比浊法操作手册

1011比浊法操作规程一、预备工作：〔一〕培育基的制备 ：1、III号培育基的制备胨5g葡萄糖1g牛肉浸出粉1.5g磷酸氢二钾3.68g磷酸二氢钾1.32g氯化钠3.5g酵母浸出粉3g水1000 ml除葡萄糖外，混合上述成分，加热溶化后滤过，加葡萄糖溶解后，摇匀，调整pH7.0～7.211530分钟。2、养分琼脂培育基的制备依据养分琼脂培育基上标注的比例系数，进展养分琼脂培育基和纯化水配制。或者依据药典进展配制。胨10g氯化钠5g琼脂15~20g肉浸液1000mlpH值使比最终的pH0.2～0.4，参与琼脂，加热溶化后滤过，调整pH值使灭菌后为7.2～7.4，分装，在11530分钟，趁热斜放使凝固成斜面。3、留意事项含有葡萄糖的培育基应在各成分加热溶解后再参与，其目的是防止葡萄糖加热被破坏。配制的培育基必需调整pH值，保证培育基灭菌后其pH值在规定范围之内；测定硫酸庆大霉素的培育基pH7.15～7.20。pH值的测定使用酸度计或其它准确度较高的仪器，使用20%的氢氧化钠溶液或浓盐酸进展调整；调整pH时应避开反复调整。配制的培育基应透亮、无沉淀。应先调整pH再分装后灭菌。配制好的培育基应储存在冷处，消灭浑浊后不能连续使用。〔二〕缓冲液的制备：1、pH7.0磷酸盐缓冲液〔BP〕磷酸二氢钾13.6g 氢氧化钠2.37g 灭菌水2023ml2、pH7.8磷酸盐缓冲液磷酸氢二钾5.59g 磷酸二氢钾 0.41g 水 1000ml3、留意事项所用化学药品规格不低于二级试剂(AR)规格。配制后假设消灭沉淀或浑浊应用耐酸滤过漏斗滤过，使溶液澄清。缓冲液配制后应澄明无色、无菌、无浑浊沉淀，应避开被毛点、纤维污染。配制后应灭菌保存使用。〔三〕试验菌：菌悬液的制备：金黄色葡萄球菌悬液取金黄色葡萄球菌的养分琼脂斜面培育物，35～37℃培育20～22小时。临用时，用灭菌0.9%灭菌氯化钠溶液将菌苔洗下，备用。大肠杆菌悬液取大肠杆菌的养分琼脂斜面培育物，接种于养分琼35~3720~22小时。临用时，用灭菌水将菌苔洗下，备用。白色念珠菌悬液取白色念珠菌的改进马丁琼脂斜面的颖培育物，10ml35~378至适宜浓度，备用。〔四〕试验器具：1、比色皿及大口吸管的清洗、灭菌：5放入恒温枯燥箱，150～160℃干热灭菌1～2小时。加培育基和菌液用大口吸管依次用自来水、洗涤液、自来水冲洗干净，用纯化水冲洗三次，用牛皮纸逐支包好，150～1601～2小时，备用。2、容量瓶、移液管、刻度吸管等周密计量器具的清洗、灭菌：依次用自来水、洗涤液、自来水洗涤，用纯化水冲洗三次，必要时于150～1601～2小时。3、留意事项比浊法所用器具应避开抗生素及微生物污染，必要时周密计量器具应进展灭菌。〔五〕抗生素溶液的配制：周密称取标准品或供试品适量〔制剂产品可依据剂型选择适当的方法〕于容量瓶中，配制成浓度为1000u/ml的溶液，选择适当的方法稀释至规定浓度。二、比浊法操作过程：1、标准品溶液及供试品溶液的制备可按各品种的具体规定，稀释制备，也可以进展预试验，选择适宜的浓度比，假设试验菌的灵敏度高可以选择低的剂间比，如1.25:1；假设试验菌的灵敏度低则可选择较高的剂间比，如2:14:1等。2、标准品溶液及供试品溶液的分装16支，安排dS14支，dS24支，dT14dT24支，分别作好标记，依据拉丁方挨次排列。将标准品溶液d、d 及供试品溶液Sl S2T1 d、d1.0毫升按编号参与相应的大试管中。留意：参与溶液时，均在有标记处沿管壁移入，以便在分装培育基时，可沿此处管壁流入，将沾在试管壁上的抗生素充分洗入培育基内〔如有自动加样装置，则可免去此手工法操作。T1 比浊法大试管拉丁方排列示意图3、比浊法试验用培育基的接种接种试验菌的量，需作推想试验，使S1、S2管，经培育后(37℃，一4小时)，吸取度A〔D光密度〕0.3～0.7为适当。4、培育基的分装比浊法试验用的培育基，接种试验菌后用大口吸管或其他自动加样器，分装至大试管中，每管分装9.0ml，每管分装量应尽量全都，其差异沿管壁流入，马上振摇，使抗生素溶液与培育基混合均匀。5、培育依据各品种规定的条件进展培育。6、测量取同条件下接种的比浊试验用培育基9.0mllml，12％甲醛液0.5mlWBS-100微530nm各大试管内培育物的吸取度。短时间内完成的在线测量，既能保证更高的精度，又避开了与甲醛的过多接触。7、计算结果及误差统计分析比浊法效价测定二剂量法结果的计算，可照管碟法效价测定二剂量法偏离平行及可信限率等，以检验试验结果的牢靠性。使用WBS-100微生物比浊仪可进展自动计算比浊法操作留意事项1、防止抗生素污染：比浊法测定抗生素效价抗生素溶液的浓度格外低，抗生素在培育基中的最终浓度约为0.01～0.1u/ml，因此测定时所用的试验器具应严防抗生素残留和污染。