医学分子生物学(PCR)-课件

医学分子生物学

课程主要内容第一部分生物大分子的分离纯化第二部分分子生物学常用技术（PCR、核酸分子杂交、基因测序、生物芯片等）第三部分基因工程第二部分分子生物学常用技术

(一）聚合酶链式反应

(PolymeraseChainReaction,PCR)核酸(DNA,RNA)

碱基互补配对A=T,C≡G,A=U核酸变性与复性核酸合成

DNA复制（DNA－DNA），

逆转录（RNA－DNA）；

转录（DNA－RNA），

RNA复制（RNA－RNA）；——由亲代DNA合成两个相同的子代DNA的过程（DNA指导的DNA生物合成）。

半保留复制（semiconservativereplication）DNA复制(replication)

按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。半保留复制的意义

遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，这种保守性是相对的，自然界存在遗传变异性(碱基错配)。生物体内DNA复制非常复杂DNA复制-DNA的酶促合成：DNA聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶（DDDP），简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA分子；底物（substrate):

4种脱氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；引物（primer）:

一段RNA；DNA聚合酶——DNA生物合成

※大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（E.ColiDNApolymeraseⅠ

）和Klenow片段

※大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ－复制中DNA链延伸

※大肠杆菌DNA聚合酶Ⅱ323个氨基酸小片段5核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604个氨基酸木瓜蛋白酶Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

N端C端FG5

DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性

DNA聚合酶Ⅰ（DNA-polI）大肠杆菌DNA聚合酶I具有三个结构域

DNA聚合酶Ⅰ

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是单一多肽链的多功能酶，分子量为103kD，它具有3种酶活性：①5→3

DNA聚合酶活性。②3→5

核酸外切酶活性。③5→3

核酸外切酶活性。（DNA合成）（校对）（切除RNA引物和突变序列）

DNA聚合酶催化的反应

5

至3

的聚合活性

dTTP3'(dNMP)n+dNTP

(dNMP)

n+1+ppi3'

ATGCAATTGC5'||||5

TACGppiT依赖DNA的DNA聚合酶（DNA-dependentDNApolymerase,DDDP）

5’AGCTTCAGGATA

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’35

外切酶活性

53外切酶活性?切除引物或突变的DNA片段辨认错配的碱基对，将其水解－校对

核酸外切酶活性

复制的保真性(fidelity)

DNA聚合酶对模板的依赖性，是子链与母链能准确配对的保证。复制过程中，复制的保真性至少依赖三种机制：1、遵守严格的碱基配对规律2、聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能3、复制出错时DNA-pol的及时校读功能DNA复制-DNA的酶促合成：DNA聚合酶(polymerase):

依赖DNA的DNA聚合酶（DDDP），简写为DNA-pol；模板(template):

解开成单链的DNA分子；底物（substrate):

4种脱氧核苷三磷酸（dATP，dGTP，dCTP，dTTP）；引物（primer）:

一段RNA；如何获得单链DNA模板？？多种蛋白质参与（以大肠杆菌为例）解链酶（helicase）；单链结合蛋白（single－strandDNAbindingprotein，SSB）；DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase

）解链酶（helicase)

——

利用

ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。单链DNA结合蛋白（SSB）

SSBDnaBDnaC解链方向DNA解链过程形成超螺旋拓扑异构酶解除超螺旋DNA线性双螺旋从中间解链上下都过度拧紧超螺旋进一步解链就更加困难拓扑异构酶I切开超螺旋的单链，再连接成双链。无需ATP。拓扑异构酶II切开超螺旋的双链，解除超螺旋，再连接成双链。参与复制全过程剪切-旋转-连接DNA生物合成条件：依赖DNA的聚合酶(DDDP)；单链DNA模板(template)；底物（substrate):4种dNTPs；引物（primer）DNA复制中为何需RNA引物？DNA聚合酶没有从头催化2个游离的脱氧核苷三磷酸聚合的能力；只能在3’-OH端与按碱基配对的dNTP进行反应，生成磷酸二酯键；引物提供游离的3’-OH末端；5’

A-G

3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’引物酶(primase)

在模板的复制起始部位催化NTP的聚合,

形成短片段的RNA，即引物（primer）。依赖DNA的RNA聚合酶DDRP半不连续复制（semi－discontinuousreplication）一条链合成是连续的（前导链），一条链合成是不连续的（后随链）；DNA合成的方向性（5’→3’）与反向互补DNA聚合酶：53

