生物化学动物细胞工程制药课件

生物化学动物细胞工程制药(ppt)（优选）生物化学动物细胞工程制药3.1动物细胞的形态和生理特性3.2生产用动物细胞的要求和获得3.3动物细胞的培养条件和培养基3.4动物细胞培养的基本方法3.5动物细胞大规模培养的方法和操作方式3.6动物细胞生物反应器3.7动物细胞产品制造实例3.8动物细胞制药的前景与展望3.1动物细胞的形态和生理特性一、动物细胞的形态

离体培养的动物细胞主要为哺乳动物细胞。根据是否需要帖附于支持物上生长的性质，可将动物细胞分为贴壁依赖型和悬浮型两类。1、贴壁依赖型绝大多数细胞在培养时必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。按培养细胞的贴壁的形态主要分为4类。（1）成纤维细胞型形状与体内成纤维细胞形状相似而得名，细胞大致呈梭形或不规则三角形。（2）上皮细胞型形状为扁平的不规则多角型。（3）游走细胞型在支持物上分散生长，不连接成片，呈活跃的游走和变形运动。（4）多形性细胞形态不规则。

2、悬浮型

少数细胞在培养时呈悬浮生长，来源于血液、淋巴组织的细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞为悬浮型。形态常为球形，可悬浮培养。3、兼性贴壁细胞不严格的依赖支持物某些情况下可在培养基中良好悬浮生长。二、动物细胞的生理特征动物细胞培养的一些基本概念：

动物细胞体外培养可分为原代培养和传代培养（继代培养）。原代培养是指从机体取出组织或细胞进行初次培养的过程。传代培养是指从原代培养的细胞继续转接培养。原代培养细胞一经传代后便称为细胞系。通过选择或克隆形成法从原代培养细胞或细胞系中获得的具有特异性质或标记的细胞，称为细胞株。不能继续传代或传代次数有限的细胞系或细胞株称为有限细胞系或细胞株。可连续传代的细胞系或细胞株称为连续细胞系或细胞株。有限细胞系（株）可通过自发、病毒感染、癌基因转移、与其他连续细胞融合等方法转化得到连续细胞系（株）。动物细胞的生理特征:1.细胞分裂周期长（12~48h）

2.细胞生长需贴附基质，存在接触抑制3.正常二倍体细胞生长寿命有限二、动物细胞的生理特征4.对周围环境十分敏感5.对培养基要求高

氨基酸、维生素、无机盐、细胞生长因子、贴壁因子、血清等。6.对蛋白合成途径和修饰与细菌不同（糖基化）目前，动物细胞和细菌生产的产品，产值约各占一半。3.2生产用动物细胞的要求和获得一、生产用动物细胞的要求原代细胞－－－二倍体细胞－－－连续细胞腺病毒疫苗和脊髓灰质炎疫苗事故（错用癌细胞）皮下注射癌细胞实验最终产品残留DNA严格限制。

1986年，从淋巴瘤患者分离转化细胞Namalwa细胞，生产干扰素用于临床。猴肾转化细胞Vero生产狂犬疫苗和脊髓灰质炎疫苗被批准大量用于人群。1987年，杂交瘤细胞生产OKT3单抗用于临床排异反应。1988年后，大批异倍体传代细胞生产的重组蛋白被批准上市。

最终产品残留DNA严格限制。

二、生产用动物细胞的获得1 .原代细胞直接取自动物组织、器官，经粉碎、消化得到的细胞悬液。

需要大量动物。鸡胚细胞、原代兔肾或鼠肾细胞、血液淋巴细胞。2.二倍体细胞系通过筛选、克隆从原代培养细胞中获得的具有某种特征的有限细胞株有限增殖、2n、贴壁、接触抑制

MRC-5、WI-38

MRC-5：1966年，14周正常男性胎肺组织中获得2n=46

寿命42~46代用于人用疫苗的生产3、转化细胞系

通过某个转化过程形成，常由于染色体断裂成为异倍体。自发形成，啮齿动物细胞多发；病毒感染后转化；直接从动物肿瘤组织中建立的细胞系。转化细胞具有无限生命力，一般倍增时间短、对培养条件和生长因子要求较低。

CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、COS、BHK-21、Namalwa、Vero细胞等。

COS细胞（非洲绿猴肾细胞）：1981年，Gluzman用复制起点缺失的SV40(猿猴空泡病毒40)转化非洲绿猴肾细胞CV-1，获得3个细胞系：COS-1、COS-3、COS-7。COS细胞组成性表达SV40大T抗原，带有SV40ori复制子的质粒以附加体的形式高拷贝扩增（105拷贝）大量扩增质粒及高表达mRNA、蛋白质，易回收和分析易培养、易转染。CHO-K1细胞：1957年，Puck等从中国仓鼠卵巢分离，上皮样细胞。

CHO-dhfr-

为二氢叶酸还原酶突变型(培养时需加入次黄嘌呤、胸苷)，用于工程细胞构建。

4、融合细胞系

细胞融合：两个或两个细胞合并成一个细胞的过程。主要为杂交瘤细胞。

细胞自发融合的频率很低，需要采用人工的方式进行细胞融合，方法有3种：生物方法（病毒）、化学方法（PEG）、物理方法（电融合）目前，常用的为PEG和电融合。（1）病毒诱导融合可促进细胞融合的病毒有：疱症病毒、天花病毒、副流感病毒、副黏液病毒等。仙台病毒为副黏液病毒的一种，对人危害小而且有效，使用最广。起融合作用的为病毒被膜上的糖蛋白。细胞融合时加入灭活的仙台病毒，两个细胞在病毒的黏结作用下靠近，通过病毒与细胞膜的作用使两个细胞膜相互融合。细胞融合率较低，而且还需病毒，现已很少使用。（2）PEG融合

诱导融合的机理还不明确。

PEG（聚乙二醇）为乙二醇的线性多聚体，结构式为H(OCH2CH2)nOH，分子量1000以上为固体，1000以下为液体。用于细胞融合的PEG分子量一般为1000~6000，浓度为30~50%。融合效率最高可达10%。3、电融合

细胞在强电场脉冲的作用下，细胞膜上会短暂出现小孔，如果两个细胞贴近，电脉冲时紧贴的质膜会瞬时破裂而导致膜的融合，从而形成杂合细胞。优点：融合率很高、对细胞毒性低、适合各种细胞、可用于细胞数量很少的融合过程。

细胞融合需要经细胞膜融合、细胞质渗透、细胞核融合等主要步骤。

预处理融合方法主要应用动物细胞不需仙台病毒、PEG、电融合生产单克隆抗体植物细胞脱壁PEG、电融合创造植物新品种微生物细胞脱壁PEG高产优良新菌种5、重组工程细胞系构建含目的基因的真核细胞表达载体（病毒载体、质粒载体）导入动物细胞通过选择标记筛选工程细胞瞬时表达稳定表达生产上为了获得高效稳定表达的工程细胞株。

三、细胞库的建立除原代细胞，其他细胞系或株需要建库保存。原始细胞库（mastercellbank，MCB）

二倍体细胞：群体倍增水平尽可能低的细胞（传代次数尽可能少的细胞）记录详细档案工作细胞库（workingcellbank，WCB）

生产用细胞库（manufacturer’sworkingcellbank，MWCB）

生产3.3动物细胞的培养条件和培养基一、动物细胞的培养条件1、器材的清洗新的玻璃：泡酸（5%盐酸12h）、刷洗、清洁液泡12h（重铬酸钾-硫酸洗液）、冲洗2、水质新鲜的超纯水、双蒸水或三蒸水无热原

