第七章-生物质谱技术课件

第七章生物质谱技术1第七章1生物质谱概念与分类

质谱的基本原理数据库检索与蛋白质鉴定2生物质谱概念与分类质谱的基本原理数据库检索一、质谱原理

1、发展历史

1886：Goldstein发明早期质谱仪的离子源

1912：质谱仪问世，对小分子化合物进行分析1942:

第一台单聚焦质谱仪商品化50年代发展了气-质联用，进入混合物分析阶段3一、质谱原理1886：Goldstein发明早期质谱仪的等离子体解吸（plasmadesorption,PD）、快原子轰击（fastatombombardment,FAB）：几千Da80年代末发明了两相软电离质谱技术ESI-MS和MALDI-TOF-MS.出现生物质谱，使质谱仪的应用又发生了一次飞跃，开始分析生物大分子

给生命科学研究带来的影响是革命性的！4等离子体解吸（plasmadesorption,PD）、552、质谱基本原理按离子质量数m与电荷数z的比值（称质荷比m/z）大小顺序排列，应用电磁学原理，分离和测定离子化了的分子或原子质量，它是一种物理方法，即物质粒子的质量谱。质谱原理：

简单！能量守恒原理质谱仪器：

不简单！能量守恒原理的具体实施者62、质谱基本原理6质谱仪的基本组成1.离子源2.静电加速系统3.分离系统4.检测器和读出系统特点高真空度：机械泵（10-2），涡轮分子泵、油扩散泵（10-7-8）高电压：至2-3万伏接气相色谱、液相色谱：分析混合物质量分析器质量检测器离子源加速电场7质谱仪的基本组成质量分析器质量检测器离子源加速电场7样品导入系统：固体坩埚、样品靶、毛细管、探针等离子源：电子轰击、场电离、场解析、化学电离、激光电离、电喷雾等加速系统：高静电场分离系统：电磁铁、四极杆、飞行管、离子阱以及混合分离器检测系统：电子倍增器、光电倍增管、微通道板（MCP）等数据处理系统：模数转换系统、示波器、计算机8样品导入系统：固体坩埚、样品靶、毛细管、探针等8样品导入：直接进样固体靶HPLC导入GC导入离子原：EI、CI、FAB（快原子轰击）、FD（等离子体解吸）、FI、MALDI、ESI质量分离器：电磁铁（M）四极杆（Q）飞行管（TOF）离子阱（TRAP）检测器：电子倍增器光电倍增管微通道板任意组装质谱仪9样品导入：离子原：质量分离器：检测器：任意组装质谱仪9二次离子质谱：由一定能量的一次离子（离子枪）打在样品靶上溅射产生出二次离子的质谱。如：FAB、MALDI等。适合于分析不易挥发、热不稳定的有机大分子。离子源样品质量分析器检测器一次离子二次离子10二次离子质谱：离子源样品质量分析器检测器一次离子二次离子10分析物质类型小分子物质：磁质谱、四极质谱、离子阱提供碎片信息：磁质谱（电子轰击源）、三级四极质谱、飞行时间质谱（PSD）、电喷雾串联质谱（Q-TOF）等大分子物质：生物质谱：基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）、液相色谱-电喷雾-串联质谱（CapLC-ESI-Q-TOF-MS）、液相色谱-离子阱质谱（MDLC-IonTrap）11分析物质类型11质谱仪基本指标分辨率：M/△M，>5000，给出元素组成灵敏度：S/N，>50:1，fmol准确度：error，10-3Da,<50ppm12质谱仪基本指标分辨率：M/△M，>5000，给出元素组成1213131414生物质谱的两种软电离技术

基质辅助激光解吸电离(Matrix-AssistedLaserDesorptionIonization,MALDI)电喷雾电离(Electro-SprayIonization,ESI)

15生物质谱的两种软电离技术基质辅助激光解吸电离15生物质谱技术的应用一、分子量测定

（蛋白酶切）+一级质谱二、蛋白质的氨基酸序列测定

蛋白酶切+二级（串联）质谱16生物质谱技术的应用16

KarasandHillenkamp,1998年提出：

AnalChem.,1998,60(20):2299-2301.基本原理：将分析物分散在基质(Matrix)分子中并形成共结晶,当用激光(337nm的氮激光)照射晶体时,基质分子吸收激光能量与样品解吸附，基质－样品之间发生电荷转移使样品分子电离。二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