聚合酶活性聚合反应的方向性:

53DNA连接酶(DNAligase)岗崎片段的连接

连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，使二者生成磷酸酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。一、聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)

在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，即体外DNA扩增技术。DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase，DDDP）

穆利斯

K.Mullis1945-，美国1993年诺贝尔化学奖PCR－酶促DNA合成DNA聚合酶（DNAdependentDNApolymerase，DDDP）

－－合成DNA新链DNA模板：单链DNADNA引物：提供3’－OH末端底物：四种dNTP基本原理：类似体内DNA复制(合成双链DNA）-DNA聚合酶核酸的热变性和退火变性-获单链模板退火-单链模板与引物结合延伸－DNA新链合成指数扩增－循环多次耐热的DDDPPCR循环–第一步

–加热变性靶序列靶序列PCR循环-第二步–引物与靶序列退火靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’PCR循环-第三步-引物延伸靶序列靶序列Primer1Primer2BiotinBiotin5’3’5’5’3’5’3’3’Taq

DNAPolymerase第1个PCR循环完成后–

得到两个拷贝的靶序列靶序列

靶序列BiotinBiotin30次循环后靶序列扩增的数量No.of No.AmpliconCycles CopiesofTarget1 22 43 84 165 326 6420 1,048,57630 1,073,741,7661cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon

PCR的主要用途

（一）目的基因的克隆，序列分析（二）基因的体外突变，多态性研究（三）DNA的微量分析PCR扩增条件

94℃,300S（预变性）

94℃,30S（变性）

25～40cycles

55~65℃,30S72℃,30~120S

（退火，与引物有关）

72℃,10min（延伸，与扩增长度有关）

45℃

65℃209bp退火温度的选择

梯度PCR(多温控)

PCR反应的影响因素：模板(DNA)聚合酶（耐热的TaqDNA聚合酶）dNTPs（dATP，dCTP,dGTP，dTTP)

缓冲液DNA引物(10μM)

与待扩增目的基因两端序列互补的寡核苷酸链，决定PCR扩增产物的特异性和长度。

DNA聚合酶

耐高温保真性（防止错配）活性（Mg2+)（3’－5’外切酶活性）

TaqDNA聚合酶

(无3’5’外切酶活性，35轮0.25%错配，与原始模板有差别)ExTaqDNA聚合酶，TthDNA聚合酶，PfuDNA聚合酶等

TaqDNA聚合酶活性依赖Mg2+(激动剂)

不同的酶需不同浓度的Mg2+

Taq：Mg2+对反应影响很大，0.5mM-1.5mM终浓度

pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍

外界影响：

EDTA鳌合Mg2+∴选较低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；

DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与Mg2+

结合，降低Mg2+有效浓度。∴如果扩增产物或效率不理想，要注意调整合适的Mg2+浓度

Mg2+

质粒DNA噬菌体DNA染色体DNAcDNA

较小较大通常单拷贝较小

变性较易变性较难非常大，变性难变性较易

模板用量

Plasmid:lng，Chromosome:300-500ng,cDNA:0.5-1μl注意：

模板质量很关键，防止交叉污染模板DNA

dNTP

四种脱氧核苷酸，浓度必须一致终浓度：50-200M注意：不稳定，保存时间长会失效；

与待扩增目的DNA两端序列互补的寡核苷酸链，决定PCR扩增产物的特异性和长度。

DNA引物(primer)：解决方案:

避免反复冻融，分装冻存；引物设计一般遵循的原则长度：15－30bp碱基分布的随机性

G+C含量在40%－60%,Tm=4(G+C)+2(A+T)两引物间避免互补，以防形成引物二聚体引物自身也不应互补，以免引起自身折叠引物的3′端：不能修饰，不应错配引物的5′端：可加修饰位点特异性：与非特异靶区之间的同源性不能超过70%

