β-内酰胺类抗生素高分子杂质测定法课件

β-内酰胺类抗生素高分子杂质测定法7/27/20231β-内酰胺类抗生素高分子杂质测定法7/26/20231第一节β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质一、定义β-内酰胺类抗生素（β-lactamantibiotics）系指化学结构中具有β-内酰胺环的一大类抗生素，包括临床最常用的青霉素（penicillins）与头孢菌素（cephalosporin），以及近年开发的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。

系对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。其分子量一般在1000～5000，个别可至约10000道尔顿，小于化工、生化领域中所指的高分子化合物的分子量。

7/27/20232第一节β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质一、定β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质二、分类及来源按其来源分为两类：外源性杂质和内源性杂质。外源性杂质：包括蛋白、多肽、多糖等类杂质或抗生素和蛋白、多肽、多糖等的结合物。一般来源于发酵工艺，如青霉素中的青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽等。7/27/20233β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质二、分类及来源7/26/20内源性杂质：抗菌药物自身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又可在储存中形成，甚至在用药时使用不当也可产生。抗生素聚合物的免疫原性通常较弱，但作为多价半抗原，可引发速发型过敏反应。

免疫原性(immunogenicity)：抗原刺激机体产生免疫应答，诱生抗体或致敏淋巴细胞的能力。抗原性(antigenicity)：抗原与其诱生的抗体或致敏淋巴细胞有特异性结合的能力。也写作反应原性。

完全抗原：同时具备2个性质。天然的蛋白质都是完全抗原。半抗原(hapten)：只有抗原性而没有免疫原性的物质，即只能与抗体结合，却不能单独诱导抗体产生的物质，称为半抗原。一般分子量较小，如化学药物。半抗原+载体(carrier)→完全抗原

。

速发型过敏反应是一种常见的过敏反应，主要为呼吸道过敏反应、消化道过敏反应、皮肤过敏反应以及过敏性休克。随着现代生产工艺的不断改进和提高，目前产品中外源性杂质日趋减少，对内源性聚合物的控制是当前抗生素药物高分子杂质控制的重点。7/27/20234内源性杂质：抗菌药物自身聚合产物。聚合物即可来自生产过程，又图1水温引起阿莫西林干糖浆中高分子杂质含量的变化7/27/20235图1水温引起阿莫西林干糖浆中高分子杂质含量的变化7/2β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质三、形成机理及结构特征（一）青霉类抗生素：高分子杂质有蛋白（多肽）类杂质和聚合物杂质两大类。7/27/20236β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质三、形成机理及结构特征7/2青霉噻唑多肽：制剂中的青霉噻唑多肽的分子量主要分布在3500～2400道尔顿左右，有青霉素的β-内酰胺环和多肽的伯氨基按亲核反应机理缩合而成，主要发生在发酵工艺中。样品在储存过程中，多肽类杂质残留的自由氨基仍与β-内酰胺反应，直至被饱和，反应速度和样品本身的水分含量及储存温度有关。7/27/20237青霉噻唑多肽：7/26/20237青霉噻唑蛋白的基本结构青霉素G内酰胺环断裂点7/27/20238青霉噻唑蛋白的基本结构青霉素G内酰胺环断裂点7/26/202青霉素聚合物：1.反应仅和母核结构有关，侧链中的活性基团不参与反应。一分子青霉素首先开环，形成一新的活性位点，并与另一分子青霉素聚合。2.侧链参与的聚合反应主要以氨苄青霉素为代表，反应时侧链上的氨基亲核攻击β-内酰胺抗生素的羰基碳原子，形成聚合物。7/27/20239青霉素聚合物：7/26/20239头孢菌素：头孢菌素中的高分子杂质主要是不同类型的聚合物。1.只与母核结构有关的N型聚合反应eg.头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等2.侧链参与的L型聚合反应。eg.头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等在碱性条件下，两种反应都可以发生。7/27/202310头孢菌素：头孢菌素中的高分子杂质主要是不同类型的聚合物。7/β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质四、结构特点高度的不均一性和不确定性。1.青霉噻唑多肽（蛋白）类杂质发酵中产生的任何蛋白及蛋白碎片都可能带入到产品中；相同的蛋白或蛋白碎片上可以结合不同数目的药物分子。7/27/202311β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质四、结构特点7/26/2022.聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不仅能形成聚合度不同的聚合物，许多样品还能同时发生不同机理的聚合反应。3.形成的聚合物可发生不同程度的分（降）解反应，如开环等。4.对以异构体形式存在的样品，同聚和异聚反应可同时发生。5.实践中发现高分子杂质的种类及数量和生产工艺密切相关，如氨苄西林钠，溶媒法和喷雾干燥法的高分子杂质具有不同的特异性，且二者的聚合物含量明显不同。冻干粉二聚物溶媒粉二聚物7/27/2023122.聚合物类杂质：青霉素、头孢菌素不仅能形成聚合度不同的聚合β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质五、影响聚合物形成的因素1.青霉素的聚合物青霉素的聚合反应速度在溶液条件下和溶液的酸碱度关系密切；在固体条件下主要和样品的水分含量有关。

