特殊毒性作用及其试验与评价方法-课件

特殊毒性及其试验

★

特殊毒性试验:

♦致突变试验

♦致畸试验

♦致癌试验

♦

繁殖试验（生殖试验）

♦

行为试验1ppt课件一、致突变试验

（一）细菌回复突变试验（Amestest）

(1)原理

试验菌种野生型突变型鼠伤寒沙门氏菌

his+his-

在缺乏his的培养基

能生长

不能生长

主要是检查受试物引起遗传物质结构的改变及其引起的性状变异的试验his-AA缺乏2ppt课件

Ames试验原理：野生型His+突变型

His-正向突变回复突变物理化学等因素处理受试物His-培养基接种能生长有致突变性不能生长无致突变性+3ppt课件(2)使用菌株Ames1975年推荐的沙门氏菌标准菌株为：

TA98,TA100,TA1535,TA1537,TA1538;

1983年改推荐用:

TA97,

检测移码;

TA98,

检测碱基置换;

TA100,检测碱基置换及移码;

TA102,检测碱基置换及移码。4ppt课件(3)试验方法致突变试验分体内体外两种情况：体外试验：检测间接致突变物，需加S9(体外代谢活化系统)，此法称微粒体间介法。体内试验：可检测直接及间接致突变物，不必加S9

此法称宿主间介法。5ppt课件(4)关于突变类型

分为:基因突变和染色体畸变

1.基因突变(genemutation)或称点突变(pointmutation):

是指不能用光学显微镜直接观察到的遗传物质损伤

基因突变是遗传物质在分子水平上的改变。

包括：

碱基置换（basesubstitution）

移码（frameshift）

大段损伤（Largedeletionorinsertion）

6ppt课件

①

碱基置换：

某一碱基脱落或配对性能改变

DNA复制时碱基错配（mispairing)

第二次DNA复制时按正常配对

遗传下去

*转换(transition)：AGCT

*颠换(transversion):ATGC

无论转换或是颠换都只涉及一对碱基,故称点突变。

*后果：三联密码子的改变，可能出现同义密码，错义密码或终止密码，从而使基因表达改变。7ppt课件

②

移码

是DNA中增加或减少一对或几对不等于3的倍数的碱基改变所造成的突变。

这种突变可造成整个DNA或一个基因阅读框架的改变。

后果：移码易造成致死性突变；

8ppt课件9ppt课件

③大段损伤

是指DNA链的大段缺失或插入。可能涉及数以千计的Nt（核苷酸）

。

*小缺失（smalldeletion):

缺失的Nt远远小于显微镜的观察能力。

*插入（insertion):一段游离Nt整合到另一染色体的某一位置。

*转座子（trasposon):在质粒（plasimd)与质粒之间和质粒与染色体之间可能出现转移位置的小段DNA。这种位置的转动称为转座（transposition)

*后果：a.gene突变；b.产生新的gene

c.染色体畸变；d.生物进化。10ppt课件

2.染色体畸变

①结构畸变

*裂隙和断裂(gapandbreak):

仍保持线状连接者为裂隙,无线状连接者为断裂

*无着丝粒断片和缺失(acentricfragmentanddeletion)

微核(micronucleus):

无着丝粒断片。

微小体（minutebody):

小于染色体宽度的无着丝粒断片,常成双出现。

*环状染色体(ringchromosome)

*倒位(inversion):

断片倒转180°再重接。11ppt课件

*插入和重复（insertionandduplication)

*易位（translocation)

*染色体交换（chromatidexchange):

指两条或多条染色单体断裂后变位重接。

分为：内换（intrachange):同一染色体内的染色单体交换

互换（interchange):不同染色体间的染色单体交换

*姐妹染色单体交换（sisterchromatidexchange,SCE):

用5-Brdurd掺入DNA合成代替了T，产生染色单体差示染色，可见到两条姐妹染色单体染色一深一浅，如某一染色体在姐妹染色单体间发生了同源节段内换，同源节段染色一深一浅，这种现象称SCE。用以分析染色体畸变。(图示)12ppt课件各有一互补链