或有连续8个互补碱基同源

人工合成短寡核苷酸片段，Tm=55℃-80℃，两条引物Tm值要相近，最好一致。

上游Primer与下游Primer正向/反向引物

一条链为设计模板，5’端相同，3’端互补引物设计（一）

ratbeta-nervegrowthfactorsequence5’-301

gttctacact

ctgatcacag

cgtttttgat

cggcgtacag

gcagaaccgt

acacagagat361

caatgtccca

gagggagact

ctgtccctga

agaccactgg

actaaacttc

agcattccct421

ctgacacagc

cctacgcaga

gcccgcagtg

cccctgctga

accaatagct

gcccgtgtga481

agggacgacc

cgcaacatca

ctgtggaccc

caaactgttt

aagaaacgga

gactccgttc541accccgcgtg

ctgtttagca

cccagcctcc

caaactgttt

aagaaacgga

gactccgttc

-3’Primer1:(5’)gatcgg

cgt

aca

ggc

agaac(3’)328-347Primer2:(5’)gaggct

ggg

tgc

taa

aca

gc(3’)569-550反向互补扩增产物长度：242bpPCR扩增NGF基因（大鼠）

Primer本身不要出现内部互补序列－－形成发夹(Hairpin)，内部二级结构如：

GGGTCGATTCCTACCCATGC

减少Primer自身及引物间互补序列，一般不要超过3个互补bp

－－导致二聚体(dimer)

引物设计（二）

如：CCCATGCATGGAGTC

::::::::GGGTCTATCAGTAAGC

修饰：

如：32P、生物素、荧光素，酶切位点等，不影响其效果

突变：模板

3’

AGCTCCATGACCCAG5'引物

5’CGCTCCATGACCCAG3'

注意：绝不可以在3'端进行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸

Primer5’未端可修饰、突变:引物设计（三）

引物设计步骤：获取包含待扩增DNA的核酸序列；引物设计软件选择合适引物；设计的引物序列的特异性分析；网络利用核酸序列的获得(基因组DNA序列，mRNA序列）核酸序列的比对文献资料的获得核酸序列数据库

1、美国国家生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）：网址：http:///。2、欧洲生物信息学研究所（EuropeanBioinformaticsInstitute,EBI），以及所维护的EMBL数据库（http://www.ebi.ac.uk/embl）。3、日本国立遗传学研究所（JapanNationalInstituteofgeneticscenterforinformationbiology）的DDBJ数据库（DNADataBankofJapan）(http://www.ddbj.nig.ac.jp)。

nucleotideSearchgene

unigeneHomosapiens;Rattusnorvegicus;Musmusculus;ORF（openingreadingframe）Completecds;Partialcds;MyNCBI

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SNPGeneView:15ClicktochangefilterselectionthroughMyNCBI.RecentActivityClearTurnOffTurnOnnervegrowthfactorAND(...nervegrowthfactorAND(betapolypeptide)(29)NGFB(15)

NGFB(127)

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1:OrdercDNAclone,LinksNGFOfficialSymbolNGFandName:nervegrowthfactor(betapolypeptide)[Homosapiens]OtherAliases:Beta-NGF,HSAN5,MGC161426,MGC161428,NGFBOtherDesignations:OTTHUMP00000013653;beta-nervegrowthfactor;nervegrowthfactor,betapolypeptide;nervegrowthfactor,betasubunitChromosome:1;Location:1p13.1Annotation:Chromosome1,NC_000001.9(115630060..115682380,complement)MIM:162030GeneID:48032:LinksNgfOfficialSymbolNgfandName:nervegrowthfactor(betapolypeptide)[Rattus

norvegicus]OtherAliases:NgfbOtherDesignations:nervegrowthfactor,betaChromosome:2;Location:2q34Annotation:Chromosome2,NC_005101.2(197625773..197632960)GeneID:3107383:OrdercDNAclone,LinksngfOfficialSymbolngfandName:nervegrowthfactor(betapolypeptide)[Xenopus(Silurana)tropicalis]OtherAliases:beta-ngf,hsan5,ngfbGeneID:1001701614:OrdercDNAclone,LinksNGFnervegrowthfactor(betapolypeptide)[Bos

taurus]OtherAliases:NGFBOtherDesignations:nervegrowthfactor,betapolypeptideChromosome:3;Location:3q23Annotation:Chromosome3,NC_007301.3(30482339..30491561)GeneID:281350MyNCBI

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引物设计软件

综合使用（两种以上）(DNAstar,primer,primerpremier5，Oligo6)

网络引物设计GenBank比对，证实没有与其他非目的DNA有高度互补。

BLAST

NCBI网页的BLAST界面（序列比对）

gatcgg

cgt

aca

ggc

agaacNCBI网页的BLAST2SEQUENCES界面PCR产物的鉴定（一）

－凝胶电泳琼脂糖凝胶

———用于分离100－10000bp的片段;

操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高聚丙烯酰胺凝胶

———用于分离5－500bp的片段;效果好、分辨率极高，相