7/27/202313β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质五、影响聚合物形成的因素7/2.头孢菌素的聚合物固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度的关系密切。贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至37℃时，含水量差异对聚合物含量的影响十分显著。7/27/2023142.头孢菌素的聚合物7/26/202314β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质六、口服青霉素类药物使用前进行皮试的必要性口服青霉素类抗生素在国内外均有过敏反应报道，但其原因未有试验报道。有相关报道，在青霉素V聚合物可经胃肠道吸收而引发过敏反应。因此，在口服青霉素类抗生素前，必须进行皮肤过敏试验，这是十分必要的。7/27/202315β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质六、口服青霉素类药物使用前进β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质七、抗生素高分子杂质的质控意义1.β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质是引发临床速发型过敏反应的过敏原；2.高分子杂质经注射和口服都可引起过敏反应，因此注射剂和口服剂都应控制。3.高分子杂质是β-内酰胺类抗生素质量评价的重要指标，可评价药品质量和稳定性，并可借此进一步评价其生产工艺。7/27/202316β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质七、抗生素高分子杂质的质控意第二节高分子杂质分析方法高分子杂质质控方法化学分析免疫学分析色谱法分光法（P值法）间接血凝法豚鼠PCA法反相模式离子交换模式凝胶色谱模式一、概述7/27/202317第二节高分子杂质分析方法高分子杂质质控方法化学分析免由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生物学特性，如：均为过敏性杂质，因此，在药物质量控制中一般不需分别控制不同结构的高分子杂质含量，而只需控制药品中高分子杂质的总量。故根据分子量差异进行分离的凝胶色谱模式是简便易行的分离模式。以葡聚糖凝胶SephadexG-10为基础的凝胶色谱分析方法，可简便地用于对各种β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质的分离、分析，并满足药品质量控制的需要。7/27/202318由于结构不同的高分子杂质通常有相似的生物学特性，如：均为过敏高分子杂质分析方法二、凝胶色谱系统的分离原理及特点

7/27/202319高分子杂质分析方法二、凝胶色谱系统的分离原理及特点7/26/凝胶色谱系统的分离原理及特点1.凝胶色谱法凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱法主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。凝胶色谱法又叫凝胶色谱技术，是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离分析技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果。它是利用某些凝胶对混合物各组分因分子量不同，其阻滞作用也不同而进行分离、分析的方法。

7/27/202320凝胶色谱系统的分离原理及特点1.凝胶色谱法7/26/2023凝胶色谱系统的分离原理及特点2.凝胶色谱系统的分离原理（1）利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分子杂质具有相同的保留时间的设想。7/27/202321凝胶色谱系统的分离原理及特点2.凝胶色谱系统的分离原理凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图7/27/202322凝胶渗透色谱按分子大小分离原理图7/26/202322凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