3、pH值最适pH为7.2～7.4，低于6.8或高于7.6对细胞生长不利酚红

细胞代谢产乳酸Na2HPO4/NaH2PO4、NaHCO3/CO2

HEPES(pKa7.6)10~50mMMOPS、DIPSO等。

4、渗透压理想的渗透压可保持在290～300mOsm(milli

-

osmol

)/kg，可通过增减NaCl的量调节。

1mg/mlNaCl32mOsm/kg1mol葡萄糖/kg水冰点-1.858

℃1000

mOsm/kg冰点-0.186

℃100

mOsm/kg

平衡盐溶液（balancedsaltsolution，BSS）维持渗透压、pH

5、温度

哺乳动物细胞的最佳培养温度为37±0.5℃，可在25～35℃生存和生长，40℃以上只能存活几十分钟到几个小时。6、氧气和二氧化碳二氧化碳主要调节培养基的pH值，二氧化碳的比例可为3~5%；氧气影响细胞生长，溶氧过高对细胞产生毒害，过低抑制细胞生长。可采用不同比例的氧气、氮气、二氧化碳和空气加以调节。

7、抗生素

防止微生物污染可在培养基中加入一定量的抗生素。生产中不准使用青霉素和β-内酰胺类抗生素。

8、器材的消毒灭菌

物理方法：湿热、干热、紫外线、伽马射线、过滤。化学方法：化学消毒剂，主要用于空气、表面灭菌消毒、污染物品处理。

二、动物细胞培养基

不同的动物细胞对培养基的要求差异很大，一般无规律可循，常需要花费很大的时间和精力确定适合的特定细胞需要的培养基。动物细胞培养基按组成大致可分为三类：天然培养基包括血清、淋巴液、胚胎浸取液等。成分复杂、组分不稳定、来源有限。补充血清的合成培养基在一些合成培养基中添加5～20%血清而成。最常用的血清为小牛血清、胎牛血清，还有马血清等。

合成培养基成分明确、组分稳定，目前商品化的有几十种（如MEM、DMEM、RPMI1640、199等），主要由成分包括：氨基酸必需氨基酸、半胱氨酸、酪氨酸及其他种类氨基酸；维生素能源物质（葡萄糖、谷氨酰胺）无机盐缓冲体系其他成分如核酸前体物质（腺苷、鸟苷等）、脂类物质等血清的作用：提供细胞生长所需的各种生长因子和激素提供细胞生长所需的贴附因子和伸展因子提供可识别金属离子、激素、维生素、脂质的结合蛋白提供细胞生长所必须的脂肪酸和微量元素。含血清培养基的缺点：血清的来源和批次不同导致培养差异血清的保存期有限血清很容易污染杂菌血清可能含病毒和支原体血清本身所含蛋白增加了产品的分离纯化难度血清供应问题成本高无血清的培养基在合成培养基中添加一些特殊成分而成：激素和生长因子(胰岛素和表皮生长因子等)结合蛋白（铁传递蛋白、白蛋白）帖附和伸展因子（纤维结合蛋白胶原、一些多肽）其他有利于细胞生长的因子和元素（谷胱甘肽、硒等）无血清培养基的优点：提高了细胞培养的重现性、减少了血清带来的污染问题、供应充足、产品易于纯化。3.4动物细胞培养的基本方法一、动物细胞的生长过程大多数动物细胞为贴壁细胞，培养细胞的生长过程通常包括5个时期：1、游离期又称悬浮期，细胞接种后在培养液为悬浮状态，细胞为球形。10min～4h。2、贴壁期细胞附着在固体表面，在培养开始后10min～4h贴壁。细胞贴壁需要特殊的表面或其他物质，如胶原、玻璃、塑料等。血清中含有促进细胞贴壁的球蛋白、胶原、纤黏素等糖蛋白（促贴壁因子），这些蛋白带正电荷，先吸附于固体表面，细胞再吸附在这些促贴壁因子表面。

3、潜伏期细胞有生长活动，但无细胞分裂。6h～24h。4、对数生长期细胞活力最高，生长速度最快。5、停止期（平台期）固体表面长满细胞，细胞虽有活力但不再分裂。二、动物细胞培养的基本方法

1、细胞分离（1）离心分离从含有细胞体液中分离低速离心（800~1000rmp,5～10min）（2）消化分离组织块－－剪碎－－消化液消化－－细胞悬液－－洗涤－－细胞消化液：胰蛋白酶、EDTA、胰酶-柠檬酸盐、胰酶-EDTA、胶原酶等。

