人促红细胞生成素在细胞上的表达

人促红细胞生成素在细胞上的表达第1页，课件共21页，创作于2023年2月促红细胞生成素的理化性质

EPO是由165个氨基酸组成的高糖基化蛋白质，去唾液酸或去糖基化不影响重组人EPO的体外生物活性，但却缩短了在体内的半衰期，使其完全丧失了在体内的活性，说明糖基对其生物活性是至关重要的，因此基因工程的EPO不能利用原核表达系统，只能利用哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞）生产第2页，课件共21页，创作于2023年2月关于EPO人促红细胞生成素是一种由肾脏产生的高度糖基化蛋白,是红系细胞发育过程中最重要的调节因子。天然存在的EPO药源极为匮乏,须从贫血病人尿中提取,不能满足社会的需要。1985年Jacob等成功地从胎儿肝中克隆出EPO基因,使通过基因工程手段大量生产重组EPO成为可能。第3页，课件共21页，创作于2023年2月关于EPO国外用人促红细胞生成素gDNA(genomicDNA)在哺乳动物细胞中已获得高效表达,而在我国虽也有重组产品问世,但存在表达水平偏低,生产成本偏高的问题,不能满足大规模工厂化生产和临床应用的需要,因此迫切需要提高EPO在细胞中的表达量。为此,我们开展了EPO在CHO细胞中的表达研究,希望能获得比较理想的效果。第4页，课件共21页，创作于2023年2月实验目的：获得人促红细胞生成素(EPO)的高效表达第5页，课件共21页，创作于2023年2月三、实验仪器及耗材实验试剂与器材氨甲喋呤(MTX)、煌焦油蓝购于Sigma公司;rHuEPO体内生物学活性测试工作标准品为Amgen公司产品;Lipofectamine、犊牛血清、F12与D-MEM细胞培养基购自Gibco/BRL公司;EPOELISAkit购自BoehringerMannheim公司;96孔与24孔细胞培养板为Costar产品。第6页，课件共21页，创作于2023年2月三、实验仪器及耗材实验材料菌株DH5α,JM109均由本实验室保存。质粒质粒pD、p38(内含EPOgDNA)由本实验室保存,pcDNA3购自Invitrogen公司,pSV40dhfr由PaulBerg实验室构建,本实验室保存。工具酶各种限制性内切酶均购自华美生物工程公司,T4DNA连接酶与牛小肠碱性磷酸酶购自Gibco/BRL公司,DNA聚合酶I大片段(Klenow)购自Promega公司第7页，课件共21页，创作于2023年2月三、实验仪器及耗材细胞株CHO-dhfr-细胞由本室保存。实验动物雌性BALB/c小鼠,6~8周龄。第8页，课件共21页，创作于2023年2月方法以EPOgDNA为基础构建了两个真核表达载体pDE、pCE,将它们分别经脂质体转染CHO-dhfr-细胞,其48h瞬时表达量分别为27·5ng/ml与88·90ng/ml。然后用氨甲喋呤(MTX)对转染细胞进行加压并挑选细胞克隆,共获得3株高效表达EPO的工程细胞株A,B,C,其中A来自质粒pCE,B和C来自pDE,在2×10-6mol/L的MTX的压力下,它们48h的最高表达水平分别为A:8·7μg/mlB:10·76μg/ml,C:16·44μg/ml。经网织红细胞法测得它们均具有体内生物活性。第9页，课件共21页，创作于2023年2月网织红细胞计数

(一)原理网织红细胞是晚幼红细胞脱核后但尚未完全成熟的红细胞,胞质中尚有核糖体、核糖核酸等嗜碱性物质残存,经煌焦油蓝或新亚甲蓝活体染包后,胞质中可见蓝或蓝绿色枝点状甚至网织状结构。

(二)方法活体染色法.近年来还可通过某些血液自动分析仪及流式细胞术检测法进行网织红细胞计数。第10页，课件共21页，创作于2023年2月四·实验步骤质粒的转化、酶切、去磷、连接、重组子质粒的鉴定等基因操作

