学病毒感染的检查方法和防治原则优秀课件

学病毒感染的检查方法和防治原则1）掌握病毒的分离培养方法；2）熟悉标本的采集与送检原则、病毒感染的快速诊断；3）了解病毒感染的免疫预防、抗病毒治疗。学习要求内容第一节病毒感染的检查方法第二节病毒感染的特异性预防第三节病毒感染的治疗第一节病毒感染的检查方法一、标本的采集与运送病人急性期标本标本＋抗生素抑制细菌真菌繁殖病变组织加入50％甘油缓冲盐水低温保存，尽快送检。－70℃保存血清标本：在发病初期和发病后2～3W各取一份血清，对比双份血清抗体效价的动态变化。:◙

病毒的分离培养◙

病毒的鉴定◙

病毒数量及感染性测定二、病毒的分离培养与鉴定病毒的分离培养方法：

动物接种鸡胚培养细胞培养:⑴动物接种(animalinoculation)动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等优点：结果易观察，可建立动物模型缺点：有饲养条件要求，费用高、动物体内常带有潜伏病毒。目前已很少应用。⑵鸡胚培养(embryonatedeggculture)受精卵孵育9-14天鸡胚接种病毒孵育2-7天收获相应的材料进行鉴定鸡胚接种部位：尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种卵黄囊接种羊膜腔接种ChickembryoinoculationChickembryoinoculationAllantoicinoculationisdonemainlyforproductionofvaccineofinfluenzavirus.主要用于流感病毒疫苗的生产Viralreplicationproducesvisiblelesions(pocks),grey-whiteareainthetransparent(透明的)allantoic(尿囊的)membrane.Poxvirusinoculateinallantoicmembrane痘病毒绒膜尿囊膜接种优点：易管理不带微生物成本较低缺点：操作程序复杂目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒⑵鸡胚培养(embryonatedeggculture)(3)细胞培养(cellculture)根据细胞生长的方式分:

单层细胞培养（monolayercellculture）

悬浮细胞培养（suspendedcellculture）根据细胞来源、染色体特征及传代次数分:

原代培养细胞二倍体细胞株传代细胞系或株(3)细胞培养(cellculture)①原代培养细胞（primaryculturalcells)组织组织块分散的单个细胞单层细胞剪碎蛋白酶(原代细胞)单层细胞(次代细胞)传代培养培养基①原代培养细胞（primaryculturalcells)epithelialcells特点:◙对多种病毒敏感◙生长能力有限,获取成本高◙可携带潜伏病毒应用:◙病毒分离与鉴定◙病毒学实验研究◙不能用于制备疫苗①原代培养细胞（primaryculturalcells)体外分裂50~100代仍保持二倍染色体数目的单型细胞特点:◙对多种病毒敏感◙不带异种蛋白(人源性)◙

不带病毒,无致瘤潜能应用:◙病毒分离与鉴定◙病毒学实验研究◙

制备疫苗②二倍体细胞株(diploidcellstrain)fibroblasticcells③传代细胞系(continuouscellline)特点:◙对多种病毒敏感性高◙繁殖能力强,传代时间长◙有致癌危险(来源于癌细胞或突变的二倍体细胞株)应用:◙病毒分离与鉴定◙病毒学实验研究◙不能用于制备疫苗能在体外无限传代的细胞系。如HeLa,Hep-2epithelioidcells:◙

病毒的分离培养◙

病毒的鉴定◙

病毒数量及感染性测定二、病毒的分离培养与鉴定病毒鉴定：

病毒在细胞中增殖的指标

病毒形态学鉴定

病毒抗原鉴定

病毒基因鉴定⑴细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)

病毒在敏感细胞内增殖引起特有的细胞病变。

①CPE：病毒感染细胞发生形态改变SyncytiumformationincellculturecausedbyRSV(top),andmeaslesvirus(bottom).

②CPE：病毒感染细胞与邻近细胞融合③CPE：形成包涵体（inclusionbody）Syncytialformationcausedbymumpsvirusandhaemadsorptionoferythrocytesontothesurfaceofthecellsheet.⑵红细胞吸附（hemadsorption,HAd）受染细胞膜表面血凝素（HA）＋RBC表面HA受体⑶干扰现象（interference）风疹病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE（－）埃可病毒＋人胚肾细胞病毒增殖，CPE（＋）＋人胚肾细胞风疹病毒？埃可病毒CPE(-)——埃可病毒(+)

风疹病毒(+)CPE(+)——埃可病毒(+)

风疹病毒(-)

⑷细胞代谢的改变细胞培养瓶代谢变化-PH病毒在细胞中增殖的指标细胞病变效应(cytopathiceffect,CPE)红细胞吸附病毒干扰作用细胞代谢的改变病毒鉴定：

病毒在细胞中增殖的指标

病毒形态学鉴定

病毒抗原鉴定

病毒基因鉴定:◙

病毒的分离培养◙

病毒的鉴定◙

病毒数量及感染性测定二、病毒的分离培养与鉴定病毒数量及感染性测定：50%组织细胞感染量蚀(空)斑形成试验病毒总量(活病毒+死病毒)：感染性病毒量:血凝试验50%组织细胞感染量

