基于宏基因组和宏转录组的发酵食品微生物研究进展

基于宏基因组和宏转录组的发酵食品微生物争论进展基于宏基因组和宏转录组的发酵食品微生物争论进展12-24导读微生物的陈代谢在发酵食品的色、香、味、态等特征及食品安全等方面发挥着重要作用。但是由于发酵食品中微生物种类繁多、群落演替变化简单、代谢通路多样、功能基因丰富多变，迄今为止很多传统发酵食品中微生物群落构造特征、演替变化规律和功能基因的奉献照旧是谜团，科学争论和工业生产都急需揭开这层奇特的面纱。传统发酵食品种类繁多，如发酵乳制品、发酵谷物类〔酒、醋〕、发酵蔬菜〔泡菜〕、发酵豆制品〔豆豉、酱油、腐乳〕、发酵植物根或块茎、发酵肉制品〔火腿〕、发酵海产品等。在发酵过程中，原料中的糖类、脂类、蛋白质等养分物质在各种微生物的参与下，降解为小分子的单糖、脂肪酸、氨基酸并与微生物代谢产物一起打算着最终产品的品质风味、安全性、稳定性等特征。但是，由于发酵过程中微生物体系简单，其中包括大量的益生菌和局部有害微生物，如某些杂菌的参与会产生有害代谢产物如生物胺等。为了保证发酵食品安全、提高品质、削减有害物质的产生，必需了解发酵过程中的微生物群落构成、群落演替以及各种微生物的代谢特性和它们对产品品质的影响，从而使发酵过程可控化、现代化，进而提升发酵产品品质、保障产品安全。但因参与发酵的微生物的种类繁多、相互作用关系简单，全面解析发酵食品中微生物群落构造及其种群演替变化规律照旧极具挑战。随着分子生物学技术的快速进展，发酵食品微生物群落构造争论已不再完全依靠于传统的微生物分别培育技术。测序技术不断更、测序费用大大降低、测序通量急速扩大，从而可以对群落中全部微生物的DNA或RNA进展直接测序来分析微生物种群组成、分布及其动态演替。近年来，16SrRNA基因及真菌rRNA基因间隔区ITS(internaltranscribedspacer)区域高通量测序的微生物多样性分析，不仅省去了传统分别培育法的繁琐，而且为大量不行培育微生物的争论供给了契机，使得在传统发酵食品微生物多样性争论中有了很多的觉察，成为发酵食品微生物争论的主要方法之一。但是，由于方法本身的局限，基于rRNA基因片段或ITS区域高通量测序的微生物多样性分析一方面只能依靠于基因库中基因序列做出推断，另一方面由于核糖体RNA基因片段的保守性较高，很多未知微生物往往只能鉴定到所在属，因而只能在门、纲、目、科、属这些级别进展微生物群落进化和种属亲缘关系分析；同时由于缺乏功能基因的具体信息，使进一步深入争论面临瓶颈。相比之下，基因组、宏基因组测序以及转录组、宏转录组测序技术在肯定程度上弥补了这些缺陷，使得人们可以更系统深入地争论微生物群落构造及其功能基因，全面分析其组成、变化规律、亲缘进化并挖掘出潜力丰富的功能基因，从而得以进一步揭开发酵食品微生物群落的奇特面纱。1宏基因组与宏转录组宏基因组宏基因组〔Metagenome〕一词由JoHandelsman 等于1998年争论土壤微生物群落时首次提出。宏基因组技术通过收集环境样品，提取样品微生物〔包括全部的可培育与不行培育微生物〕的总 DNA，构建宏基因组文库，从基因组文库中筛选功能基因或直接进展高通量测序分析，来争论群落中物种多样性及挖掘功能基因。早期的宏基因组争论以从基因组文库中筛选获得功能基由于主要策略，随着高通量测序技术、生物信息学工具以及大数据分析平台的日渐进展，主要基于测序的宏基因组广泛应用在微生物群落争论中，成为空气、土壤、水、植物以及人体〔例如皮肤、消化道〕等微生物群落争论的强有力工具。例如争论动物性膳食与植物性膳食对人肠道微生物群落快速和可重复性的影响，提醒了动物性膳食引发肠道炎症疾病的机制。