7/27/202323凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且实验证明，SephadexG-10凝胶可基本保证所有的β-内酰胺抗生素中的高分子杂质被排阻。Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)Kav:分配系数；Ve：被分离物质洗脱体积；Vo：柱内凝胶床中颗粒间自由空间所占有的体积（外水体积）；Vt：柱内凝胶颗粒占有的体积与外水体积之和（柱床体积）

一般Kav≈0洗脱的组分视作高分子杂质。7/27/202324实验证明，SephadexG-10凝胶可基本保证所有的外水体积（Vo）

：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即液体流动相体积；内水体积（Vi）

：凝胶颗粒中孔穴的体积，即固定相体积；基质体积（Vg）

：凝胶颗粒实际骨架体积。Vt=Vo+Vi+Vg柱床体积（Vt）：凝胶柱所能容纳的总体积7/27/202325外水体积（Vo）：凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，即液体流洗脱体积（Ve）：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。一般是介于Vo和Vt之间的。（1）对于完全排阻的大分子，由于其不进入凝胶颗粒内部，而只存在于流动相中，故Ve=

Vo；（2）对于完全渗透的小分子，由于可以存在于凝胶柱整个体积内，故Ve=

Vt；分子量介于两者之间的分子，其洗脱体积也介于两者之间，但，有时也出现Ve＞

Vt，这是由于这种分子与凝胶的吸附作用造成的。7/27/202326洗脱体积（Ve）：将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积凝胶层析洗脱示意图（1）完全排阻的大分子（2）中等分子（3）完全渗透的小分子（4）吸附分子7/27/202327凝胶层析洗脱示意图（1）完全排阻的大分子（2）中等通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，不宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。7/27/202328通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。该物质分子Vo的测定7/27/202329Vo的测定7/26/202329Vt的测定7/27/202330Vt的测定7/26/202330（2）由于溶质分子和凝胶介质间存在多种次级相互作用，溶质分子可被吸附于凝胶介质的表面。（3）在凝胶颗粒内部具有较大的比表面积和较小的自由空间，故溶质分子更易和凝胶介质接触，因此溶质分子在凝胶颗粒内部较凝胶颗粒外部更易被吸附。（4）即，色谱过程中除分子排阻作用外，凝胶对药物分子的吸附作用大于对高分子杂质的吸附作用。7/27/202331（2）由于溶质分子和凝胶介质间存在多种次级相互作用，溶质分子有目的的利用药物分子和凝胶间的次级相互作用，使药物分子吸附于凝胶颗粒内表面，进而改善高分子杂质和药物分子之间的分离度。（5）在深入研究药物和葡聚糖凝胶的相互作用及流动相对该相互作用的影响的基础，通过调节色谱过程中的流动相组成、浓度、pH和流速等参数，调节药物分子和凝胶颗粒间的相互作用，进而调节高分子杂质和药物分子间的分离度。7/27/202332有目的的利用药物分子和凝胶间的次级相互作用，使药物分子凝胶色谱系统的分离原理及特点3.

SephadexG-10凝胶色谱法分离β-内酰胺抗生素中高分子杂质的概况：在SephadexG-10凝胶色谱系统中，理论上β-内酰胺抗生素三聚体以上的高分子杂质均集中在Kav=0的色谱峰中；调节各种色谱条件，既可使β-内酰胺抗生素的寡聚物（如青霉素类抗生素的二聚物等）和其它高分子杂质分离，又可使其二者合二为一，因此可用于不同的分析目的。7/27/202333凝胶色谱系统的分离原理及特点3.SephadexG-10高分子杂质分析方法三、色谱条件对β-内酰胺类抗生素在SephadexG-10凝胶色谱系统中色谱行为的影响7/27/202334高分子杂质分析方法三、色谱条件对β-内酰胺类抗生素在Seph色谱条件的影响1.流动相离子强度对溶质保留行为的影响：流动相的离子强度和色谱行为虽然并无直接联系，但一般说来，当流动相中的离子种类不改变时，离子强度越大，β-内酰胺类抗生素的Kav值越大。