不带Brdude的原链第二周期插入Brdu产生同等干扰带Brdu的新链合成

出现差示染色

断裂、重排

同位节段互换13ppt课件染色体畸变裂隙(gap)

断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)

微小体(minutebody)

无着丝点环环状染色体

双着丝点染色体

倒位(inversion)

易位(translocation)

插入(insertion)和重复(duplication)辐射体

14ppt课件②染色体数目异常

整倍性畸变：单、三、四、多倍体

数目畸变

非整倍性畸变：2倍体多一条或少一条或多多条或少多条

2n-1,2n-2,…2n+1,2n+2,…

染色体数目畸变的原因：

a.不分离；b.染色体丢失；

c.染色体桥；d.核内复制。15ppt课件(二)精子畸形试验

*常用小白鼠染毒,观察其精子畸形。

*精子畸形表现：无钩，香蕉形，无定形，胖头，双头,双尾，尾折叠等。

*常与亚慢性毒性试验结合进行。16ppt课件（三）染色体畸变分析

*

常用骨髓细胞观察。

*观察的内容有：

染色体数目畸变：正常:小鼠2n=40,大鼠2n=42

犬2n=78,猫2n=38,豚鼠2n=64

兔2n=44,鸡2n=78,灵长类2n=42

人2n=46。

染色体结构畸变：裂隙,断裂,微小体,环状,粉碎,多射体

*剂量设计及分组:

最高剂量组:LD50的1/8-1/10;

中间剂量组:

最高剂量组的1/15;

最低剂量组:

最高剂量组的1/20。17ppt课件（四）微核试验

*微核：细胞核之外，与核染色性一致的颗粒，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，形似杏仁状或圆形。

*来源：染色体断裂而形成的无着丝粒断片。

*意义：说明染色体的完整性发生了改变，或染色体分离改变,表明受试物对遗传物质产生了损伤。

（五）分子生物学方法（PCR检测）18ppt课件突变的不良后果突变的不良后果

体细胞突变生殖细胞突变癌变致畸衰老配子死亡死胎自发流产先天畸形19ppt课件二、致畸试验

（一）概念

主要是检查受试物对动物子代的致畸作用。

致畸作用包括：

1.母体效应:

受试物对母体产生了损害作用,从而影响了正常妊娠,而不是对胚胎的直接损害。

2.胚胎效应:

受试物对胚胎的直接损害作用。

3.出生前胎儿效应:

出生胎儿出现外表或内脏畸形。

4.出生后效应:

引起子代的生理功能或生理结构的缺陷。如,后天生长发育或生殖功能受影响。20ppt课件（二）剂量设计及分组

高剂量组：LD50的1/5或1/3。原则是引起母体轻度中毒，死亡率<10%;

低剂量组：LD50的1/30～1/100。原则是不引起母体的任何中毒症状。

中剂量组：在高、低剂量之间成等比关系。原则是只引起母体极轻微毒性反应。

或者以实际接触量为低剂量，以其10倍量为高剂量。

（三）观察内容

产前剖腹产，检查活胎，死胎，吸收胎，黄体数及外形和内脏畸形情况。21ppt课件胎仔检查自然分娩前1-2日将受孕动物处死，剖腹取出子宫及活产胎仔，并另行记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第19-20天，小鼠第18-19天，家兔在第29天。

22ppt课件

（四）致畸结果分析

母体LD50

致畸指数

=

最小致畸量

评价：致畸指数<10,为不致畸；

致畸指数10～100，为致畸物；

致畸指数>100,为强致畸物。

致畸危险指数

=最大不致畸剂量/最大可能摄入量

评价：致畸危险指数>300,说明致畸危险性小；

致畸危险指数100～300，为中等致畸危险性；

致畸危险指数<100,为致畸危险性较大。23ppt课件三、致癌试验(经典方法)（一）概念

长期小剂量接触受试物观察其对实验动物的致癌作用实验动物：大鼠，小鼠，犬及猴。

（二）剂量

分两种情况：

1.只了解受试物有无致癌作用的可能性：设两组：①最大耐受量；②最大耐受量的1/3～1/4

2.除了解受试物有无致癌作用的可能性外,还要确定其最小致癌作用剂量:

24ppt课件一般要设五组:

高剂量组:

