SN0169-92出口食物中大肠菌群粪大肠菌群和大肠杆菌查验方式

中华人民共和国进出口商品查验行业标准查验方式代替ZBX0900288Methodforexaminationofcoliform,fecalcoliformandescherichiacoliinfoodforexport━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━主题内容与适用范围杆菌的检验方法。本标准适用于出口食品的检验。设备和材料5mL10mL1mL水浴箱：±0.5℃。培育箱：36±1℃,±0.5℃。0～5℃和-15～-20℃。均质器。乳钵和研棒。显微镜。稀释瓶：100mL、200mL500mL5mm。菌落计数器。培育基及试剂)(LST)肉汤。煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤。EC(EMB)。养分琼脂斜面。色氨酸肉汤。Korser结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)。Butterfield生理盐水。革兰氏染色液。甲基红指示剂。Voges-proskauer(V-P)试剂。样品制备以无菌操作取有代表性的样品。如有包装则用75％乙醇在开口处擦拭后取样。假设不能准时检验,应将冷冻样品置于-154℃冰箱保存。检验前冷冻样品可于2～5℃18h45℃以下15min内解冻。不同食品样品匀液的制备4.2.1液体食物25mL225mL(瓶内预置适当数量的玻璃珠),30cm7s251:10固体和半固体食品25g225mL8000r/min1～2min,制成1:10样品匀液(也可用灭菌乳钵研磨的方法代替)。稀释样品匀液依据对样品污染状况的估量,用稀释剂将样品匀液制成一系列十倍递。从制备样品匀液至稀释完毕,全过程15min。大肠菌群的测定MPN5.1.1对每一个样品,选择适宜的三个持续稀释度的样品稀释液。每一个稀释度接种三管月)(LST1mL。36±1℃48±2h。观看试管的产气状况：检查倒管内是否有气泡产生,记录24h48hLSTLST群阴性；如有产气者,则进一步作证明试验。大肠菌群的证明试验5.2.13mm糖胆盐(BGLB)肉汤管中。置BGLB36±1℃48±2h。BGLBBGLBMPNB充件)]报告每克(毫升)样品中大肠菌群的MPN粪大肠菌群测定3mm48±2hLST管培育物移种于EC将全部接种的EC30min±0.5℃水浴24±2h。水浴箱的水平面应高于肉汤培育基液面。应以为44.5℃44.5℃不产气的产气肠杆菌或其他大肠菌群细菌作阳性和阴性比照。EC性；不产气管为粪大肠菌群试验阴性。MPN粪大肠菌群的MPN大肠杆菌测定将条中的EC24h,取其产气管的培育物划线接种于伊红美蓝(EMB)平板,36±1℃24±2h。检查平板上有无具黑色中心有光泽或无光泽的典型菌落。2如无典型菌落,则从每个平移种到养分琼脂斜面上,36±1℃18～24h。将斜面培育物移种到以下培育基中进展生化试验。7.4.136±1℃24±2hKovacs氏试剂～,上层显现红色为靛基质阳性反响。MR-VP36±1℃48±2h。以无菌操作移取1mL13mm×100mm试管中,加5％α-萘酚乙醇溶液,40％氢氧化钾溶液和少量肌酸结晶,振摇试2h,如消灭伊红色,为VPMR-VP48h5滴甲基红溶液。如培育物变红色,为甲基红试验阳性,假设变黄色则为阴性反响。Koser36±1℃培育96hLST36±1℃48±2h,观看试管中是不是产气。18h大肠杆菌为革兰氏阴性。大肠杆菌与非大肠杆菌生化鉴别如下：━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━┳━━━━━━━━━靛基质┃ MR ┃ VP ┃ 椽酸盐┃鉴定(型别)━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━＋┃ ＋ ┃ － ┃ －┃典型大肠杆菌—┃ ＋ ┃ － ┃ －┃非典型大肠杆菌━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━＋┃＋┃－┃＋┃典型中间型－┃＋┃－┃＋┃非典型中间型━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━╋━━━━━━━━━—┃ － ┃ ＋ ┃ ＋┃典型产气肠杆菌＋┃ － ┃ ＋ ┃ ＋┃非典型产气肠杆菌━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━┻━━━━━━━━━如显现上表之外的生化反映类型,说明培育物可能不纯,应从头划线分别,必要时做重复试验。结果报告：大肠杆菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌,发酵乳糖产酸产气,IMViC－－或－＋－－,再依据LSTMPN克(毫升)样品中大肠杆菌MPN值。大肠菌群固体培育基测定法4计数8.2.11mL。1mL将冷至45±0.5℃的结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)10～15mL心旋转平皿,将培育基与样液充分混匀。3～4mLVRBA36±1℃18～24h。30～150肠菌群菌落。典型菌落为紫红色,菌落四周有红色的胆盐沉淀环。菌落直径为0.5mm或更大。证明VRBA10种于BGLB36±124h48h,观看产气情形。性管,应进展革兰氏染色,以便排解革兰氏阳性杆菌。结果报告经最终证明为阳性(产气,革兰氏阴性杆菌)的试管百分比乘以于条中计数的平板菌落数,再乘以稀释倍数,即为每克(毫升)样品中大肠菌群数。,在VRBA10010BGLB6为：100×6/10×10**4/g(mL)＝×10**5/g(mL)附录A培育基和试剂(补充件)A1月桂基硫酸盐胰蛋白(月示)(LST)肉汤胰蛋白(月示)或胰酪胨(Trypticase)20g氯化钠 5.0g乳糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)2.75g磷酸二氢钾(KH2PO4)2.75g0.1g蒸馏水将各成分溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管的20mm×150mm10mL。