7/27/202335色谱条件的影响1.流动相离子强度对溶质保留行为的影响：7/2在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰形和分离效果。有研究表明，在流动相中添加中性盐如氯化钠或增加缓冲液的浓度后，均使离子强度增加，使β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质得到有效分离。7/27/202336在被测物浓度较高时，流动相中应含有足量的缓冲盐以改善色谱峰色谱条件的影响2.流动相种类对溶质色谱行为的影响：常用流动相有：柠檬酸缓冲液、硫酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液等。改变流动相中缓冲液的种类，可以改变溶质的色谱行为，对β-内酰胺类抗生素，表现为其Kav值的改变及色谱峰型的变化。

7/27/202337色谱条件的影响2.流动相种类对溶质色谱行为的影响：7/26/流动相0.1mol/L头孢菌素的Kav值头孢他啶头孢曲松头孢噻吩柠檬酸缓冲液0.452.522.06硫酸铵0.361.761.45磷酸缓冲液0.311.361.42醋酸缓冲液0.270.791.00碳酸盐缓冲液0.210.550.88硝酸钠0.150.210.58流动相中缓冲液种类对头孢菌素色谱行为的影响7/27/202338流动相头孢菌素的Kav值头孢他啶头孢曲松头孢噻吩柠檬酸缓冲液测定次数缓冲盐0.1mol/L理论板数拖尾因子1磷酸缓冲液31911.43柠檬酸缓冲液23852.542磷酸缓冲液41211.43柠檬酸缓冲液31202.40流动相对头孢他啶高分子杂质色谱行为的影响7/27/202339测定次数缓冲盐理论板数拖尾因子1磷酸缓冲液31911.43柠分析证明，影响这种变化的决定因素是缓冲液中的阴离子种类，阴离子所带的负电荷越多，溶质的Kav值相对越大，色谱峰也越易拖尾。7/27/202340分析证明，影响这种变化的决定因素是缓冲液中的阴离子种类，阴离色谱条件的影响3.流动相pH的影响

对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。当流动相中有多元酸/盐存在时，pH通过影响多元酸的解离，改变缓冲液中的阴离子类型，来改变溶质的保留时间。7/27/202341色谱条件的影响3.流动相pH的影响7/26/202341色谱条件的影响4.洗脱速度的影响流速越大，溶质的保留值减小。反之，溶质的保留值增大。这是由于流速较快时，溶质分子进入凝胶颗粒内部的概率减小，导致与葡聚糖凝胶相互作用的机会减少之故。7/27/202342色谱条件的影响4.洗脱速度的影响7/26/202342色谱条件的影响5.溶质保留值和半峰宽的关系β-内酰胺抗生素在SephadexG-10凝胶色谱系统中的半峰宽与其保留时间均呈线性关系。也就是说，保留时间越大，半峰宽越大，峰型越难看。7/27/202343色谱条件的影响5.溶质保留值和半峰宽的关系7/26/2023第三节分子排阻色谱法中国药典2005版二部规定，分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术，其分离原理即为凝胶色谱柱的分子筛机制。β-内酰胺类抗生素中的高分子杂质的测定采用分子排阻色谱法。7/27/202344第三节分子排阻色谱法中国药典2005版二部规定，分子排阻自身对照外标法原理——

在SephadexG-10凝胶色谱系统中，由于SephadexG-10的排阻分子量仅为700道尔顿，因此，除部分寡聚物外，β-内酰胺抗生素中的高分子杂质在色谱过程中均不保留；即所有高分子杂质表现为单一的色谱峰，其kav=0。