2、细胞计数（1）自动细胞计数器计数无法区分死活细胞无法区分单个细胞和细胞团

（2）血球计数板计数采用台盼蓝或苯胺黑染色后计数可区分死活细胞。（3）结晶紫染色细胞核计数法结晶紫染色液（结晶紫+柠檬酸）能使细胞分离破碎，细胞核染成蓝色，在血球计数板计数细胞核即得细胞数。（4）MTT(四甲基偶唑盐)染色计数MTT（淡黄）被活细胞线粒体脱氢酶转变为不溶的甲月替（formazan，紫色），溶于脱色液，比色从标准曲线得细胞数。

3、细胞传代（1）悬浮细胞稀释传代

（2）贴壁细胞消化液（胰酶）消化－－－倒去消化液－－－加入含血清的培养基－－－传代

4、细胞的冻存和复苏（1）冻存液氮（-196℃

）保存冻存时细胞状态良好密度1×106~2×106/ml

加10%DMSO(二甲基亚砜)或甘油降温速度1℃/min

（2）复苏快融从液氮罐中取出立即放入37~40℃水浴中。离心换液或解冻后直接加培养基培养，4～6h贴壁后立即换液。3.5动物细胞大规模培养的方法和操作方式一、动物细胞大规模的培养方法分为悬浮培养、贴壁培养、假悬浮培养（微载体培养、微囊化培养）等。

1、悬浮培养适用于非贴壁依赖性细胞，如杂交瘤细胞。适应于兼性贴壁细胞。

Wellcome公司8000L搅拌罐生物反应器培养Namalwa细胞产干扰素。

Celltech公司2000L气升式生物反应器培养杂交瘤细胞产单抗。2、贴壁培养细胞贴附在固体表面生长以单层膜的形式生长，适用于贴壁依赖性细胞与兼性贴壁细胞。

动物细胞一般带负电、带正电荷的固体表面较理想有利于粘附细胞。贴壁培养的材料可采用玻璃和一次性塑料（通常为聚苯乙烯）等。聚苯乙烯表面疏水，与细胞的相容性不好，经过γ

射线、化学法和放电表面改性增强其表面电荷和浸润性能，成为细胞培养的理想材料。

转瓶培养1~5L的旋转瓶简单、比表面积小、劳动强度大。以贴壁培养为基础，结合其他操作方式可采用采用其他培养方式如微载体培养，中空纤维膜反应器培养。3、微载体培养

微载体为直径为100~250um，适用于贴壁细胞生长的球状颗粒。微载体培养指将细胞贴附在微载体上进行悬浮培养。优点：培养体系的比表面积大，可随载体浓度的改变而改变，细胞培养密度较高培养体系均匀，培养重复性好培养基的利用率高取样后很容易通过显微镜观察载体表面的细胞生长状况收获细胞和细胞产物简单放大容易对人工和空间的需求低

优良的微载体一般要具有以下特性：载体表面与细胞相容性良好，带较低的正电荷，适于细胞的附着和生长微载体的相对密度略大于培养基，在1.03~1.05之间，轻度搅拌就能时载体悬浮起来，停止搅拌很很快沉淀颗粒粒度分布均匀，表面光滑利于细胞铺展载体透明，容易用显微镜直接对细胞观察材料无毒性载体材料为非刚性材料，避免培养过程中相互碰撞损伤细胞可以高温灭菌惰性，不吸收或少吸收培养基组分能重复使用，价廉

微载体的材料有聚苯乙烯、葡聚糖、纤维素、胶原等。

多孔微载体：极大增大了比表面积

加钛载体（高比重，适用于流化床反应器）普通载体

4、微囊化培养指将动物细胞包裹在亲水的球状半透性薄膜形成的微囊内。营养成分能透过，但细胞不能出来。适用于贴壁依赖性细胞和非贴壁依赖性细胞。优点：减少了搅拌、通气对细胞的影响细胞在微小的环境中生长良好，能达到很高的细胞密度制备动物细胞微囊的材料通常为海藻酸盐和多聚赖氨酸（分子量一般在40,000~80,000）。

