生化考研04NucleicAcid(175-8)课件

Chapter4NucleicAcids【目的与要求】1.了解核酸对生物体的重要意义2.了解核酸的分类，掌握两类核酸的化学组成特点及核苷酸的结构3.掌握DNA双螺旋结构模型，了解DNA双螺旋的一些特殊的构型4.了解RNA的种类及结构特点，重点掌握与蛋白质合成有关的三种RNA的功能5.掌握核酸紫外吸收的特性及热变性的性质，

DNA复性与分子杂交，掌握DNA的熔解温度、增色效应的概念6.了解酶对核酸的水解作用，限制性内切酶的作用特点及该酶的应用7.了解DNA一级结构的测定原理8.了解DNA在生物体内的存在方式及由DNA构成的染色体的结构1944O.Avery,Pneumococcus1952A.D.HersheyM.Chase32P35S4.1

ComponentsofNucleicAcidsNucleicAcid

Nucleotide

PhosphateNucleoside

PentoseBase一、Base

PyrimidineandPurine

1.PurineAdenine、Guanine2.PyrimidineCytosine、Uracil、Thymine

3.ModifiedBase100余种，多数是甲基化的产物，植物中有大量5-甲基胞嘧啶

E.coli噬菌体中，5-羟甲基胞嘧啶代替C二、核苷与脱氧核苷糖环上C1与嘧啶碱N1或与嘌呤碱N9连接核酸中的核苷均为β-型核苷三、核苷酸核苷中戊糖C3、C5羟基被磷酸酯化1.构成DNA、RNA核苷酸2.细胞内游离核苷酸及其衍生物①核苷5’-多磷酸化合物

ATP、GTP、CTP在能量代谢和物质代谢及调控中起重要作用②环核苷酸

3’、5’-cAMP;3’、5’-cGMP

激素的第二信使，cAMP调节糖代谢、脂代谢

cAMP③核苷5’多磷酸3’多磷酸化合物

ppGpp

、pppGpp、ppApp④核苷酸衍生物

HSCoA、NAD+、NADP+、FAD等的辅助因子在糖蛋白生物合成中，GDP-半乳糖、GDP-葡萄糖等是活性的糖基供体UDP-葡萄糖4.2

DNA

PrimaryStructure－SequenceSecondaryStructure－DoubleHelixTertiaryStructure－FoldingConformation一、PrimaryStructure

dAMP、dGMP、dCMP、dTMP通过3’,5’-磷酸二酯键连接起来的线形多聚体。

3’,5’-磷酸二酯键是DNA、RNA的主链结构

书写方法：5’→3’5’-pApCpTpG-3’或5’…ACTG…3’

真正代表DNA生物学意义的是碱基排列顺序DNA一级结构二、DNA的二级结构

1953年，Watson和Crick根据Chargaff规律和DNA钠盐纤维的X光衍射分析提出了DNA的双螺旋结构模型。Chargaff

规律（1950年）a.DNA中，A=T，G=C，（A+G=C+T）b.DNA碱基组成具有物种的特异性c.DNA碱基组成没有组织和器官的特异性d.年龄、营养状况、环境等因素不影响DNA的碱基组成1.Watson-Crick结构模型（B-DNA）P489★两条反平行的多核苷酸链绕同一中心轴缠成右手双股螺旋，一条5’→3’，另一条3’→5’★嘌呤与嘧啶碱基位于双螺旋的内侧，磷酸与脱氧核糖在双螺旋的外侧★磷酸与脱氧核糖通过3’5’-磷酸二酯键连接，构成DNA分子的骨架★大沟：宽、深

小沟：窄、深★双螺旋平均直径2.37nm

每圈螺旋含10.4个碱基

碱基堆积距离：0.34nm

螺距：3.32nm★两条核苷酸链依靠碱基间形成的氢链结合在一起

A=T,G=C

2.稳定双螺旋结构的因素①碱基堆积力，形成疏水环境②碱基配对的氢键，GC含量越多越稳定③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的正离子之间形成离子键，中和了磷酸基上的负电荷间的斥力，有助于DNA稳定④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中，可免受水溶性小分子的攻击三、DNA二级结构的多型性