7/27/202345自身对照外标法原理——7/26/202345自身对照外标法在特定条件下，β-内酰胺抗生素由于分子间的氢键、静电、疏水相互作用等次级相互作用，可以形成缔合物，导致其表观分子量增大。此时，在SephadexG-10凝胶色谱系统中和高分子杂质具有相似的色谱行为，即在kav=0处表现为单一的色谱峰。7/27/202346自身对照外标法在特定条件下，β-内酰胺抗生素由于分子间的氢键自身对照外标法测定方法——利用以上所述原理，在SephadexG-10凝胶色谱系统中，以药物自身为对照品，测定其在特定条件下缔合时的峰响应指标；再改变色谱条件，测定样品高分子杂质和药物分离后，kav=0处高分子杂质的峰响应指标；按外标法计算，既得药品中高分子杂质相当于药品本身的相对含量。流动相B：水流动相A：磷酸盐缓冲液7/27/202347自身对照外标法测定方法——流动相B：水7/26/202347为什么采用自身对照外标法？定量分析法的理论基础：通过检测器的物质的量与检测器的响应信号成正比，其检测器响应可以是面积或峰高。含量响应值(A或H)定量方法：外标法

内标法峰面积归一法主成分对照法7/27/202348为什么采用自身对照外标法？含量响应值定量方法：7/26/20

1.外标法以待测物质的对照品为参照物，根据供试品的量和对照品的量以及对应的响应信号进行定量的方法。

高聚物对照品较难制备，即使制备的高聚物对照品由于不稳定也较难保存，而且不同批制备的对照品很难同质。β-内酰胺抗生素高分子杂质具有高度的不均一性和不确定性。7/27/2023491.外标法7/26/2023492.归一化法将测得色谱图上，所有色谱峰面积求和，与每个色谱峰面积相比较，即得每个色谱峰的百分比，把所有的色谱峰的百分比相加即得100%，称为峰面积归一化。

对于高分子杂质来说，其含量和药物本身含量相差甚远，测量误差较大。7/27/2023502.归一化法7/26/202350高分子杂质样品主峰7/27/202351高分子杂质样品主峰7/26/2023513.内标法内标法是结合了峰面积归一法和外标法的优点的一种方法，它在加入内标后，按峰面积归一法的分析方法进行分析，这就避免了由于进样的一致性及样品歧视效应导致的偶然误差，因而，它的分析精密度也是比较高的，是气相色谱的一种比较理想的定量分析方法。

7/27/2023523.内标法7/26/2023524.主成分对照法由于SephadexG-10凝胶色谱分离系统的柱效较低，进样微量的药物很难表现出色谱峰。7/27/2023534.主成分对照法7/26/202353基本分析方法7/27/202354基本分析方法7/26/202354仪器1.恒流泵1）转速转速范围：0.1-120rpm,正反转可逆

2）调速方式：无级调速配以线性数码旋钮连续可调

3）速度分辩率：30rpm以下为0.1rpm，30rpm以上为1rpm硅胶管

1）粗细合适2）壁厚1.5mm3）耐磨7/27/202355仪器1.恒流泵硅胶管7/26/202355仪器2.玻璃层析柱合理选择层析柱的长度和直径，是保证分离效果的重要环节，理想的层析柱的直径与长度之比一般为1：25～1：100.7/27/202356仪器2.玻璃层析柱7/26/202356仪器3.检测器β-内酰胺抗生素通常都有较明显的紫外吸收特征，所以测定中一般选择紫外检测器，通常用到的检测波长是254nm。7/27/202357仪器3.检测器7/26/202357仪器3.数据处理系统

积分仪选择性记录,进行积分处理和定量计算色谱工作站色谱控制\数据采集\记录\计算\分析\图谱保存\实验结果编排\打印于一体7/27/202358仪器3.数据处理系统积分仪色谱工作站7/26/202358系统适用性试验1.以蓝色葡聚糖2000的保留时间来表示高分子杂质的保留特征，考察对照品色谱峰及高分子杂质色谱峰与蓝色葡聚糖2000溶液色谱峰保留时间的比值均应不超过某一限度。