稍高于亚慢毒性阈剂量,使产生轻微中毒;

中、低剂量组:

低于高剂量按等比设1～2组；

阳性对照组：用致癌阳性物染毒；

阴性对照组：不染毒，观察自然癌发生率。

（三）观察内容

肿瘤发生率，潜伏期，一般健康状况，自然寿命；

组织器官检查：肉眼、病理组织学检查（光镜及电镜）统计分析：与对照组比较，分析显著性差异；

流行病学调查：25ppt课件（二）致癌作用的其它试验

(1)恶性转化试验

1.原代细胞:

叙利亚仓鼠胚胎细胞(SHECell)

人成纤维细胞小鼠或大鼠支气管上皮细胞

2.细胞系:

常用BALB/C-3T3,C3H10T1/2

和BHK-21

3.病毒感染细胞:

常用RLV/RECell和SA7/SHECell26ppt课件

(2)哺乳动物长期致癌试验

为经典方法,前已述及。

（3）哺乳动物短期致癌试验

①小鼠肺肿瘤诱发试验：

一次给予受试物,1～2W后多次给予BHT,试验16-30W

②大鼠肝转变灶诱发试验:

早期转变灶用组织学观察,进一步发展可用肉眼观察肿瘤结节

③小鼠皮肤肿瘤诱发试验：

皮肤涂抹,可诱发乳头状瘤或皮肤癌；皮下注射可诱发肉瘤.

一般9个月可结束试验,本法多适用于PAH类物质

④雌性SD大鼠乳腺癌诱发试验:

一般试验期9个月。27ppt课件说明：★（3）中①、②两试验常作为新化学物致癌性筛选。★上述任一试验结果阳性,其意义与长期致癌试验相当★对于阴性结果,不能作出阴性结论,有疑问者,仍需长期试验。28ppt课件（三）关于致癌性预测

1.概述

传统的试验一般为长期试验,费时、费力、费钱

能不能用短期试验进行预测呢？鉴于化学物质致突变性与致癌性的高度关联性，

近年来多用致突变检测对致癌物进行初筛。据此，Rosenkranz等提出了一个方法，简写为

CPBS法，即：Carcinogenicitypredicationandbatteryselectionmethod（致癌性预测与试验组合选择）。29ppt课件

2.CPBS法原理

①提出一种试验组合的选择,通过聚类分析,

选择试验方案。

②获得各单向试验结果(最好选择敏感性和特异性高的方法）。

③根据Bayes原理预测受试物的潜在致癌概率

④试验项目数：一般项目数越多，预测就越准，但费用会增大。一般使用奇数项目数，如3项或5项就比4项或6项要好。30ppt课件3.预测方法

CPBS是利用Bayes公式,对一组试验结果进行连续运算,得到受试物致癌性概率。如试验结果为阳性，用公式（1）：

a+iθ+i-1

θi+=(1)

(1-a-i)+(a+i+a-i-1)θ+i-1

如试验结果为阴性，用公式（2）、（3）：

(1-a+i)θ+i-1

θi-=(2)

a-i-(a+i+a-i-1)θ+i-1

θi-=1-

θi+(3)

31ppt课件

式中：

i:

为短期试验序号

θi+：所预测化学物可能为潜在致癌物的概率

θi-：所预测化学物可能为非潜在致癌物的概率

θ+i-1：根据先前试验，对化学物潜在致癌性的估计概率。如无法估计，则取值为0.5,

表示致癌与非致癌概率均等。

a+i：

某短期试验的敏感性。

a-i：

某短期试验的特异性，如缺乏此参数，取值可为0.5代之。32ppt课件

判断标准：

θ+>

0.7潜在致癌物

0.3<θ+<0.7暂时无法下结论

θ+<0.3非致癌物

关于a+i和a-i的参数见表33ppt课件试验方法原则受试动物：性成熟大鼠、小鼠或家兔

剂量分组:一般设立三个剂量组（至少两个剂量组）和一个对照组染毒途径:动物接触受试物的方法应参照人类实际接触途径动物数:每组雌雄各16到20只，或雌16到20只，雄8到10只

生殖毒性试验

34ppt课件试验方案:三代两窝

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