生物化学与分子生物学实验技术-第二次(电泳+离心)课件

电泳技术electrophoresis定义：带有电荷的微粒在电场中的移动，这种现象称为电泳(electrophoresis)。许多生物分子如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸等在溶液中均带有一定的电荷，因此，电泳技术广泛应用于这些物质的分离与鉴定。F=Q.E根据Stoke氏定律

:f＝6πrην（v是电泳的速率、r为微粒的半径、η为介质的粘度系数)当F=f时，即达到动态平衡时：QE=6πrηνFfEQ一、基本原理E1.电泳速率2.电泳迁移率（mobility）迁移率(μ)指带电微粒在单位电场强度下的电泳速率。二、影响电泳的因素

·内在因素

·外界因素

被分离物质的带电荷量分子质量大小带电物质的颗粒形状影响电泳的内在因素带电荷量越多，

电泳速率越快；

反之，则越慢。带电荷量大小的影响带电物质的颗粒形状影响球状分子摩擦阻力小，电泳速率大；纤维状分子摩擦阻力大，电泳速率小。分子质量大小的影响分子质量越大的，电泳速率慢；分子质量越小的，电泳速率快。影响电泳的外界因素电泳介质的PH值缓冲液的离子强度电场强度电渗现象支持介质的筛孔电泳介质的PH电泳介质的PH值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少。pH值离pI越远，带电荷越多，速率越快；反之，则越慢。分离蛋白质混合物时，选择扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值。缓冲液：常见缓冲液如磷酸盐、醋酸盐、巴比妥盐、Tris-EDTA缓冲液等。缓冲液的离子强度：

离子强度（I）是指溶液中各种离子的摩尔浓度与其价数平方乘积总和的1/2。

I=1/2∑Ci×Zi²离子强度增加，带电颗粒吸引相反电荷的离子聚集其周围，形成与符号相反的离子氛，降低Q；且介质黏度增大，阻力增大，影响泳动。离子强度降低，样品扩散严重，分辨率明显降低，缓冲液缓冲能力减弱，溶液PH稳定性降低。综上所述，缓冲液离子强度一般在0.05~0.20mol/L为适。电场强度(electricfieldintensity)电场强度与电泳速率成正比增大电场强度会引起通过介质的电流增加，从而导致电泳过程中的热量增大，对电泳分离造成多种影响。冷却装置：高压电泳（500~1000V或是更高）电渗现象（electroosmosis）电渗:在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动。原因：支持物中含可电离的基团电渗与电泳往往同时存在，所以带电颗粒的移动距离也受电渗影响。支持介质的筛孔影响筛孔大：泳动速率快筛孔小：泳动速率慢三、电泳仪器设备电泳槽盘状电泳槽垂直板电泳槽水平电泳槽电源（电泳仪）四、电泳的分类

显微电泳自由界面电泳区带电泳区带电泳类型按支持物的物质形状分：纸、粉末、凝胶电泳等按支持物的装置形式分：平板、垂直、柱状电泳等按pH的连续性不同分：连续与不连续电泳按用途不同分：分析、制备、定量免疫电泳等按电压不同分：低压、高压、超高压电泳五、常见电泳（一）醋酸纤维薄膜电泳（celluloseacetatefilm）1、支持物：醋酸纤维薄膜2、特点：简单、区带整齐、电泳时间短、费用低3、应用：血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、同工酶的分离及免疫电泳（二）琼脂糖凝胶电泳1、支持物：琼脂糖，是从琼脂中提取的一种多糖，是一种天然聚合的长链状分子，沸水中溶解，45度开始形成多孔性刚性滤孔，孔径大小取决于琼脂糖浓度。2、特点：电渗较小、可根据需要调节凝胶孔径。3、应用：免疫复合物、核酸分离及纯化、同工酶分离等。1、聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化作用下形成的三维网状结构物质。丙烯酰胺（Acr）

交联剂（Bis）

（三）聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamidegelelec-trophoresis

，PAGE）①特点：机械强度好、热稳定、无电渗、凝胶孔径大小可调节、所需样品少、分辨率高等；未聚合的凝胶有毒性。②应用：广泛应用于蛋白质、核酸、多肽、酶的分离。2.不连续的聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理：

浓缩效应、电荷效应、分子筛效应浓缩胶分离胶低电导区被压缩的样品离心分离技术CentrifugeTechnique离心分离技术（CentrifugeTechnique）

指利用电动离心机产生的离心力，对混合溶液进行分离和沉淀的一种技术方法。从理论上讲，只要颗粒的比重大于液体就会发生沉降，但是对于颗粒非常细小的物质，依靠自然沉降是不能达到完全分离的，只能通过离心作用才能使它们沉降下来。一、离心沉淀的原理

在重力作用下，受到下沉的力为F，则：F=重力-浮力

=ρVg–σgV排=

Vg

（ρ-σ）

V表示颗粒体积，ρ表示颗粒的密度，σ表示液体的密度，g表示重力加速度颗粒受液体给予的向心力为：Vσrω2维持颗粒作圆周运动所需的向心力为：Vρrω2

向心力差值为：Vrω2(ρ-σ)

当ρ＞σ时，颗粒受到的向心力不足以维持它在圆周上的运动，因此它将沿离心管外移。Vrω2(ρ-σ)的值愈大，外移速度愈快。比较Vg

（ρ-σ）与Vrω2(ρ-σ)

可见rω2相当于g，故增加离心机转速，可使rω2值比g值大许多倍，从而加快颗粒的沉降速度，离心机就是根据这一原理设计制作的。

二、沉降系数（sedimentationcoefficient,S）

沉降系数是生物大分子的特征常数，是指单位离心力作用下颗粒的沉降速度。与颗粒密度、形状、大小，与介质密度、粘度，与温度、浓度都有关系。

20℃，以水为介质的条件下，测得S值为标准状态下的S值。1S=10-13秒三、相对离心力一般低速离心，转速以r/min(revolutionperminute,rpm)

表示；高速或超速离心，转速以相对离心力表示，真正反映颗粒在离心管中所受到的离心力。相对离心力（relativecentrifugalforce，

RCF，FR

）是指在离心力场的作用下，颗粒所受离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（9.8m/s2）。四、离心机的分类按转速（每分钟转数，revolutionperminute，rpm）不同可将离心机分为三类：①普通离心机：转速一般不超过10，000rpm，用于收集易沉淀的大颗粒；②高速离心机：转速一般不超过30,000rpm，用于分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等；③超速离心机：转速可达120,000rpm，分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等；测定样品纯度、沉降系数、相对分子量。

外摆式角式固定式离心机的转头五、普通离心机的使用方法检查外套管是否完整不漏装液离心管2/3体积为宜平衡

转头对称位置上离心管+外套管重量相等置管

对称放置（两两平衡原则）启动

设定离心时间及转速清洗