中国药典要求是0.93～1.07。对照品峰和供试品溶液聚合物峰与相应色谱中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值也是0.93～1.07。7/27/202359系统适用性试验7/26/202359流动相A：磷酸盐缓冲液流动相B：水5.3495.1867/27/202360流动相A：磷酸盐缓冲液流动相B：水5.3495.1867/22.理论板数在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖2000峰计算，理论板数均不小于700。7/27/2023612.理论板数7/26/2023613.拖尾因子在两种流动相系统中，按蓝色葡聚糖2000峰计算，拖尾因子均小于2.0。7/27/2023623.拖尾因子7/26/2023624.重复性RSD考察对照品在流动相B系统中重复进样后峰面积的相对标准偏差应符合规定。7/27/2023634.重复性RSD7/26/202363流动相B：水测定对照品，在Kav=0处表现为单一的色谱峰，以药物自身为对照品，测定这一条件下缔合时的峰响应指标。5.305测定过程7/27/202364流动相B：水5.305测定过程7/26/202364流动相A：磷酸盐缓冲液测定供试品，测定样品中高分子杂质和药物分离后，Kav=0处高分子杂质的峰响应指标。5.3457/27/202365流动相A：磷酸盐缓冲液5.3457/26/202365影响准确测定的若干因素1.峰响应值的选择2.检测器类型及其线性范围3.进样量的影响4.对照品异质性的影响7/27/202366影响准确测定的若干因素1.峰响应值的选择7/26/20236分离度定义：分离度是指高分子聚合物与药物单体之间分离程度（或分离能力）。Hp——次高峰到基线的高。Hv——次高峰与最大峰曲线分离的最低点到基线的高。

7/27/202367分离度定义：分离度是指高分子聚合物与药物单体之间分离程度（或分离度影响因素1.凝胶对药物吸附作用的强弱与结构有关2.与洗脱剂组成有关3.与流动相的离子强度有关4.与流动相的pH有关5.与流动相的流速有关7/27/202368分离度影响因素1.凝胶对药物吸附作用的强弱与结构有关7/26第四节SephadexG-10凝胶色谱系统有关的实验技术1.凝胶的预处理凝胶：溶胶或溶液中的胶体粒子或高分子在一定条件下互相连接，形成空间网状结构，结构空隙中充满了作为分散介质的液体（在干凝胶中也可以是气体），这样一种特殊的分散体系称作凝胶。没有流动性。内部常含有大量液体。葡聚糖凝胶属于弹性凝胶弹性凝胶失去分散介质后，体积显著缩小，而当重新吸收分散介质时，体积又重新膨胀。

7/27/202369第四节SephadexG-10凝胶色谱系统有关的实验技凝胶粒度的选择：一般来说，细颗粒分离效果好，但流速慢；而粗颗粒流速快，但会使区带扩散，使洗脱峰变平而宽。因此，如用细颗粒凝胶宜用大直径的层析柱，用粗颗粒时用小直径的层析柱。在实际操作中，要根据工作需要，选择适当的颗粒大小并调整流速。

7/27/202370凝胶粒度的选择：7/26/202370凝胶溶胀方法：称取葡聚糖凝胶，缓慢地倾倒入5～10倍的去离子水中或蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀

2小时，一般采用后一种方法（能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡）。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，最后减压抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，准备装柱。

商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如SephadexG-20的吸水量为20，1克SephadexG─20吸水后形成的凝胶体积约40ml。