(50%tissuecultureinfectiousdose,TCID50)概念:

测定病毒感染细胞后引起50%细胞病变的最小病毒量。方法:一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸附等指标，以能使50%细胞感染的病毒的最高稀释度作为终点。最后用统计方法计算出50%组织细胞感染量。用途:

测定感染性病毒的量和毒力分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释度的HCMV感染的HEL细胞50%组织细胞感染量(TCID50)蚀(空)斑形成试验（plaqueassay）

原理：适当浓度的感染性病毒在覆盖琼脂的细胞层上产生可见和可数的局部病灶称为蚀斑。一个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的，由蚀斑的数目可以计算出原始标本中感染性病毒的含量。PLAQUEASSAYPLAQUEASSAYPLAQUEASSAYPLAQUEASSAYPLAQUEASSAYPLAQUEASSAY分别为10-1、10-2、10-3倍稀释度的HCMV病毒液感染的HEL细胞蚀(空)斑形成试验（plaqueassay）

用途：◙测定感染性病毒量

单位:PFU(plaqueformingunit)/ml

由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。◙分纯病毒蚀(空)斑形成试验（plaqueassay）

◙已知抗原—测抗体（诊断）◙已知抗体—测抗原（鉴定病毒属、种、

型、亚型）三.病毒感染的血清学诊断(1)中和试验(Neutralizationtest)(2)血凝抑制试验(Hemagglutinationinhibitiontest)(3)免疫标记法(FIA、EIA、RIA)⑷

蛋白印迹(Westernblot)方法：三.病毒感染的血清学诊断ImmunofluorescensetestImmunofluorescensetestPositiveimmunofluorescencetestforrabiesvirusantigen.(Source:CDC)HEL细胞中CMVIE1蛋白的表达Enzymeimmunoassay(EIA)ELISAColouredwellsindicatereactivityAIDS的确诊试验Westernblot数小时内出结果形态学检查病毒成分（抗原或核酸）早期抗体检测（IgM）四.病毒感染的快速诊断（一）形态学检查电镜和免疫电镜检查普通光学显微镜检查

包涵体电子显微镜：可观察各种病毒的形态但设备贵、操作复杂，应用受限光学显微镜：可观察大病毒（痘病毒）和包涵体对一般病毒检测意义不大呼肠病毒感染回肠上皮细胞电镜照片ElectronmicrographsInclusionbodyCytomegaliccell

thatcontainsadense,"owl'seye,"acidophilicintranuclearinclusionbody

Negrybody（二）病毒成分检测1.病毒蛋白抗原检测

免疫标记技术2.病毒核酸检测

核酸扩增技术核酸杂交技术基因芯片技术

基因测序（三）早期抗体检测

可诊断急性感染

特异性IgM抗体：孕妇感染风疹病毒

检测早期抗原抗体是快速诊断的另一途径

EBV早期抗原抗体香港大学专家：患者鼻咽标本→Vero细胞培养→CPE→EM观察：冠状病毒随后加拿大和美国CDC等SARS国际协作组的多个实验室也培养出了冠状病毒利用‘免疫荧光法’将分离病毒与SARS患者血清进行血清学检测，反应呈阳性从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用RT-PCR方法从培养上清中扩增出了冠状病毒基因→测序→经Genbank数据库同源性比对，发现同源性为64%左右SARS冠状病毒的分离和鉴定加拿大专家完成了全基因组测序→发现与已知人和动物的冠状病毒的同源性差异较大→确定为一种新的冠状病毒。荷兰的病毒学家：用这种冠状病毒感染猴子→出现了与SARS病人相同的临床表现和病理特征→再次从动物学实验证实引起SARS的病原体是这种冠状病毒WHO将其命名为SARS冠状病毒SARS冠状病毒的分离和鉴定第二节病毒感染特异性预防

微生物及其代谢产物

生物制品

动物免疫血清（biologicalproducts）免疫细胞

细胞因子

预防和治疗感染性疾病灭活疫苗（inactivatedvaccine）活疫苗（livingvaccine）重组载体疫苗（recombinantcarriervaccine）亚单位疫苗（subunitvaccine）化学提取或人工合成疫苗重组疫苗（recombinantvaccine）核酸疫苗（nucleicacidvaccine）一、人工主动免疫常用生物制品二、人工被动免疫常用生物制品

免疫球蛋白

血清丙种球蛋白

细胞免疫制剂

IFN-α、β、γ细胞因子IL-2、IL-6、IL-12TNF、CSF

淋巴因子激活的杀伤细胞

——LAK细胞

第三节病毒感染的治疗1．抗病毒的化学制剂：目前抗病毒化学药物主要有核苷类药物。（1）核苷类药物：通过阻抑子代病毒基因的合成与表达，抑制病毒复制.常用药物有:用于DNA病毒感染:阿糖腺苷、碘尿苷、无环鸟苷（阿昔洛韦）、丙氧鸟苷；用于HIV感染:叠氮脱氧胸苷（AZT