MatrixAssistedLaserDesorptionIonizationTimeof

FlightMassSpectrometry，

MALDI-TOF-MS1、MALDI离子源17KarasandHillenkamp,1998年提出基质的作用：

吸收了激光的大部分能量并气化，同时将样品分子带入气相,样品分子只吸收少量激光能量，避免了分子化学键的断裂。基质在样品离子形成过程中充当了质子化或去质子化试剂，使样品分子带上正电荷或负电荷。18基质的作用：18基质简称中文名称英文名称波长SA芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)Sinapinicacid(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamicacid)

337nm355nmDHB龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)Gentisicacid(2,5-dihydroxybenzoicacid)CCAα-氰基-4-羟基肉桂酸α-cyano-4-hydroxycinnamicacidPA吡啶甲酸Picolinicacid3HPA3-羟基吡啶甲酸3-hydroxypicolinicacid常用基质（一些小分子有机酸及其衍生物，能很好吸收激光能量）19基质简称中文名称英文名称波长SA芥子酸Sinapinica-Cyano-4-hydroxycinnamicacidForPeptidesSinapinicacidForFulllengthProteins2,5-DihydroxybenzoicacidForPeptides显微镜下不同基质在靶体上形成的晶体20-Cyano-4-hydroxycinnamicaci

MALDI源激光是脉冲式，每一脉冲激光产生的一批离子得到一张质谱图，一般的质谱图是多次脉冲激光扫描质谱峰结果的累加。

MALDI源离子为单电荷离子，谱锋与样品组分质量数有一一对应关系，适合于多肽与蛋白质混合物分析，灵敏度高（fmol,10-15-amol,10-18

）。21MALDI源激光是脉冲式，每一脉冲激光产生的一批

高灵敏度，分析浓度至低fmol或高amolTOF分析器可分析大分子量的物质软电离方式，主要产生单电荷离子，谱图易解析

容忍盐浓度：phosphatebuffers<20mMTrisbuffer<50mMDetergents<0.1%SDS<0.01%反射式TOF具有高分辨率MALDI的优点22高灵敏度，分析浓度至低fmol或高amolMAL2、线性飞行时间质量检测器(liner-TOF)

由

E=U·z=1/2mv2

和

t=L/V

推出

t=const·m/v（飞行时间与质荷比的平方根成正比）E：离子在加速电场获得的动能;U：加速电场电压z：离子所带电荷;m：离子质量v：离子飞行速度;L：飞行管道长度t：离子飞行时间;const：常数质量分析范围：500Da---100KDa232、线性飞行时间质量检测器(liner-TOF)由3、反射飞行时间质量检测器(reflectronRE-TOF)

飞行管道内加了反射电场，(ionmirrororreflectron)，改进仪器的分辨率和质量测量准确度能量聚焦作用:具有相同质荷比但能量有细微差异的离子在反射电场作用下飞行时间达到一致，同时离子改变了飞行方向，延长了飞行距离源后衰变(post-sourcedecay,PSD)分析质量分析范围：800Da---10KDaDetector243、反射飞行时间质量检测器(reflectronRE-TO25252626PSD:post-sourcedecay

源后衰变分析

一种串联质谱，获得离子的结构信息。

MALDI源产生的母离子在飞行过程中发生裂解，丢失部分中性碎片，剩余的子离子成为亚稳离子（质量减少，飞行速度不变），飞行时间与离子质量成正比，与反射电场的电压成反比。27PSD:post-sourcedecay源后衰变分析24、样品制备

基质：CCA：α-氰基-4-羟基肉桂酸，用0.1%TCA,30-50%ACN配成饱和溶液，稀释1-3倍，每天新鲜配制。样品：溶于0.1%TCA

。

基质与样品1：1体积混合，取0.5-1ul加到样品靶上挥发干后送如仪器。284、样品制备28TargetLaserFlightTubeDetectorComputerSampleIonizationSeparationDetectionMALDI-TOF-MS仪器结构图29TargetLaserFlightTubeDetector基本原理：利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在N2气流的作用下，液滴溶剂蒸发，表面积缩小，表面电荷密度不断增加，直至液滴爆裂为带电的子液滴，这一过程不断重复使最终的液滴非常细小呈喷雾状，这时液滴表面的电场非常强大，使分析物离子化并以带单电荷或多电荷的离子的形式进入质量分析器。

三、液相色谱－电喷雾－串联质谱

(LC-ESI-MS/MS)1、电喷雾电离源

FennJ.B.etal,Science,1989,246(4926):64-7130基本原理：利用高电场使质谱进样端的毛细管柱流出的液滴带电，在

电喷雾电离源原理31电喷雾电离源原理312、四极杆质量分析器串联质谱：由离子源、多级质量分析器、碰撞室组成。

第一级起质量过滤作用，挑选出母离子（precursororparention）进入碰撞室，经碰撞诱导离解（collisioninduceddesorption,CID），产生碎片离子/子离子（productordaughterion）,由第二级分析子离子的质荷比。通过母离子和子离子的质量分析，可获得母离子的结构信息。322、四极杆质量分析器32多级质量分析器有：