借由宏基因组，大量不行培育微生物得以被发现、的功能基因或基因簇得以被认知，极大地促进了对微生物群落组成、演替及其互作的生疏，同时对于开发具有应用潜力的基因也具有重要意义。近年来宏基因组开头应用于食品微生物的争论，但是，目前大量文献报道是基于扩增rRNA基因测序进展的生物多样性分析，而本文则主要侧重于rRNA基因测序之外的宏基因组和宏转录组分析报道。其次代测序技术依托的高通量测序平台，包括 Illumina公司的SolexaGenomaAnalyzer 测序平台、罗氏公司的454GSFlX测序平台和ABI公司的SOLiD测序平台。这些测序平台可以实现对 DNA的高通量快速测序，极大地便利了对某一物种基因组的深度测序，也便利了对微生物群落中全部DNA的分析。基于这些测序平台，宏基因组既可以分析环境中特定基因，基于序列筛选或基于功能筛选分析某种功能基因，并进一步对筛选到的基因进展深度测序；又可以针对环境群落中全部的 DNA进展深度测序，分析该群落中微生物的组成、演替及特定功能基因。但是，宏基因组的局限在于不能提醒特定的时空条件下微生物群落基因的动态表达与调控等问题，这局部的争论有赖于宏转录组。宏转录组基于RNA数据分析的转录组学，主要用来提醒特定生理阶段或胁迫下，基因的动态表达与调控以及胁迫响应，分析差异表达基因。宏转录组〔metatranscriptome〕是指在某个特定条件或特定时空，群落中全部微生物基因转录本的总和，可用于原位衡量微生物群落宏基因组的表达水平，筛选出高表达活性功能基因和微生物。它以微生物群落的总 RNA为争论对象，提取样品总RNA，将mRNA反转录为cDNA，进而对cDNA分析来反映特定时空下基因的表达状况。早期转录组争论主要运用微阵列芯片技术，但是设计和构建微阵列芯片费用高而且费时，还不能检测到设计模板之外的基因的表达水平。而测序技术较好地解决了这一困境，它针对转录产物mRNA进展高通量测序，可全面快速地猎取特定样品在某一特定状态下的完整表达信息，普遍应用于差异表达基因分析、功能基因挖掘、低丰度转录本的觉察、转录图谱绘制、可变剪接推测等各个方面。近年来基于测序的宏转录组学在各种环境和人体微生物群落争论中得到广泛应用，不仅可以鉴定群落中微生物基因表达水平，比较不同微生物转录表达谱，进而了解群落的演替变化；还可以分析群落中微生物的胁迫响应、争论优势菌群的代谢途径和筛选特定功能的基因。例如，关联人体消化道微生物群落的宏基因组与宏转录组数据，觉察虽然有局部口腔优势微生物存在消化道末端，但它们的转录活性很低；不同的个体间， 的消化道微生物转录本不受其基因组丰度影响，而转录受影响包括表达下调的孢子形成和氨基酸合成通路、以及表达上调的核糖体合成和甲烷生成通路。又如Jiang等应用宏转录组分析了来自小鼠大肠、奶牛瘤胃、泡菜、深海热井和冻土的微生物群落，确定了参与氨基酸、能量、核苷酸代谢的592种核心酶的表达，同时也鉴定了微生物的特定代谢途径，如磷酸代谢途径和多聚糖降解途径等。近年来，宏转录组开头应用于发酵食品，用于探究各种微生物在发酵过程中的代谢途径、提醒它们特定的功能和对风味的奉献。2宏基因组与宏转录组在发酵食品微生物群落争论中的应用奶酪奶酪是一种重要的发酵乳制品，世界各地有多种风味独特的奶酪成品。奶酪的微生物群落是由各种细菌、酵母菌和霉菌等组成，它们相互作用，经一系列生化反响从而形成奶酪独特的感官性能和风味。 Wolfe等人应用宏基因组提醒了三类〔natural,bloomy,washedrind 〕共137种不同奶酪表皮的微生物群落构造及其在发酵中的功能。他们从中分别培育出24株优势菌株，包括细菌和真菌，并争论了它们之间的相互作用。首次如此多种类的奶酪微生物被同时争论并提醒出微生物的特别功能，例如产甲硫氨酸γ-裂解酶〔一种参与奶酪表皮硫化物形成的酶〕的菌株。