A-DNA、B-DNA、Z-DNA1.B-DNA

典型的Watson-Crick双螺旋DNA

右手双股螺旋

2.A-DNA

右手双螺旋，外形粗短

RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构3.Z-DNA

左手双螺旋DNA

天然B-DNA的局部区域可以形成Z-DNA4.DNA三股螺旋（H-DNA）和四股螺旋

DNA三链结构常出现在DNA复制、重组、转录的起始位点或调节位点。第三股链的存在可能使一些调控蛋白或RNA聚合酶等难以与该区段结合，从而阻遏有关遗传信息的表达。

TAT、C+GC两种碱基配对方式

DNA三股螺旋

DNA三股螺旋四、DNA二级结构的不均一性

1.反向重复序列（回文序列）

DNA序列以某一中心区域为对称轴，其两侧的碱基对顺序正读和反读都相同。较长的回文结构，可形成发夹结构和十字结构，与转录的终止有关。较短的回文结构往往是限制性核酸内切酶的识别位点。

5-GGTACC-33-CCATGG-5反向重复序列反向重复序列2.富含AT的序列很多有重要调节功能的DNA区段都富含AT

特别是在复制起点和转录启动的Pribnow区富含AT五、环状DNA

某些病毒DNA

某些噬菌体DNA

某些细菌染色体DNA

细菌质粒DNA

真核细胞中的线粒体DNA、叶绿体DNA1.环状DNA的不同构象

松驰环

解链环和负超螺旋（1）松弛环形DNA

线形DNA直接环化（2）解链环形DNA

线形DNA拧松后再环化（3）正超螺旋与负超螺旋DNA正超螺旋：线形DNA双链（右手螺旋）一端固定，另一端向缠紧的方向旋转几圈，再将两端连接起来，会产生一个左旋的超螺旋（

DNA双链间），以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫正超螺旋。负超螺旋：线形DNA双链（右手螺旋）一端固定，另一端向松弛的方向旋转几圈，再将两端连接起来，会产生一个右旋的超螺旋（DNA双链间）以解除外加的旋转造成的胁变，这样的超螺旋叫负超螺旋。2.环形DNA的拓扑学特性以260bp组成的线形B-DNA为例，螺旋周数

260/10.4=25①连环数（L）

DNA双螺旋中，一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数，以L表示。松驰环：L=25

解链环：L=23

超螺旋：L=23②缠绕数（T）

DNA分子中Watson-Crick螺旋数目，用T表示松驰环T=25

解链环T=23

超螺旋T=25③超螺旋数（扭曲数W）松驰环W=0

解链环W=0

超螺旋W=-2

L=T+W④比连环差（λ）表示DNA的超螺旋程度，λ=（L-L0）/L0L0是指松驰环形DNA的L值天然DNA的λ一般为-0.03－-0.09，平均每

100bp上有3-9个负超螺旋负超螺旋DNA是由于两条链的缠绕不足引起，容易解链，有利于DNA的复制、重组和转录。3.拓扑异构酶改变DNA拓扑异构体的L值①拓扑异构酶I（拧紧）能使双链负超螺旋DNA转变成松驰形环状DNA，每一次作用可使L值增加1②拓扑异构酶II（拧松）能使正超螺旋转变成松驰DNA

每次催化使L减少2六、染色体结构1.大肠杆菌染色体大肠杆菌染色体是由4.2×106bp组成的双链环状DNA分子，约3000个基因。大肠杆菌DNA结合蛋白：每个细胞H两个28KD的相同亚基30000个二聚HU两个各9KD的不同亚基40000个二体聚HLP117KD的亚基20000个单体P3KD的亚基未知大肠杆菌染色体

大肠杆菌DNA（4.2×106bp）与结合蛋白压缩成手脚架结构，中心是多种DNA结合蛋白。DNA上有多个位点与这些蛋白结合，形成约100个小区。每个小区的DNA都是负超螺旋，两个端点被蛋白质固定，每个小区相对独立。用极微量的DNA酶I水解，只能使少数小区的DNA成为松驰状态，而其它小区仍然保持超螺旋状态。2．真核生物染色体（组蛋白和DNA组成）组蛋白富含碱性氨基酸，根据Lys/Arg比值不同，分为H1、H2A、H2B、H3、H4五种，均是单链蛋白质，分子量11000-21000。