三级四级杆质量分析器离子阱质量分析器四级杆TOF质量分析器33多级质量分析器有：33四级杆质量分析器34四级杆质量分析器34QuadrupoleGold-coatedglasscapillarydetector(multiplier)sprayopening:1-2mm++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++vacuumOrificesolventsN2accVChargeddropletsTaylorconesIons电喷雾-四极杆质谱(ESI-QuadrupoleMS)

35QuadrupoleGold-coatedglasscapQ-TOF分离器特点+灵敏度流通量分辨率样品需要量：0.5-1ul20-200fmol/ul36Q-TOF分离器特点+灵敏度流通量样品需要量：0.5-1ulESI-MS谱图（ESI-Q-TOFMS谱图）电喷雾电离产生多电荷峰，质谱图显示离子带不同电荷数的一系列质荷比峰[M+nH]n+，根据这些峰值换算出离子电荷和分子质量。检测范围大于质量扫描范围[M+12H]12+=714.7714.7×12－12＝8564.4[M+13H]13+=659.8659.8×13－13＝8564.437ESI-MS谱图（ESI-Q-TOFMS谱图）电喷雾电离产串联质谱(MS/MS)

由离子源、多级质量分析器、碰撞室组成。第一级质量分析器起质量过滤器的作用，从总离子谱中挑选出需进一步进行结构分析的母离子(precursororparention)进入碰撞室，母离子在碰撞室内经高流速惰性气体碰撞诱导离解(collisioninduceddesorption，CID)产生碎片离子/子离子(productordaughterion)，第二级质量分析器分析子离子的质荷比。研究母离子的裂解规律，获得母离子的结构信息。

38串联质谱(MS/MS)由离子源、多级质量分析器、碰撞室组四极杆-飞行时间质量分析器(Quadrupole-TimeofFlightanalyzer,Q-TOF)

四极杆分析器用于离子选择，其后有一个六极杆射频场用于离子的碰撞诱导解离产生子离子，母离子和子离子的检测均由最后的飞行时间检测器完成

39四极杆-飞行时间质量分析器四极杆分析器用于离子选择，其后有一abc母离子子离子谱—多肽氨基酸序列总离子流色谱图HPLCMS1MS240abc母离子子离子谱—多肽氨基酸序列总离子流色谱图HPLCM

与LC连接，分析混合物

极高的灵敏度

软电离方式基本不产生碎片离子

孔电压调节可以控制碎片离子的产生

使样品带多电荷，可以分析大分子量的物质ESI的特点与LC连接，分析混合物ESI的特点生物质谱与其他质谱的比较42生物质谱与其他质谱的比较42

价钱便宜MS/MSn多级碎片谱图与一般质谱不同，需要特殊分析离子阱质谱43离子阱质谱43TheIonTrapMassSpectrometer44TheIonTrapMassSpectrometerTheIonTrapPrinciple由三个双曲面电极（一个环型，2个斗笠型）围成一个离子捕集室，可进行串联分析。45TheIonTrapPrinciple由三个双曲面电极四、肽质量指纹谱

PeptideMassFingerprinting，PMF指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱。由于每种蛋白质的氨基酸序列(一级结构)都不同，蛋白质被酶水解后，产生的肽片段序列也各不相同，其肽混合物质量数亦具特征性，所以称为指纹谱，可用于蛋白质的鉴定。1993开始应用。46四、肽质量指纹谱

PeptideMassFi4747蛋白酶切点pH条件TrypsinLys(K)、Arg(R)羧基端pH7.5-9.0Glu-CAsp(D)、Glu(E)羧基端pH4.0Glu(E)羧基端pH7.8Asp-NAsp(D)氨基端pH7.0-8.0Arg-CArg(R)羧基端pH7.2-8.0Lys-CLys(K)羧基端pH8.5-8.8各种蛋白酶的切点及pH条件48蛋白酶切点pH条件TrypsinLys(K)、Arg(RMALDI-TOF-MS谱图质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系离子化效率高，是现今灵敏度最高的质谱仪(fmol～amol)质量分析范围：800Da---100KDa49MALDI-TOF-MS谱图质谱图中的谱峰与样品各组分的质量