比方，培育用比色皿至少用自来水冲洗6次、用纯化水冲洗三次，洗涤比色皿和大口吸管的水池与洗涤抗生素溶液的水池分开。2、防止微生物污染：微生物污染比照浊法测定效价有很大影响，假设试验用器具、材料被微生物污染，将导致生物反响紊乱，各管形成的吸取度周密度变差，可信限率显著增高，测定结果的周密度和准确度变差，所以试验过程中应严防微生物污染。因此，试验用比色皿、大口吸管、培育基、缓冲液等应灭菌后使用，稀释用周密计量器具必要时进展灭菌。3、菌种：试验用菌种应保持颖、纯洁，对抗生素反响应灵敏。菌种对测定影响很大，假设菌种不适合，将得不出正确结果甚至得不出结果。假设菌种不鲜，其生长速度慢，在规定时间内浊度〔吸取度〕达不到要求；假设菌种不纯，各管形成的吸取度周密度差，可信限率高；假设菌种对抗生素反响不灵4、培育基：试验用培育基的灵敏度应高，应严格把握培育基的pH值。假设培育基的灵敏度不高或培育基的pH值不适合，细菌生长速度慢，在规定时间内浊度〔吸取度〕达不到要求。硫酸庆大霉素培育基消毒后pH值最好把握7.15～7.20。5、抗生素溶液的配制、稀释与参与：1.00ml抗生素溶液时应周密9.0ml带菌培育基应周密。6、培育：培育温度应均匀，应依据随机排列的方式进展培育〔二剂量法和三剂量法依据拉丁方排列，以消退局部培育温度不均匀对结果的影响。7、培育时间：0.3以上即可。假设觉察某种剂量下细菌生长缓慢或停顿生长应停顿试验，否则测定结果变化较大。比浊法常见的特别现象及其解决方法特别现象 缘由 解决方法照、凹凸剂量距离小，可信度不适宜〔低〕 溶液的浓度限率高阳性比照、凹凸剂量细菌生菌种不颖，活力差更换或纯化菌种；长的浊度值均小。 培育基不灵敏 更换培育基阳性比照浊度大，凹凸剂量抗生素的浓度不适宜降低抗生素溶液的浓浊度小 〔高〕 度照、凹凸剂量浊度均符合要菌种不纯或器具被杂或对器具进展清楚灭的距离符合要求，各管间的浊度值周密度差，可信限率高阳性比照、低剂量浊度值符抗生素的浓度不适宜降低剂间比合要求，高剂量浊度值低，〔剂间比过大〕凹凸剂量距离过大阳性比照、凹凸剂量浊度值抗生素的浓度不适宜提高剂间比均符合要求，阳性比照与低〔剂间比过小〕剂量距离符合要求，凹凸剂量距离过小过低 皿方向放置错误抗生加强操作，削减错误；素污染 器具清洗消毒结果明显不正确，偏离平行四组剂量依据拉丁方加强操作，削减错误特别高 排列放置时位置错误操作实例分析1、以下是一组有问题的试验报告：下：品名：硫酸庆大霉素原料 编号：00005 试验日期：2023.11.16碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.4920.4790.4970.4881.956No.20.4840.4690.4820.4631.898No.30.4950.4740.4920.4701.932No.40.4890.4760.4910.4701.927No.50.5070.4910.5120.4861.996No.60.5030.4770.4990.4711.950No.70.4810.4870.5000.4851.954No.80.4960.4840.5040.4801.964yk3.9463.8383.9783.81415.576阳性比照：0.521培育时间：3.5小时试管型号：2㎝试品间F1=0.0695回归F2=78.3748偏离平行F3=3.1699剂间F6=27.2044组间F7=7.0663组数m=8估量效价At=100剂间比r=1.5浓度比D=1对数值I=0.1761t表t=2.08样品方差S^2=0自由度f=21R的对数M=－0.0052回归系数g=0.0552标准误差Sm=0.0205对数比值R=0.9880R上限Rh=1.089R下限 Rl=0.8951测定效价Pt=98.8002Pt上限Ph=108.9019Pt下限Pl=89.5091平均可信限率PtFL%=9.81试验说明：菌 液：III号培育基培育18个小时。1000单位→100单位→5单位→0.40.6单位。培育过程：在WBS-10037330分。问题与争论:符合第一条特别现象。度过低，应提高溶液的浓度，必要时提高剂间比。