7/27/202371凝胶溶胀方法：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，根据凝胶再生：

对于不锈钢色谱柱其方法是:先用水反复进行逆向冲洗，再用缓冲溶液平衡，即可进行下一次分析。

对于玻璃层析柱其方法是：将凝胶从柱柱中取出，将已使用过的凝胶先用0.2mol/L氢氧化钠与0.2mol/L氯化钠混合液浸泡半小时后，用水洗至中性，再装柱。

对于长期不使用的硅胶其方法是：将洗好的凝胶用50%乙醇浸泡，抽干，然后，依次用75%、95%和无水乙醇浸泡抽干，最后用乙醚浸泡抽干置37℃烘干后，即可长期保存。7/27/202372凝胶再生：7/26/2023722.装柱取层析柱一根，底部用玻璃纤维或砂蕊滤板衬托，并要求滤板下的体积尽可能小。将柱垂直至于铁架上，然后在柱顶连接一长颈漏斗（漏斗颈直径约为柱直径的一半）。在柱中加水或洗脱液，并赶净滤板下方气泡，使支持滤板底部完全充满液体，然后将柱的出口关闭。把已经溶胀好的凝胶调成薄浆，从漏斗倒入柱内，胶粒逐渐扩散下沉，薄浆连续加入。

7/27/2023732.装柱7/26/202373装柱要点：1）凝胶浆浓度应适宜（一般为70%水混悬液），分散均匀不结团（不宜强烈搅拌）。2）一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。3）通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后，将带色的兰葡聚糖–2000溶液过柱，观察色带是否均匀下移，以鉴定新装柱的技术质量是否合格，否则，必须重新装填。7/27/202374装柱要点：7/26/2023743.加样

加样方法：凝胶床经平衡后，吸去上层液体，待平衡液下降至床表面时，关闭流出口，用滴管加入样品液，打开流出口，使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时，小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。

7/27/2023753.加样7/26/202375加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小，加样量可小；否则，加样量增大。一般来说，加样量越少或加样体积越小(样品浓度高)，分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的5％～10％。样品体积过大，分离效果不好。

7/27/202376加样量：加样量与测定方法和层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度4.洗脱加完样品后，将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、及记录仪相连，根据被分离物质的性质，预先估计好一个适宜的流速。

凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液，有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。

7/27/2023774.洗脱7/26/202377色谱柱的维护保养玻璃层析柱：1.装柱要均匀，不要过松也不要过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。2.始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。

7/27/202378色谱柱的维护保养玻璃层析柱：7/26/202378色谱柱的维护保养3.葡聚糖凝胶耐受压力为0.3兆帕，过高压力会损伤填料性能。4.防止柱长霉：可用20%乙醇或0.04%叠氮钠保存。5.防止柱受污染：可用

0.2mol/L氢氧化钠与0.2mol/L氯化钠混合液清洗。7/27/202379色谱柱的维护保养3.葡聚糖凝胶耐受压力为0.3兆帕，过高压力色谱柱的维护保养不锈钢色谱柱：1.在高于室温的条件下使用时，不要在测量完毕立即停泵，应该是继续通流动相直到色谱柱的温度低于室温为止。如果在色谱柱很热的时候停泵，当流动相冷却过程中色谱柱就会进入气泡。7/27/202380色谱柱的维护保养不锈钢色谱柱：7/26/202380色谱柱的维护保养2.若色谱柱在短期内不再使用，应用蒸馏水将含盐的流动相从色谱柱中替换掉，将色谱柱从仪器上取下，拧上塑料堵头。3.色谱柱长期不用，应在4℃储藏。若储藏温度低于0℃，则会降低柱效。4.避免阳光直射，避免与腐蚀性气体接触。7/27/202381色谱柱的维护保养2.若色谱柱在短期内不再使用，应用蒸馏水将含总结对抗生素中高分子杂质的分析根据不同品种的特点和不同质控要求灵活掌握，优先采用凝胶色谱法，但不排除其它验证良好的其它分析系统的应用，对不同品种，视分离情况和分离要求，将SephadexG-10和高效凝胶色谱系统综合应用。7/27/202382总结对抗生素中高分子杂质的分析根据不同品种的特点和不总结高效、快速、简便是抗生素高分子杂质测定方法的发展目标，也是必然趋势。在2005版中国药典中，发展较为完善的SephadexG-10凝胶色谱系统对多个品种抗生素高分子杂质的控制有着重要的意义。现在已有专门的β-内酰胺抗生素聚合物测定仪，对β-内酰胺抗生素的高分子聚合物检查方法的研究将起到推动作用。7/27/202383总结高效、快速、简便是抗生素高分子杂质测定方法的发展目复习题一、1.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质：对药品中分子量大于药物本身的杂质的总称。其分子量一般在1000～5000，个别可至约10000道尔顿。2.分离度：是指高分子聚合物与药物单体之间分离程度（或分离能力）。7/27/202384复习题一、7/26/202384复习题1.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质按其来源分为：

