饼最为常见。由于可压缩滤饼的比阻随压力差提高而增大，因此，过滤操作中，压力差是重要的操作参数，对可压缩滤饼，一定要缓慢增大操作压力。滤浆滤饼过滤介质滤液滤饼过滤过滤时，按照外加压力和流速的变化，可将过滤操作分为：①恒压过滤－用压缩空气或真空作为推动力②恒速过滤－用定容泵来输送料液③变速－变压过滤－用离心泵来实现。由于滤饼是影响过滤速度的主要因素，因此在过滤操作前，要对滤液进行絮凝等预处理，降低滤饼的阻力。另外，还可在料液中加助滤剂（如硅藻土）提高过滤速度。深层过滤：过滤过程中颗粒的运动：①迁移行为：颗粒运动到过滤介质内部孔隙表面的行为，其作用力有：扩散作用力，重力，惯性力。颗粒的粒度大小与截留效率有密切关系。粒径为1微米时截留效率最小。②附着行为：颗粒迁移到过滤介质的滤粒表面时，两者间相互作用力的性质决定能否产生附着。固相成分、液相离子组成和离子浓度、pH值等会影响颗粒与介质表面的电性和荷电量，进而影响附着效果。③脱落行为：当颗粒或颗粒团与过滤介质表面的结合力较弱时，它们会从介质孔隙的表面脱落下来。脱落的原因有：流体对附着的颗粒的剪切作用，运动的颗粒对附着的颗粒的碰撞。过滤介质：按过滤原理按材质按结构表面过滤介质深层过滤介质天然纤维合成纤维金属玻璃塑料陶瓷柔性刚性松散性过滤介质的特性：机械性能刚度，强度，蠕变或拉伸抗力，移动的稳定性，抗摩擦性，振动稳定性，可制造工艺性，密封性，可供应尺寸使用性能化学稳定性，热稳定性，生物学稳定性，动态稳定性，吸附性，可湿性，卫生和安全性过滤性能截留的最小颗粒，截留效率，清洁介质的流动阻力，纳污容量，堵塞倾向基本性能：过滤性能：1.截留率：被截留颗粒量与参与过滤的全部颗粒量之比。2.渗透率：反映其对流体流过时的阻力，渗透率越大，阻力系数越小。3.剥离性能：用刮刀、绳索或剥离辊等卸料装置，使滤饼与过滤介质分离的难易程度。4.再生性能：过滤介质表面或内部被固相颗粒阻塞后用不同方法进行清洗，过滤介质性能恢复的程度。5.物理性能：过滤介质的断裂强度、断裂延伸及耐磨性等。6.化学性能：耐腐蚀性。新型过滤介质：1.无石棉过滤板:

由极细纤维、细硅藻土和合成聚合物（带正电荷的树脂）精确混制而成。空隙率高，可吸附微小颗粒。属深层过滤。可用于过滤制药工程中的发酵液，能除去药物中的热源物质。2.金属过滤介质：楔形端面金属丝筛网：楔形金属丝筛网的孔眼不易被颗粒堵塞。材质为：不锈钢、碳素钢、镀锌碳钢、黄铜、紫铜、磷青铜、铝合金及镍、钛等特殊合金。B.烧结金属过滤介质：将金属（网、粉末、纤维）置于真空中，使之受热至温度为熔点温度的90%，并施加一定时间的压力，使金属各接触点的原子相互扩散而结合在一起。耐高温、高压，且过滤精度高、寿命长。3.多孔陶瓷：一般由熔融的玻璃基与硅酸盐颗粒结合在一起。具有耐高温、耐腐蚀等特点。4.纤维素长带条缠绕滤芯：由纤维素长带条按螺旋形缠绕而成，带条经过酚醛树脂浸渍，并通过热处理而硬化。属表面过滤，可用流体逆洗再生。价廉，强度好，耐热性好，耐腐蚀，易清洗再生。5.纤维素非缠绕滤芯：经过专有的制毡浸渍过程制造的管形滤芯。其纤维密度沿径向变化，内部较致密，空隙较小。因此大颗粒被外部截留，小颗粒被内部截留。属深层过滤。过滤介质的选择与评估：1.介质材料的孔隙大小及截留粒子的能力2.过滤介质的渗透性3.过滤介质的抗堵塞性能及再生能力过滤设备:

生化工业常用的过滤设备主要有加压叶滤机、板框过滤机、回转真空过滤机等。制药生产中药液的固液分离应用:中药的过滤分离:特点:含有动植物蛋白、多糖等胶体与胶状体物质；大多形成可压缩滤饼，且滤饼比阻较大；容易聚合成大分子，产生絮状物；对过滤介质要求高；固液密度差小，分离收率低。措施：采用预处理（加热、加入添加物）及多种分离技术的组合工艺（先粗滤再精滤）。发酵液的过滤分离：特点：典型的非牛顿流体，含有菌丝体、多糖类残留培养基及其代谢产物等，其粘度和可压缩性很大。分离方法：板框过滤机、转鼓真空过滤机，螺旋离心机和碟片离心机等。活性炭与脱色后药液的过滤：特点：活性炭颗粒很细，滤布介质很难一次达到过滤效果。方法：采用多次复滤，过滤介质采用纤维黏结过滤管或微孔膜滤芯。药液除菌过滤：常采用带正电荷的非石棉滤板代替石棉滤板和微孔膜滤芯。结晶体的过滤：晶体较粗大，一般采用三足式离心过滤机。制药生产中分离技术的发展：