H2A、H2B、H3、H4各两分子对称聚集成八聚体。

146bp长度的DNA双螺旋盘绕在八聚体上形成核小体。核小体间DNA长度15-100bp，其上结合H1。

2H2A、2H2B、2H3、2H4八聚体146bpDNA核小体串联染色质折叠

染色体

DNA（直径2nm）

盘绕组蛋白，结合H1，压缩比1/7

核小体螺旋化，压缩比1/6

螺线管再螺旋化，压缩比1/40

超螺线管折叠，压缩比1/5

染色单体总压缩比：1/8400~1/100004.3RNA的结构一、RNA的一级结构

AMP、GMP、CMP、UMP通过3’、5’磷酸二酯键形成的线形多聚体，组成RNA的戊糖是核糖。

RNA的U替代DNA中的T，RNA中常有一些稀有碱基。天然RNA分子是单链线形分子，部分区域有

A-型双螺旋结构。二、tRNA的结构

70－90b，分子量25kd左右，沉降系数4S左右。有较多稀有碱基。

3’端是CpCpA-OH，用来接受活化的氨基酸，称为接受末端。

5’末端大多为pG…或pC…

二级结构是三叶草形三、mRNA的结构

1.真核mRNA（1）3’端有20－250核苷酸的polyA

polyA与mRNA半寿期有关，新合成的mRNA

其polyA较长；衰老的mRNA其polyA较短。

polyA功能：是mRNA进入胞质的必需形式

提高mRNA在胞质中的稳定性（2）5’-帽子帽子结构：

3’-mG-5’ppp5’-Nm-3’-P5’末端的鸟嘌呤N7被甲基化，鸟嘌呤核苷酸经焦磷酸与相邻的一个核苷酸相连，形成

5’-5’-磷酸二酯键。功能：抵抗5’核酸外切酶降解mRNA

为核糖体提供识别位点，使mRNA很快与核糖体结合，促进蛋白质合成起始复合物的形成。

5’-帽子结构2.原核mRNA

由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成，没有5’帽子和3’polyA。

SD序列：5’端先导区中，有一段富含嘌呤的碱基序列，典型的为5’-AGGAGGU-3’，位于起始密码子AUG前约10核苷酸处（Shine和Dalgarno发现）。

SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补。四、rRNA的结构

rRNA与核糖体结合蛋白一起构成核糖体大肠杆菌中有三类rRNA（原核）：

5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA

真核细胞有四类rRNA：

5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA

23SrRNA能够催化肽键的合成

大肠杆菌5SrRNA结构

16SrRNA4.4核酸的性质一、物理性质1.性状

RNA及核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都是白色的粉末或结晶，DNA则是疏松的石棉样纤维状固体2.粘性核酸的水溶液粘度很大，DNA的粘度大于RNA的；核酸变性后，粘度下降。3.溶解性

RNA和DNA都是极性的化合物，微溶于水，不溶于乙醇、氯仿，它们的钠盐易溶于水。

DNA和RNA在细胞内都与蛋白质结合成核蛋白，DNA核蛋白和RNA核蛋白的溶解度受盐浓度的影响。

DNA核蛋白在1mol/LNaCl溶液中的溶解度比纯水中高2倍，在0.14mol/LNaCl溶液中溶的解度最低，几乎不溶解；而RNA蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/LNaCl溶解度较大。二、核酸的水解

1.酸碱水解室温条件下，0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解，得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。

在相同条件下，DNA不被水解。这是因为RNA中C’2-OH的存在，促进了磷酸酯键的水解。

DNA稳定，保留和传递遗传信息。

RNA是DNA的信使，完成翻译任务后降解。2.酶水解

RNA水解酶

RNaseDNA水解酶DNase

核酸外切酶核酸内切酶限制性核酸内切酶三、解离性质

核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。

DNA的pI约为4～5，RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时向正极移动。四、光吸收性碱基、核苷、核苷酸和核酸在240-290nm有较强的光吸收，λmax=260nm1.鉴定纯度

纯DNA，A260/A280＝1.8（1.65－1.85）

若大于1.8，表示污染了RNA或DNA降解

纯RNA，A260/A280＝2.0

若有杂蛋白或苯酚，则A260/A280明显降低2.含量计算

1.0ABS相当于：50ug/mL双螺旋DNA

或：40ug/mL单链DNA（或RNA）

或：20ug/mL核苷酸3.增色效应与减色效应增色效应：DNA变性时，摩尔吸光系数增大减色效应：DNA复性时，摩尔吸光系数减小五、沉降特性（DNA）不同构象的核酸（线形、环形、超螺旋），密度和沉降速度不同，用CsCl密度梯度离心可以将它们区分开来。这一方法常用于质粒DNA