作者通过原位和体外重构重现了奶酪发酵的过程，供给了一种简洁的模型来争论奶酪发酵过程中真菌和细菌间的作用机制。Almeida等则是对从奶酪制品中分别出的142株细菌，分属于137个不同的种和67个属，进行了大规模的基因组和宏基因组测序。通过大规模测序，他们获得了 117个基因组草图，使奶酪中细菌的基因组序列增加了一倍，并建立了一个奶酪细菌功能基因组数据库。他们还依据测序建立的基因组数据库，分析了不同传统奶酪外表上存在的微生物群落构造，观看到一些微生物物种的大量存在，说明一些微生物如静止嗜冷杆菌(Psychrobacterimmobilis)和假单胞菌〔Pseudoalteromonashaloplanktis〕虽然最初并没有接种，实际上却是发酵过程中的优势菌种。 Escobar-Zepeda等利用宏基因组学提醒了cotija奶酪中独特的微生物群落组成。Cotija奶酪在墨西哥当地独特的地理环境中自然发酵成熟，其独特的感官特性及其安全性由微生物及其代谢产物共同形成。通过高通量测序提醒了微生物的多样性、优势菌群以及代谢潜力，结果说明乳杆菌、明串珠菌和魏斯菌属是3个主要的优势菌群，另外还有属于31个门的500多种细菌和古细菌；致病菌如沙门氏菌、单增李斯特菌、布鲁氏杆菌、分支杆菌均未觉察。结果提示Cotija奶酪与多种风味形成有关的微生物代谢主要涉及支链氨基酸和游离脂肪酸的代谢，同时与细菌素的产生和免疫相关的基因也被觉察。这些宏基因组的觉察可以解释微生物群落在发酵奶酪感官特性及安全性中的作用，同时也供给了查找的酶应用于生物技术的可能。目前奶酪表皮微生物群落的参考基因组序列较为丰富，为宏转录组分析奶酪成熟过程中表皮微生物群落供给了更大的可能性，也持续成为争论的热点。Monnet等应用宏转录组分析探究奶酪表皮的微生物活动。这款Reblochon奶酪是由两种乳酸菌〔Streptococcusthermophiles和Lactobacillusdelbrueckiissp.bulgaricus〕、一种陈化细菌〔Brevibacteriumaurantiacum〕和两种酵母〔Debaryomyceshansenii和Geotrichumcandidum〕参与发酵而成熟。从第5、14、19和35天的奶酪表皮提取RNA测序显示除B.aurantiacum转录本读数极低外，其他菌种均有检测到。宏转录组数据显示，从第 5天到第35天G.candidum是最活泼的，而乳酸菌的转录水平只发生了稍微的变化。作者比较了两株酵母参与乳糖、半乳糖、乳酸、氨基酸以及游离脂肪酸分解代谢相关基因的表达水平，结果显示在成熟过程中氨同化相关基因和半乳糖代谢相关基因下调；在G.Candidum的转录组数据中，参与氨基酸代谢的基因在14到35天上调，而在D.Hansenii中上调主要发生在第35天，这说明D.Hansenii比G.Candidum晚参与氨基酸的代谢。此外，在第35天涉及电子传递链的基因表达普遍下调，提示成熟后期较低的细胞活性。DeFilippis等应用宏转录组学分析了不同温度和湿度条件下意大利奶酪成熟过程中微生物群落的演替和相关基因的表达。结果显示，提高奶酪成熟温度会促进蛋白质水解、氨基酸和脂类分解代谢相关基因的表达，并显著加速奶酪的成熟速率。此外温度提升导致的微生物代谢途径变化与奶酪中蛋白质和挥发性有机物的代谢谱变化全都；在奶酪成熟过程中表皮中糖代谢〔磷酸戊糖途径和糖酵解〕和细胞分裂相关的转录本丰度较高，而在奶酪中心氨基酸和脂类代谢显著上调。这些宏转录组结果对工业生产中通过合理调控温度来调整微生物的代谢从而优化生产效率提高产品质量具有重要指导意义。