生物化工、制药、精细化工、新型材料等高新技术领域的发展，对固液分离技术提出了更高的要求。其发展主要集中在以下几方面：1.大处理量的高效分离设备的研发。2.高纯制品和高纯水的高精密过滤装置的研发。3.对高可压缩、高粘度、高分散性的难分离物料的分离技术的研究。4.传统工业中的固液分离技术与设备的改进。5.对高要求产业的集成工艺的研发。制药生产中固液分离方面存在的问题:对欲分离的物料的物性了解不够，造成工艺的确定、分离设备的选型和操作条件的确定无法作到科学、合理。2.沿用老习惯，使得分离方法选用不当。3.由于对物料物性的了解不够，造成操作条件不甚合理（压力、温度、分离因数等）。4.对预处理技术了解和应用不够。5.有于不清楚颗粒的粒径分布，使过滤介质选择不合理。6.采用新型分离技术和多种分离工艺的集成还较欠缺。当获得澄清的发酵液后，就可从这澄清的发酵液中提取需要的产品。但某些情况下，感兴趣的产品不在发酵液内，而在细胞内部，因此对细胞内物质的提取，必须先把细胞破碎，使胞内物质释放出来，然后再提取产品。

细胞破碎是指用物理、化学、酶、或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜的方法。

细胞破碎的方法，主要有机械法和非机械法两大类。第二节细胞破碎

2.1细胞的结构

细胞壁的破碎最为关键。动物细胞没有细胞壁，易于破碎。植物和微生物细胞的细胞壁坚固，破碎困难。1.细菌：革兰氏阳性菌的细胞壁主要由肽聚糖层组成，细胞壁厚，约15－50nm；

革兰氏阴性菌的细胞壁在肽聚糖的外侧还有脂蛋白和脂多糖及磷脂构成的两层外壁层，革兰氏阴性菌的肽聚糖层1.5-2nm，外壁层8-10nm，因此革兰氏阳性菌的细胞壁比革兰氏阴性菌坚固，较难破碎。

2.真菌和酵母的细胞壁呈丝状，比革兰氏阳性菌的细胞壁厚，约60nm，更难破碎；

3.霉菌:细胞壁较厚，约100－250nm；

4.哺乳类细胞和嗜盐菌缺乏坚硬的细胞壁，支原体没有细胞壁，易破碎；

5.藻类的细胞壁较复杂，其主要成分是纤维状的多糖类物质。

破碎细胞的目的就是使细胞壁和细胞膜受到不同程度的破坏（增大通透性）或破碎，释放其中的目标产物。2.2细胞破碎和产物释放原理细胞破碎主要采用各种机械破碎法和非机械破碎法，或二者的结合。

机械破碎中细胞所受的机械作用力主要有压力和剪切力。机械破碎处理量大、破碎效率高、速度快，主要靠均质作用和球磨碾磨作用；采用机械法，发热是一个主要问题。

细胞的机械破碎主要有高压匀浆、珠磨、撞击破碎和超声波破碎等方法。非机械破碎包括化学法、酶法和物理法。化学法和酶法是利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜的结构，增大胞内物质的溶解速率；或完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压的作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。物理法是利用渗透压或温度的变化使细胞破裂后释放胞内物质。2.3细胞破碎法破碎方法机械方法非机械方法固体剪切力流体剪切力干燥处理溶胞处理球磨法压榨法高压匀浆超声法酶溶法化学法物理法1.压力破碎法：利用压力释放时的固液剪切进行破碎。操作简单，可连续操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，同时破碎率低。高压匀浆器的破碎原理：

细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速（可达到450m/s）喷出后撞击到碰撞环上细胞在受到高速撞击作用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合作用下破碎。操作压力通常为50～70Mpa。影响因素：压力、循环操作次数和温度。

高压匀浆法适用于酵母和细菌细胞的破碎

影响因素:压力、循环操作次数和温度。

高压匀浆法适用于酵母和细菌细胞的破碎2.珠磨破碎法：利用固体的剪切进行破碎，是最有效的一种细胞物理破碎法。操作简单，可连续/批式操作，适用面广，但操作会产生热，需有冷却系统，不同细胞的破碎条件差异大。珠磨法操作的有效能利用率仅为1％左右，破碎过程产生大量的热能。设计时要考虑换热问题。珠磨的细胞破碎效率随细胞种类而异，适用于绝大多真菌菌丝和藻类等微生物细胞的破碎。与高压匀浆法相比，影响破碎率的操作参数较多，操作过程的优化设计较复杂。3.撞击破碎

原理：细胞是弹性体，比一般刚性固体粒子难于破碎。将弹性细胞冷冻使其成为刚性球体，降低破碎难度。

操作：细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（冻结速度为数千℃／min），形成粒径小于50μm的微粒子。高速载气（如氮气，流速约300m/s）将冻结的微粒子送入破碎室，高速撞击撞击板，使冻结的细胞发生破碎。

特点：①细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬间，细胞破碎均匀，可避免反复受力发生过度破碎的现象；②细胞破碎程度可通过无级调节载气压力（流速）控制，避免细胞内部结构的破坏，适用于细胞器（如线粒体、叶绿体等）的回收。

撞击破碎适于微生物细胞和植物细胞的破碎。

4.超声破碎法：机理：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。该法操作简单，可连续/批式操作，超声波破碎很强烈，适用于多数微生物的破碎，有效能利用率低，破碎过程产生大量的热，对冷却的要求相当苛刻，故不易放大，主要用于实验室规模的细胞破碎。影响因素：声强、声频、温度、时间、离子强度、pH、细胞类型。5.化学试剂处理：用表面活性剂或有机溶剂（甲苯）处理细胞，增大细胞壁的通透性，降低胞内产物的相互作用，使之容易释放。该法简单，内含物释放少，产物较纯，可规模化生产，但适用面窄。6.酶溶：利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全破坏后，增大胞内产物的通透性，使产物得以释放。该法操作简单、温和，选择性强，酶能快速地破坏细胞壁，而不影响细胞内含物的质量，但缺点是酶的费用