吸光光度法的应用教材课件

10.6吸光光度法的应用1.单组分的测定通常采用A-C

标准曲线法定量测定。2.多组分的同时测定

⑴若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。

⑵若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。Aλ1=εaλ1bca

＋εbλ1bcb

Aλ2=εaλ2bca

＋εbλ2bcb

一、普通分光光度法普通分光光度法一般只适于测定微量组分，当待测组分含量较高时，将产生较大的误差,需采用示差法。即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为cs(cs<cx)。则

Ax=εbcx

As=εbcs

ΔＡ＝Ａx－Ａs=εb(cx

－cs

）=εbΔc

测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与标准溶液的吸光度之差ΔＡ。

二、示差光度法示差法测得的吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得相应的Δc值，则待测溶液浓度cx

：

cx=cs+Δc

示差法方法比较常规法以空白溶剂为参比示差法以浓度为Cs

的标准溶液为参比A△C△CxA′（Cx>Cs）适宜

高

浓度的测定示差法的误差方法定量原理相对误差常规法示差法∴Tr>Tx∵I0>Is有结论：示差法提高了准确度例题例题已知dT=0.01,样品Tx=2.00%,标准Ts=10.0%示差法常规法误差示差法误差已知dT=0.01,样品Tx=2.00%,标准Ts=5.00%示差法提高准确度的实质常规法TxT051050100

落在测量误差较大的范围示差法T051050100TrTsTs

落在测量误差较小的范围结论：示差法通过提高测量的准确度提高了方法的准确度摩尔比法测络合比（饱和法）M+nR=MRnCM,固定；CR,从0开始增大CMRnCR在特定波长测定R=0,M=0,MRn

>0ACR/CMnR>0,M>0,MRn

=0ACR/CMn三、络合物的组成及稳定常数的测定固定cMM+R＝MR设MRn电离度为，则例

Mn与Q生成有色络合物，用饱和法测定其组成，如下方法配制一系列溶液，Mn的浓度固定为2.0×10－4mol/L

，改变Q浓度，在525nm处用1cm的比色皿测定得到如下数据

cQ

×10－4mol/L0.5000.7501.002.002.503.003.504.00A0.1120.1620.2160.3720.4490.4630.4700.470求：1.络合物的组成2.络合物在波长525处的摩尔吸光系数3.络合物的温度常数解：由题意：可计算出显色剂和Mn浓度的比值为0.2500.3750.501.001.251.502.00，作图得，由外推法得到一交点，其横坐标比值为1.0，故络合物的组成为1：1

由数据可得，当cQ＝3.5×10－4mol/L

，Mn已定量转化为MnQ，此时[MnQ]＝[Mn]＝2.0×10－4mol/L

B=1.00cm,求得由图可知，转折点不敏锐，由于络合物的离解所致，可通过求出溶液中[MnQ]，[Mn]，[Q]利用稳定常数的定义公式求出稳定常数。A=0.372，溶液中cMN=CQ＝3.5×10－4mol/L

已知b=1,因此络合物的稳定常数为等摩尔连续变化法（Job）测络合比M+nR=MRnCM+CR=常数CM/C从0→1在特定波长测定R=0,M=0,MRn

>000.51.0ACM/C0.33n=1,CM/C=0.5n=2,CM/C=0.3300.51.0ACM/CR>0,M>0,MRn

=0CM/C=0.5，n=1络合物组成的测定-连续变化法M:R=1:10.50.33cR/cfcR/cfM:R=1:20.00.20.40.60.81.01.00.80.60.40.20.0条件稳定常数的测定00.51.0ACM/CA′A′<A0由于络合物离解引起离解度MR=R+M总浓度c平衡浓度c(1-a)caca将代入上式便可求出络合物的条件稳定常数A0例

连续变化法测定FeSCN络合物的组成，二者的浓度均为2.00×10－3mol/L

下列方法配制一系列总体积为10mL的溶液,于480nm处用1cm比色皿测量得到下列数据VFe

0.001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.00VSCN10.009.008.007.006.005.004.003.002.001.000.00A0.000.1780.3580.4630.5270.5520.5190.4580.3540.1780.002用作图法求络合物的组成和稳定常数解：设cR+cM=c

cM=fc据题意：可计算出一系列的f值为0.00，0.100，0.200，0.300，0.400，0.500，0.600，0.700，0.800，0.900，1.00当f=0或1时，络合物的浓度为0。作图得

曲线最大点B’的A，＝0.552小于B点A＝0.866，这是由于络合物离解所致，设络合物的离解度为α，络合物的离解平衡如下：[FeSCN]2+Fe3++SCN-C(1-