2、以下是某药品检验所用WBS-100微生物比浊仪做出的一份试验结果：试验数据如下：品名：硫酸庆大霉素原料 编号：00006 试验日期：2023.11.2碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.2520.0990.2420.0950.688No.20.2280.0890.2370.0910.645No.30.2260.0870.2370.0850.635No.40.2340.0910.2320.0890.646No.50.2560.0950.2460.0950.692No.60.2550.0900.2490.0920.686No.70.2530.0920.2420.0880.675No.80.2530.0940.2530.0940.694yk1.9570.7371.9380.7295.361阳性比照：0.436试品间剂间F1=F6=0.7115 回归F2=5758.27771919.7024组间 F7=4.5630偏离平行F3=0.1181组数m=8估量效价At=100剂间比r=1.5浓度比D=1对数值I=0.1761t表t=2.08样品方差S^2=0.0032自由度f=21R的对数M=－0.0052回归系数g=0.0552标准误差Sm=0.0205对数比值R=1.0045R上限Rh=1.0158R下限Rl=0.9934测定效价Pt=100.4517Pt上限Ph=101.5752Pt下限Pl=99.3413平均可信限率PtFL%=1.11试验说明：菌液：III18个小时。1000单位→100单位→5单位→0.40.6单位。培育过程：在WBS-10037330分。问题与争论:符合第三条特别现象1、测定效价准确，可信限也格外低；但是凹凸剂量浊度值生长缓慢。2、造成这种状况的缘由是抗生素浓度过高。3、左右效价差距大约在一个效价单位左右，精度很好。3、以下是本公司试验室工作人员做出的一些报告：品名硫酸庆大霉素原〔自身比照编号：00006 碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.5580.3750.5540.3791.866No.20.5510.3720.5510.3651.839No.30.5390.3670.5320.3581.796No.40.5500.3570.5560.3681.831No.50.5650.4040.5590.3911.919No.60.5360.3740.5320.3811.823No.70.5490.3820.5580.3801.869No.80.5690.3790.5810.3831.912yk4.4173.0104.4233.00514.855阳性比照：0.692培育时间：4小时试管型号：1㎝试品间F1=0.0004回F2=3369.3252偏离平行F3=0.0511剂间F6=1123.1250组F7=7.0663组数m=8估量效价At=100剂间比r=1.5浓度比 D=1对数值I=0.1761t表t=2.08样品方差S^2=0.0001自由度f=21R的对数M=－0.0001回归系数g=0.0013标准误差Sm=0.0205对数比值R=0.9999R上限Rh=1.0145R下限Rl=0.9854测定效价Pt=99.9856Pt上限Ph=101.4499Pt下限Pl=98.5425平均可信限率PtFL%=1.45试验说明：菌 液：斜面培育基培育20小时，加2毫升菌液。1000单位→100单位→5单位→0.40.6单位。培育过程：在WBS-100374小时。问题与争论：药典规定吸光度的范围。估量效价及可信限率均不错。24、以下试验是在某省所做出的回收率试验报告：该报告左90%110%的含量。品名硫酸庆大霉素原〔自身比照〕编号00006 试验日期左侧：90%含量测定碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.4280.2790.4500.3141.480No.20.4320.2700.4380.3101.450No.30.4110.2650.4700.3151.461No.40.4030.3010.4450.3181.467阳性比照：0.562培育时间：350分试管型号：2㎝试品间剂间F1=23.7193F6= 133.0591F2=375.4530组间F7=0.1892偏离平行F3=0.0048组数m=8估量效价At=100剂间比r=1.5浓度比 D=1对数值I=0.1761t表t=2.2620样品方差S^2=0.0002自由度f=21R的对数M=－0.0425回归系数g=0.0136准误差Sm=0.0094对数比值R=0.9067R上限Rh=0.9511R下限Rl=0.8621测定效价Pt=90.6721Pt上限Ph=95.1124Pt下限Pl=86.2056平均可信限率PtFL%=4.91问题与争论：左侧测得的效价与90%格外接近,凹凸剂量之间根本上也已经拉开确定的距离，可信限也能把握在5%以内，偏率平行也通过，说明该结果符合要求。