Fe3+螯合IMAC亲和柱提取磷酸肽

AMLDI-TOF-MS结合金属离子亲和柱分析磷酸肽50Fe3+螯合IMAC亲和柱提取磷酸肽AMLDI-TOF-5151五、串联质谱数据鉴定蛋白质技术

1、原理

20种氨基酸：203，204，205…5-6个氨基酸序列片段已有很高的特异性，可鉴定蛋白质。碰撞解离后，肽链在酰氨键处断裂形成子离子：

a,b,c型：保留N端，电荷留在C端

x,y,z型：保留C端，电荷留在N端52五、串联质谱数据鉴定蛋白质技术52串联质谱鉴定蛋白质多肽串联质谱碎裂方式示意图

53串联质谱鉴定蛋白质多肽串联质谱碎裂535454多肽串联质谱图55多肽串联质谱图55abc母离子子离子谱—多肽氨基酸序列总离子流色谱图Data-dependentLC-ESI-Q-TOFMSMS56abc母离子子离子谱—多肽氨基酸序列总离子流色谱图Data-25gi|4502101annexinI;annexinI(lipocortinI);gi|999934AnnexinV(LipocortinV,EndonexinIi)gi|24119203tropomyosin3gi|136085Tropomyosinalpha3chaingi|13274400Tropomyosin4-anaplasticlymphomakinasefusiongi|133254HeterogeneousnuclearribonucleoproteinA1gi|14251209chlorideintracellularchannel1;p64CLCPgi|5031857lactatedehydrogenaseAgi|4502105annexinIVgi|20455281Syntenin1gi|5031599actinrelatedprotein2/3complexsubunit2gi|4140011ChainB,Mmp-3TIMP-1Complexgi|16306978annexinA2gi|7245523HumanSerumTransferrinLC-ESI-Q-TOFMSMS鉴定蛋白质混合物5725gi|4502101annexinI;annexin2、实例分析

核糖核酸酶B：

糖苷内切酶除糖，Glu-C酶切，在PMF中有一段m/z4792.23的肽段，与任何理论肽段质量数均不符，串联质谱分析测得部分序列为：TSAASSSNYCNQM,理论值与实测值相差203，恰好是一个N-乙酰氨基己糖的质量数，表明该片段连接有一个N-乙酰氨基己糖。582、实例分析58核糖核酸酶B的Glu-C酶切肽段m/z4792.23的串联质谱图

肽段理论序列：RQHMDSSTSAASSSNYCNQMMKSRNLTKDRCKPVNTFVHE

肽段理论质量：m/z：4589.1

肽段实测质量：m/z:4792.23

差值：203.13(N-乙酰氨基己糖)59核糖核酸酶B的Glu-C酶切肽段m/z4792.23的串联3、肽序列标签鉴定技术

PeptideSequenceTag,PST

读出的部分氨基酸序列结合前后离子质量和肽段母离子质量，在数据库中查找的方法。4、PSD检索鉴定5、18O标记从头测序技术

denovosequencing

标记y型离子。

603、肽序列标签鉴定技术60六、蛋白质检索鉴定工具和相关数据库61六、蛋白质检索鉴定工具61检索蛋白质序列数据库鉴定蛋白质通过蛋白质属性参数与蛋白质序列数据库之间相关分析的方法鉴定蛋白质鉴定的基础在于能够得到一些限制参数，利用这些参数可以从数据库中所有的序列中特异地识别与这些参数相关的序列这些参数包括：蛋白质的氨基酸组成、氨基酸序列、蛋白质和肽段的质量以及肽碎片的质量62检索蛋白质序列数据库鉴定蛋白质通过蛋白质属性参数与蛋白质序列肽质量指纹谱数据（PeptideMassFingerprinting，PMF）串联质谱数据源后衰变离子数据（PostSourceDecay，PSD-MALDI）电喷雾串联质谱数据（ESI-MS/MS，碎片离子质量列表，肽段部分序列）从质谱途径鉴定蛋白质需要从实验数据到氨基酸序列相关分析的辅助用于鉴定蛋白质的生物质谱数据63肽质量指纹谱数据用于鉴定蛋白质的生物质谱数据63鉴定数据库中已有序列的蛋白质的软件算法(algorithms)基于以下一些理念----以PMF为例肽段是由切点专一的试剂水解蛋白质产生的，通常用已知切点专一的蛋白酶。这些肽段的质量由MALDI-MS或ESI-MS精确测定。计算蛋白质序列数据库中的每一序列被实验中所用水解试剂水解后产生的理论肽段的质量。实验测得的肽质量值与数据库中的肽质量计算值进行相关性比较，将相关性最好的结果排序计算得分或排序值。64鉴定数据库中已有序列的蛋白质的软件算法(algorithms肽段串联质谱碎片离子质量数据(peaklist)检索计算数据库中每一个序列在给定的酶切条件下产生的肽段质量数。找出每一个与实验测得质量数一致的肽段，产生其理论碎片离子列表。实验测得的碎片离子质量数与理论碎片离子质量数计算值进行相关性比较。将匹配最好的结果排序，或仅列出有显著相关的结果(匹配的离子数目)。65肽段串联质谱碎片离子质量数据(peaklist)检索计算数蛋白质序列数据库OWL