细胞的转染按lipofectamine使用说明书进行,在此过程中质粒要经特定的内切酶线性化,在pCE中采用BglⅡ,pDE则采用EcoRⅠ,其中质粒pCE要与经EcoRⅠ线性化的质粒pSV40-dhfr共转染。细胞克隆的筛选CHO-dhfr-细胞在转染质粒48h后,经胰蛋白酶消化后进行细胞计数,用F12培养液将其稀释成1×104cells/ml,置37℃CO2培养箱中培养,当细胞形态恢复正常后,换用D-MEM培养液置CO2培养箱中继续培养,约15d后出现肉眼可第11页，课件共21页，创作于2023年2月实验步骤见的细胞克隆此时可用弯头吸管挑取细胞克隆至96孔细胞培养板中培养,同时在培养液中添加MTX,其初浓度为1×10-8mol/L,以每10d为一个周期,倍比地提高MTX的浓度。在适当的时候将96孔板内的细胞转入24孔细胞培养板中,然后再转入30ml细胞培养瓶中培养,至此细胞克隆工作即告完成。在挑选克隆的过程中,应挑取加压后表达水平提高较明显的细胞株,而非一开始表达量较高的细胞。细胞表达上清中EPO含量的检测采用BoehringerMannheim公司的EPOELISAkitEPO生物活性的测定采用网织红细胞计数法第12页，课件共21页，创作于2023年2月五·实验结果1·真核表达载体pDE、pCE的构建

将质粒p38经SalⅠ酶切后,回收长为2·4kb的EPOgDNA片段,除EPO蛋白编码区外,其5’非翻译区长120bp,3’非翻译区长200bp。同时将真核表达载体pD、pcDNA3分别用SalⅠ、HindⅢ线性化,线性化的pD经CIP去磷后与EPO基因片段按适当的比例温合连接,获得重组质粒pDE;将线性化的质粒pcDNA3与EPO基因片段均经Klenow补平,并且将线性化的pcDNA3经CIP去磷,两者按适当比例混合后用T4DNA连接酶连接,得重组质粒pCE。质粒pCE与pDE的物理图谱如下。第13页，课件共21页，创作于2023年2月实验结果第14页，课件共21页，创作于2023年2月·2瞬时表达结果将质粒用lipofectamine转染CHO细胞后48h,收集细胞上清,经PBS稀释100倍后,用ELISA测定其EPO的浓度,结果见表1。第15页，课件共21页，创作于2023年2月3稳定表达·经MTX筛选后得到的三个高表达细胞株A、B、C,在MTX的浓度为2×10-6mol/L时,测定它们48h细胞上清中EPO的浓度,样品均用PBS稀释10000倍,结果见表2。第16页，课件共21页，创作于2023年2月4EPO体内生物活性的测定

经过网织红细胞法,测得工程细胞株A,B,C48h稳定表达上清中的EPO含有体内生物活性,其体内活性值分别为A:848·3IU/ml,B:1049·1IU/ml,C:1602·9IU/ml。第17页，课件共21页，创作于2023年2月六·讨论真核基因表达不仅可以生产大量的感兴趣蛋白,而且在细胞遗传学与生物学中具有广泛的应用,因此研究基因在真核细胞中的表达具有极其重要的理论及实践意义。外源基因在哺乳动物细胞中的表达受许多因素的影响,如转录水平、转录后处理、翻译水平以及翻译后加工等方面,其中尤以转录水平的调节最为重要。在细胞中转录水平的调控是由基因的顺式作用元件与细胞内存在的反式作用因子之间的相互作用来实现,由于在特定的细胞内,反式作用因子是固定的,不可改变的,因此基因的表达主要取决于其顺式作用元件的作用。第18页，课件共21页，创作于2023年2月对外源基因而言,也就是决定于特定的表达载体中的启动子,一个合适的启动子可将外源基因的表达水平提高几倍甚至几十倍。但是对于特定的基因和细胞,各启动子起始转录的效率有很大的差别,因此我们认为在进行外源基因的表达研究中,应考虑选用几种不同的强启动子,才有可能获得较为理想的表达效果。目前外源蛋白在真核细胞中的稳定表达均采用了选择扩增系统,其中以二氢叶酸还原酶基因扩增系统研究最为清楚,应用最为广泛。可以通过MTX的渐次加压选择而进行极大地增加外源基因的拷贝数,从而提高外源蛋白的产量。第19页，课件共21页，创作于2023年2月有关文献报道认为与dhfr基因共转染的DNA倾向于同它一起整合于细胞染色体的共同区域,当用MTX进行加压筛选时,它们将同时进行扩增。但我们的研究表明共转染时加压效果不明显,这可能是由于它们并未整合于染色体的相同位点所致。因此我们认为最好选用dhfr基因与目的基因串联在一起的载体来进行表达,加压效果较为明显。我们的表达结果明显高于国