右侧：110%含量测定碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.4120.2580.3850.2191.274No.20.4280.2750.3680.2321.303No.30.3980.2410.3520.2281.219No.40.4000.2610.3900.2311.282阳性比照：0.562培育时间：350分试管型号：2㎝试品间F1=33.8013回归F2=664.1970偏离平行F3=0.1525剂间F6=232.7171组间F7=2.4152组数m=8估量效价At=100剂间比r=1.5浓度比D=1对数值I=0.1761t表t=2.2620样品方差S^2=0.0001自由度f=21R的对数M=－0.0415回归系数g=0.0077标准误差Sm=0.0070对数比值R=1.1002R上限Rh=1.1421R下限Rl=1.0614测定效价Pt=110.0165Pt上限Ph=114.2058Pt下限Pl=106.1382平均可信限率PtFL%=3.67问题与争论：高剂量抗生素吸取度略微偏低右侧测得的效价与110%格外接近，凹凸剂量之间也拉开了距离，可信限也把握在5%以内，偏率平行也通过，说明该结果也符合要求。综合争论：由以上的左右两组拉丁方阵测得的结果可以看出：的效果。5、以下是某药品检验所做出的试验结果：该硫酸庆大霉素注射液含量不符合规定品名：硫酸庆大霉素注射液 编号：00003 试验日期：2023.11.04初试结果：碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.4530.3120.4690.3351.569No.20.4480.3250.4580.3541.585No.30.4550.3190.4780.3421.594No.40.4590.3230.4820.3491.613No.50.4400.3180.4780.3411.577No.60.4450.3200.4720.3621.599No.70.4470.3280.4660.3411.582No.80.4330.3050.4700.3481.556yk3.5802.5503.7732.77212.675试品间剂间F1=90.5336F6=753.1149回碟归间F2=2168.3692F7=1.3384偏离平行F3=0.4421组数 m= 8 估量效价At=100剂间比 r= 2 浓度比D= 1.0016 对数值I= 0.3010t表 t= 2.08 样品方差S^2=0.0059 自由度 f= 21R的对数M=－0.0608 回归系数g=0.0020 标准误差Sm=0.0066对数比值R=0.8693 R上限 Rh=0.8970 R下限 Rl=0.8420测定效价Pt=86.9329 Pt上限 Ph=89.7018 Pt下限Pl=84.2023平均可信限率PtFL%=3.16复试结果：碟号ds1ds2dt1dt2ymNo.10.5680.3540.5990.3611.882No.20.5790.3480.6050.4051.937No.30.5820.3620.6110.4181.973No.40.5590.3470.5940.3851.885No.50.5750.3650.6120.4151.967No.60.5620.3590.6020.4091.932No.70.5670.3640.6140.3961.941No.80.5730.3550.6220.4111.961yk4.5652.8544.8593.20015.478试品间剂间F1=51.1917F6=1448.0846回碟归间F2=4192.0639F7=3.5864偏离平行F3=0.9981组数m=8估量效价At=100剂间比r=2浓度比D=1.0016对数值I=0.3010t表t=2.08样品方差S^2=0.0085自由度f= 21R的对数M=－0.0565回归系数g=0.0010标准误差Sm=0.0047对数比值R=0.8781R上限 Rh=0.8981R下限Rl=0.8583测定效价Pt=87.8062Pt上限Ph=89.8082Pt下限Pl=85.8259平均可信限率PtFL%=2.27试验说明：菌 液：养分琼脂斜面培育基培育16小时。加样操作：1000u/ml硫酸庆大注射液→100u/ml→5u/ml→0.35u/ml和0.7u/ml的硫酸庆大注射液。37℃下，20X20320分。管碟法结果:初试：83.56%，复试：90.48%, 合并计算结果：86.59%问题与争论：比浊法测定结果周密度好，管碟法测定结果周密度较差，两种方法测定结果合并计算值接近。WBS-100微