海藻酸盐是由D-甘露糖醛酸和L-古罗糖醛酸通过1,4糖苷键连接而成。动物细胞微囊化：海藻酸聚阴离子和聚赖氨酸聚阳离子形成聚电解质的膜。

5.包埋培养采用各种凝胶进行包埋后培养，主要的凝胶载体为海藻酸凝胶、琼脂糖等。动物细胞包埋后细胞活性不高，很少采用。6.结团培养某些结团生长的细胞细胞本身作为贴附基质,可加入直径较小的颗粒（20um）促进结团

二、动物细胞培养的操作方式

分为分批培养、流加培养、半连续培养、连续培养、灌流培养。

1、分批培养2、流加培养培养过程中反应体积不断增加。流加培养可以补充细胞消耗的营养物质，使细胞在较长时间内处于较好的环境中生长，有利于产物的形成和细胞浓度提高。可避免高浓度基质对细胞生长的抑制作用。3、半连续培养

培养开始时为分批培养，培养至一定程度，取出部分培养液，同时反应器中补加相同的体积的培养基，再按分批操作的方式进行培养。又称为反复分批培养或换液培养。优点：操作简单、可反复收获产品4、连续培养培养开始时为分批培养，培养至一定程度后，连续不断的补加新鲜培养基同时排出等量培养液。细胞生长的比生长速率和稀释率相同时达到稳态，细胞浓度和培养基中各种物质浓度均保持不变。优点：细胞的生长环境良好稳定、可连续不断获得产品和细胞。5、灌流培养在细胞培养至一定程度后，将新鲜培养基不断加入反应器，同时将不含细胞的培养液不断取出，细胞保留在反应器内。灌注培养可保持细胞良好的培养条件，不断排出有害代谢产物，培养细胞能达到很高的浓度，连续收获产品。3.6动物细胞生物反应器动物细胞培养规模较小，100L以上即为生产规模。1、转瓶仍然用于一些病毒疫苗的生产和细胞种子培养。2、通气搅拌式反应器动物细胞不耐剪切力，而且培养基容易产生泡沫。用于动物细胞的搅拌式反应器的通气装置和搅拌桨具有特殊的结构，可用于动物细胞培养。聚丙烯中空纤维膜或薄硅胶管园底、高径比1～1.5:13、气升式反应器

气体通过反应器底部的喷射管进入反应器的导流筒，使得到流筒中的液体总体密度低于外部区域，从而一直上升，导致液体在反应器中循环。高径比大10:1。

气泡直径1~2mm

空气流速0.01~0.06vvm

剪切力小，混合均一氧和营养的传递好有利于设备的密封

4、中空纤维膜反应器由很多中空纤维膜（一般为超滤膜）组成的反应器。结构上分为管外空间和管内空间，细胞在管外空间生长，贴壁细胞可贴在膜外表面生长，悬浮细胞可管外空间悬浮生长，培养基从中空纤维管内通过，养分和溶氧通过膜的扩散到管外，代谢废物扩散至管内被带走。用途较广。细胞培养密度高108/ml

细胞分裂停止

代谢和分化功能可保持数月5、平板膜反应器

悬浮细胞和贴壁细胞

6、流化床和固定床反应器

3.7动物细胞产品制造实例一、类淋巴细胞干扰素(Na-IFN-α，interferonIFN)

由Namalva细胞（淋巴瘤患者中分离获得）生产

搅拌罐生物反应器悬浮培养（8000L）80%IFN-α(多种亚型)＋20%IFN-β细胞逐级扩大培养（8000L）10%小牛血清RPMI16401×106/ml丁酸钠或IFN启动仙台病毒诱生单抗或多抗亲和层析TCA沉淀超滤浓缩收获离心Na-IFN-α48h18hSephadexG75二、组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）

人t-PA基因位于第8号染色体p12~q11.2区14个外显子和13个内含子全长36,594bp

t-PA为单链527aaMW67,000~72,000

等电点7.8~8.6,pH5.8~8.0稳定17对二硫键三个糖基化位点

275Arg-276Ile

能被纤溶酶、组织激肽释放酶作用裂解成双链。作用机理：游离t-PA对纤溶酶原亲和力很低，不产生激活作用。

t-PA对血栓中纤维蛋白有很