12115min。最终±。A2煌绿乳糖胆盐(BGAB)肉汤10.0g乳糖 10.0g牛胆粉(oxgall或oxbile)溶液％煌绿水溶液蒸馏水500mL200mL20.0gmL～975mL,调。再参加％煌绿水溶液,用蒸馏水补足到1000mL,用棉花过滤后,分装到20mm×150mm10mL12115minA3EC胰蛋白(月示)或胰酪(月示)20.0g3号胆盐或混合胆盐 1.5g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)4.0g磷酸二氢钾(KH2PO4)1.5g氯化钠5.0g蒸馏水16mm×150mm试管(管内有倒立的小发酵管),每管8mL。12115min,最终±。A4伊红美蓝琼脂(EMB)10.0g乳糖10.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)2.0g琼脂15.0g伊红γ(水溶性) 0.4g或2％水溶液20mL美蓝 0.065g或％水溶液13mL蒸馏水在1000mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和琼脂,加水补足至原量。分装于三角烧瓶中。每瓶100mL200mL15min。最终±。使用前将琼脂溶化,于每100mL5mL20％乳糖水溶液、2mL2％伊红γ45～50℃倾注平皿。A5养分琼脂斜面牛肉膏 3.0g蛋白胨 5.0g琼脂15.0g蒸馏水将各成分加于蒸馏水中,煮沸溶解。分装适宜的试管。12115min。最终±。灭菌后摆成斜面备用。A６色氨酸肉汤胰胨或胰酪胨10.0g蒸馏水加热搅拌溶解胰胨或胰酪胨于蒸馏水中。分装试管,每5mL。12115min。最终±。A7MR-VP(月示)胨 7.0g葡萄糖 5.0g磷酸氢二钾(K2HPO4)5.0g蒸馏水,121℃高压灭菌15min,最终±。A8Koser磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O) 磷酸氢二钾(K2HPO4)1.0g硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.2g枸椽酸钠(含2H2O) 蒸馏水15min。最终±。A9结晶紫中性红胆盐琼脂(VRBA)蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g氯化钠5.0g31.5g中性红0.03g结晶紫琼脂15～18g蒸馏水0.002g将上述成分溶于蒸馏水中,静置几分钟,充分搅拌,调至2min,将45～503h。A10Butterfield贮存液磷酸二氢钾(KH2PO4)34.0g500mL将磷酸二氢钾溶于蒸馏水中,用1mol/L175mL稀释液取贮存液,用蒸馏水稀释至1000mL,分装于适宜容器后,12115min。A11氯化钠 8.5g蒸馏水将氯化钠溶于蒸馏水中,12115min。A12革兰氏染色液结晶紫染色液：结晶紫 1.0g95％乙醇1％草酸铵水溶液将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。革兰氏碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g蒸馏水完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。沙黄复染液：沙黄 0.25g蒸馏水将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。染色法将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。1min,水洗。不要过分脱色,水洗。1min,水洗、待干、镜检。结果：革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。A13Kovacs对二甲氨基苯甲醛 戊醇盐酸(浓)将对二甲氨基苯甲醛溶于戊醇中,然后渐渐参加浓盐酸即可。A14甲基红指示剂甲基红0.1g95％300mL300mL500mL。A15Voges-Proskauer(V-P)试剂甲液α-萘酚 5.0g无水乙醇乙液氢氧化钾40.0g用蒸馏水加至附录B(补充件)0.001g。━━━━━━━━━┳━━━━┳━━━━━━━━━━┳━━━━阳性管数 ┃ ┃ 阳性管数┃━━━━━━━━━┫MPN┣━━━━━━━━━━┫MPN┃ ｜┃━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━0 0 0 ┃＜3 ┃ 2 0 0 ┃0 0 1 ┃ 3 ┃ 2 0 1 ┃1420002┃6 ┃202┃26003┃9 ┃203┃010┃3 ┃210┃1520011┃┃211┃27012┃┃212┃34013┃12┃213┃21020┃┃220┃021┃┃221┃2835022┃12 ┃222┃023┃16┃223┃42030┃┃230┃2936031┃13┃231┃44032┃16┃232┃53033┃19┃233┃━━━━━━━━━╋━━━━╋━━━━━━━━━━╋━━━━100┃┃300┃23101┃┃301┃3964102┃11┃302┃95103┃15┃303┃110┃┃310┃4375111┃11┃311┃112┃15┃312┃120160113┃19┃313┃93120┃11┃320┃121┃15┃321┃150210122┃20┃322┃290123┃24┃323┃240130┃16┃330┃460131┃20┃331┃132┃24┃332┃1100＞1100133┃29┃333┃━━━━━━━━━┻━━━━┻━━━━━━━━━━┻━━━━注:①本表承受3个稀释度[0.1g(mL)0.01g(mL)和0.001g(mL)]31g(mL0.1g(mL0.01g(