α)CαCαA=0.552，c＝1.00×10－3mol/L代入计算得：K稳＝4.39×103四、弱酸弱碱离解常数的测定HR

=H++R-HR用光度法可以测定其离解常数RAHRRHRR用吸光值表征，相对于pH作图，可求得pKa或在上述实验的基础上作数据处理对特定pHb=1cmpH<pKa-1C=[HR]pH>pKa+1C=[R-]代入，得整理，得作图，直线截距为pKapHMO离解常数的测定(1)Aa(HL)Ab123456Ab654321AaAb(L)350400450500550600/nmA曲线pH11.10,1.3822.6533.0643.4853.9865.53,6.80MO吸收曲线MO离解常数的测定(2)AHL3.32(pKa)123456ApH=pKapH0.60.40.20-0.2-0.4-0.6pHAL3.04.03.32例

浓度为2.0×10－4mol/L的甲基橙溶液，在不同的PH条件下，于520nm处测定如下数据，计算甲基橙的Pka值pH0.881.172.993.413.954.895.50A0.8900.8900.6920.5520.3850.2600.260在1.17<PH<4.89,AHinIn的加和，

A＝AHIn

+AIn解：由题意：AHIn=0.890Ain=0.260代入pH=2.99pKa=3.33pH=3.41pKa=3.35pH=3.95pKa=3.34求平均值得：pKa=3.343.04.03.32

不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提高。

ΔＡ＝A

λ2

－A

λ1

＝（ελ2

－ελ1)bc

两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度成正比。ελ1和ελ2分别表示待测组分在λ1和λ2处的摩尔吸光系数。

五、双波长分光光度法双波长分光光度法消除干扰示意图在2，A2

=

Ax2+Ay2在1，A1=

Ax1+Ay1A=A2

-

A1

=

Ax2+Ay2

–(Ax1+Ay1)

=

Ax2–Ax1

=AxAy2

＝Ay1Ax=(x2－x1)bcx消除了Y干扰X被测Y干扰211´Ay1Ax1Ay2Ax2A/nm270nmX－苯酚Y－2,4,6－三氯苯酚双波长分光光度法消除浑浊背景的干扰A21yAx2Ax1Ay1Ay2在2，A2

=

Ax2+Ay2在1，A1=

Ax1+Ay1A=A2

-

A1

=

Ax2+Ay2

–(Ax1+Ay1)

=

(Ax2–Ax1)

+(Ay2

-Ay1)当Ax2–Ax1>>Ay2

-Ay1时A=Ax2–Ax1

与背景无关nmI散射光关键问题:关键问题是测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合。以两组分x和y的双波长法测定为例：设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的吸光度差分别为ΔＡx和ΔＡy，则该体系的总吸光度差ΔＡx+y为：

ΔＡx+y=ΔＡx+ΔＡy如何选择波长λ1

、λ2有一定的要求。选择波长组合λ1

、λ2要求

⑴选定的波长λ1和λ2处干扰组分应具有相同吸光度，等吸点即：ΔAy=ΔＡyλ2

－ΔＡyλ1=0

故：ΔＡx+y=ΔＡx=(εxλ2－εxλ1)bcx此时：测得的吸光度差ΔＡ只与待测组分x的浓度呈线性关系，而与干扰组分y无关。若x为干扰组分，则也可用同样的方法测定y组分。作图法

⑵在选定的两个波长λ1和λ2处待测组分的吸光度应具有足够大的差值。

ΔＡx足够大《光度滴定法》

赵彦华高等教育出版社1992年光度滴定法

根据被滴定溶液在滴定过程中吸光度、荧光强度或旋光度的变化以求出滴定终点的方法称为光度滴定法

光度滴定法的特点：1.可通过作图来确定计量点，反应体系的完全程度要求不需要太高。2.光度滴定的准确度较普通分光光度法高。3.与普通滴定法比较，能测定很稀溶液中吸光度的微小变化，可测定低含量组分并可用于在UN-IR区域内有吸光的物质的测定，也可测量底色较深的溶液。4.光度滴定的选择性较好，只要选择适当波长。光度滴定法光度滴定法常用于低浓度溶液和反应不完全的反应。例如：弱酸弱碱的中和反应和电位相差不大的氧化还原反应；具有中等溶解度的物质的沉淀反应。光度滴定法除可用于单组分的测定外，还可用于多组分的测定，例如用NaNO2标准溶液连续测定特种钢中的Mn（II)、Cr(VI)及V(V)。

在生物化学的研究中，诸如核酸结构的研究、酶溶液的厌氧氧化还原滴定以及蛋白质反应的热力学及动力学研究中均常采用。光度滴定法的应用例,滴定反应M+R=MR随着R的加入，[M][MR]滴定曲线随各物质的吸收性质的不同而不同。R=0,M=0,MR>0（不考虑滴定体积的变化）AVRVspR>0,M=0,MR>0AVRR>MRVspR<MRAVRVsp光度滴定与指示剂法的比较1、线性滴定法AV