和

。（外源性杂质、内源性杂质）2.青霉类抗生素高分子杂质有

杂质和

两大类。（蛋白（多肽）类杂质、聚合物杂质）3.青霉类抗生素样品在储存过程中，多肽类杂质不断生成，其反应速度与

和

有关。（水分含量、储存温度）4.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质具有

性和

性。5.青霉素的聚合反应速度在溶液条件下和

关系密切；在固体条件下主要和

含量有关。(溶液的酸碱度、样品的水分)6.葡聚糖凝胶耐受压力为

，过高压力会损伤填料性能。(0.3兆帕)7.色谱柱在短期内不再使用，应用

将含盐的流动相从色谱柱中替换掉，将色谱柱从仪器上取下，拧上塑料堵头。（蒸馏水）8.色谱柱长期不用，应在

储藏。若储藏温度低于0℃，则会降低柱效。（4℃）

7/27/202385复习题1.β-内酰胺类抗生素中高分子杂质按其来源分为：复习题1.内酰胺类抗生素高分子杂质测定中影响分离度的因素（ABCD）A．与洗脱剂的组成有关B．与流动相的离子强度有关C．与流动相的PH有关D．与流动相的流速有关2.当流动相中的离子种类不改变时，离子强度越大，β-内酰胺类抗生素的Kav值（B）。A.越小B.越大C.不变D.没有影响3.当改变流动相的离子种类时，其Kav值会随之变化，决定这种变化的因素是流动相中的阴离子种类，阴离子所带的负电荷越多，溶质的Kav值相对（B）A.越小B.越大C.不变D.没有影响4.在色谱过程中，除分子排阻作用外，凝胶对药物分子的吸附作用与对高分子杂质的吸附作用相比（C）A.小于B.等于C.大于D.不一定

7/27/202386复习题1.内酰胺类抗生素高分子杂质测定中影响分离度的因素复习题1.简述影响β-内酰胺类抗生素中高分子杂质形成的因素？1)青霉素的聚合物的聚合反应速度在溶液条件下和溶液的酸碱度关系密切；在固体条件下主要和样品的水分含量有关。2)头孢菌素的聚合物固体状态下头孢菌素类产品聚合速度与含水量和贮存温度的关系密切。贮存温度较低时，含水量差异对聚合物含量尽管有影响，但影响不大；但当贮存温度上升至37℃时，含水量差异对聚合物含量的影响十分显著。

7/27/202387复习题1.简述影响β-内酰胺类抗生素中高分子杂质形成的因素？复习题2.简要说明凝胶色谱分离的原理？利用凝胶色谱的分子筛机制，但凝胶的孔径要比分子筛大得多，一般为几百至几千埃。让药物分子自由进入凝胶颗粒内部，而所有的高分子杂质被排阻，进而实现让所有高分子杂质具有相同的保留时间的设想。

7/27/202388复习题2.简要说明凝胶色谱分离的原理？7/26/202388复习题3.简述影响-内酰胺类抗生素高分子杂质测定中