的分离纯化。

相对沉降常数线型双螺旋分子1.00松驰双链闭环1.14切刻双链环1.14单链环1.14线型单链1.30正超或负超螺旋双链环状1.41坍缩3.0CsCl密度梯度离心六、变性与复性

1.变性核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链

变性发生在一个很窄的温度范围内

因素：热、酸碱（pH小于4或大于11）变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛）现象：吸光度升高，粘度降低，密度升高二级结构改变，部分失活（1）熔解温度（Tm）

DNA双螺旋结构解链50%时的温度浓度50ug/mL时，双链DNA的A260=1.00

完全变性A260=1.37

当A260增加到最大增加值一半时（1.185），对应的温度即为TmDNA的Tm一般在70－85℃之间（2）影响DNA的Tm值的因素

A.DNA均一性均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围内。

B.G-C含量与Tm值成正比测定Tm，可推知G-C含量

G-C%=（Tm-69.3）×2.44C.离子强度离子强度越高，Tm越高离子强度与Tm值2.复性变性的DNA在适当（一般低于Tm20－25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。缓慢冷却时可以复性，快速冷却时不能复性。

DNA片段越大，复性越慢；DNA浓度越大，复性越快。

复性速度可用Co·t衡量

Co是变性DNA的起始浓度mol·L-1t是时间（秒）DNA复性曲线★1个核苷酸对（AU），若浓度为Co=1.0mmol/L，

50%复性时，Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒全部复性，Cot=10-4，t=0.1秒★E.coli4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0umol/L，复性50%，Cot1/2=10mol.s/L，t=107秒，115天复性100%，Cot=500mol.s/L，t=5×108秒，约

5758天★复性机制：10-20bp成核，拉链

4.5

核酸研究技术一、核酸的分离纯化保持天然状态条件温和，防止过酸、过碱、剧烈搅拌抑制核酸酶1.DNA分离纯化真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP

溶于水或盐（1mol/LNaCl），不溶于0.14mol/L

的NaCl中。利用此性质，可将DNP与RNA核蛋白分开，提取出DNP。

DNA核蛋白可用水饱和酚抽提，去除蛋白质，还可用氯仿-异戊醇去除蛋白质2.RNA的分离纯化（mRNA的分离、纯化）用0.14mol/LNaCl使DNP沉淀，RNA核蛋白（RNP）在上清液中。

去蛋白：盐酸胍、苯酚等

必须防止RNA酶对RNA的破坏二、核酸的凝胶电泳

1.琼脂糖电泳①核酸分子大小迁移率与分子量的对数成反比②凝胶浓度③DNA的构象超螺旋最快，线形其次，环形最慢④电压5V/cm2.PAGE电泳DNA琼脂糖电泳-+

EB染色（溴化乙锭）三、限制性核酸内切酶

1.限制修饰作用

2.II型核酸内切酶限制、修饰活性分开，单体蛋白，辅助因子Mg2+，位点序列反向重复。

II型酶的切割频率识别位点：444=256646=4096848=65536限制酶的命名：E.coRI第一位属名，大写E第二、三位种名的头两个字母，小写co第四位菌株R第五位从该细菌中分离出来的这一类酶的编号

EcoRI酶切位点同裂酶：来源不同的限制性核酸内切酶（名称不同），识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端

例1：BamHIGG↓ATCC，BstIGG↓ATCC

例2：MboIGAT↓C，Sau3AGAT↓C同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，切割后都产生相同的粘性末端例:BclITG↓ATCA，BglIIAG↓ATCA

四、分子杂交1.SouthernBlottingSouthernBlotting用于DNA之间同源性分析

确定特异性DNA序列的大小和定位

可用DNA或RNA探针DNA样品→酶切→电泳→变性→转膜→固定→杂交→洗涤→放射自显影变性（NaOH0.5mol/L）转膜（NC膜）固定（80℃，4-6hs）杂交（高盐浓度，68℃，几小时）2.NorthernBlotting

研究对象是mRNA，探针一般是DNA

总RNA或mRNA在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛）五、DNA序列分析

1.化学裂解法用特异性的化学裂解法，制备出具有同一放射性标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，将此片段群在PAGE上分离。

硫酸二甲酯特异切割：G

甲酸特异切割：G和A

肼在NaCl条件下切割：C

肼在无

NaCl条件下切割：T和C

32P*ACTTCGACAA硫酸二甲酯（G）：*ACTTC