isanon-redundantcompositeoffourpublicly-availableprimarysources:SWISS-PROT,PIR(1-3),GenBank(translation)andNRL-3D.NCBInr

isacomposite,non-redundantproteindatabasecompiledbyNCBIforusewiththeirsearchtoolsBLASTandEntrez.TheentrieshavebeencompiledfromGenBankCDStranslations,PIR,SWISS-PROT,PRF,andPDB.dbEST

isthedivisionofGenBankthatcontains"single-pass"cDNAsequences,orExpressedSequenceTags,fromanumberoforganisms.ThisisanucleicaciddatabasewhichistranslatedbyMascotinallsixreadingframes.66蛋白质序列数据库OWLisanon-redundantSWISS-PROTandTrEMBLSWISS-PROT

ahighlevelofannotations(suchasthedescriptionofthefunctionofaprotein,itsdomainsstructure,post-translationalmodifications,variants,etc),aminimallevelofredundancyandhighlevelofintegrationwithotherdatabasesTrEMBL

supplementofSWISS-PROT,containsallthetranslationsofEMBLnucleotidesequenceentriesnotyetintegratedinSWISS-PROT.67SWISS-PROTandTrEMBLSWISS-PRO6868PeptIdentSearchingForm

69PeptIdentSearchingForm69PMFSearching70PMFSearching70PeptIdentSearchingResult

71PeptIdentSearchingResult717272肽序列标签检索鉴定73肽序列标签检索鉴定737474SequenceTag:(1188.65)

EVT(1517.82)75SequenceTag:757676MASCOTPMF77MASCOTPMF77MASCOTMSMS78MASCOTMSMS78Mascot网站查寻结果79Mascot网站查寻结果7980808181Mascot网站查寻结果82Mascot网站查寻结果82源后衰变(PSD)检索83源后衰变(PSD)检索83Mascot网站查寻结果84Mascot网站查寻结果84高通量M@LDI质谱仪自动化操作面板85高通量M@LDI质谱仪自动化操作面板85M@LDI自动处理结果示意86M@LDI自动处理结果示意86规模化蛋白质组研究技术平台的构建87规模化蛋白质组研究技术平台的构建87蛋白质组研究——“生物经济时代”的必然产物

坚实的生物学研究基础

高通量的现代仪器分析技术平台

大规模的计算机处理系统

海量数据的宏观整合能力先进的技术平台支撑——大科学计划不可缺少的资本88蛋白质组研究——“生物经济时代”的必然产物坚实的生物学研国际蛋白质组研究技术平台发展——引进规模化、高通量蛋白质组研究技术平台血浆蛋白质组：

100台HPLC+50台IonTrap新近购买：10台Bioflex,5台4700TOF/TOF技术和约——与新技术制造商签定技术平台和约——最大限度地发掘人类蛋白质资源89国际蛋白质组研究技术平台发展——引进规模化、高通量蛋白质组研鉴定1000点——累计5000高丰度蛋白点，产出量20%现有技术平台一年工作量鉴定点的增多

蛋白丰度下降

产率下降

周期延长阻滞科研项目进展（2003年9月“第二届国际HUPO大会”——3000点）90鉴定1000点——现有技术平台一年工作量鉴定点平行的2D-Gel为分离基础的技术平台

MD-HPLC为分离基础的技术平台必须构建并行的蛋白质组研究技术平台91平行的2D-Gel为分离基础的技术平台必须构建并行的蛋白机械化技术平台的优势：

提高流程速率，操作过程标准化最大程度地去除操作者带来的个体误差消除人生物钟耗时两条2D-gel生产线的平行配制的必要性：

相同样品的平行处理便于进行实验数据的比对及互补两条生产线的同时运转保证实验的连续性，某一平台的斩时性故障不会导致样品的损失92机械化技术平台的优势：92通量技术平台引进计划

完善BioRad-Micromass

2D-Gel技术