随着组学技术的成熟和本钱的降低，争论者们正试图多种组学数据结合分析来更好地提醒发酵过程中微生物的功能及其相互作用机制，以期获得突破性的争论成果。如Dugat-Bony等人应用宏基因组、宏转录组和生化分析，争论9种微生物组成的奶酪表皮在为期四周的成熟过程中的变化。在发酵早期Lactococcuslactis和Kluyveromyceslactis快速消耗乳糖产生大量乳酸，随后乳酸被D.hansenii和G.candidum利用，由于检测到高水平的乳酸脱氢酶转录本。对于蛋白质和脂肪的代谢，大多数的RNA测序片段匹配到G.candidum的基因，这说明G.candidum与酪氨酸和脂肪降解亲热相关。在成熟末期，测序数据说明与氨基酸降解相关的转录根源于G.Candidum和对酸敏感的C.casei和H.Alvei，这与它们在后期奶酪表皮的生长相对应。结合不同的数据分析，他们获得了奶酪的成熟过程中各种微生物的代谢产物及其可能的相互作用机制；此外，用差异表达分析选择出的一组生物标志物基因，为监控奶酪制作过程供给了有价值的工具。发酵蔬菜作为一种传统的发酵蔬菜产品，泡菜发酵过程中微生物种类简单，近年来宏基因组、宏转录组已应用于泡菜发酵过程中微生物群落的争论。Jung等争论泡菜29天发酵过程的宏基因组，其中源自宏基因组的 16SrRNA基因数据构建的系统发育树分析说明泡菜中优势菌属为明串珠菌属(Leuconostoc)、乳杆菌属〔Lactobacillus〕和魏斯氏菌属〔Weissella〕。在基因功能注释方面，承受宏基因组快速注释技术，揭示了一系列碳水化合物异养乳酸发酵的相关基因，这与检测到发酵产物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯、乙醇等相吻合。将宏基因组序列与不同菌属微生物基因组序列比较觉察，大局部的宏基因组序列数据与 Leuconostocmesenteroides和Lactobacillussakei的基因序列具有高度相像性，说明泡菜发酵过程中这两种菌很可能发挥了重要作用。宏基因组数据中，令人惊异的是还觉察了大量噬菌体 DNA序列，这说明泡菜发酵过程中很多细菌受到了噬菌体感染。这些结果不仅深入提醒泡菜发酵微生物的功能，也提醒了简单的微生物群落对发酵过程的影响。宏转录组学在泡菜发酵微生物争论中亦有应用，如 Jung等进而承受测序争论泡菜中六种主要微生物在发酵过程中的宏转录组基因表达图谱。在为期29天的发酵过程中从五个时间点的取样中提取的总 RNA有97.7%的基因序列与GenBank中的6属主要微生物全都。争论结果说明，在前期发酵过程中Leuconostoc(Lc.)Mesenteroides是最活泼菌株，而在以后的过程中Lactobacillus(Lb.)sakei和Weissella(W.)Koreensis基因呈高表达；在第25天时Lb.Sakei的表达急剧下降，可能与乳酸杆菌噬菌体感染有关。大量与碳水化合物运输、水解及乳酸发酵相关的基因表达活泼，呈现出典型的异养乳酸发酵。全部的明串珠菌属都含有甘露醇脱氢酶编码基因〔mannitoldehydrogenase，mdh〕，尤其是Lc.Mesenteroides，它具有3个mdh拷贝，2个在染色体，1个在质粒，它们具有不同的表达模式。这些结果有助于人们更好地生疏各种微生物在泡菜发酵过程中发挥的重要作用。中国各地有丰富多样的传统发酵蔬菜，近年来的争论报道有不少基于rRNA基因片段或ITS区测序的微生物多样性分析。如佟婷婷等觉察四川老坛泡菜发酵中魏斯氏菌属是启动菌，关键菌是乳杆菌属，同时还有乳球菌属、片球菌属和明串珠菌属等；Chen等报道甘肃浆水菜除了乳酸菌外，还有子囊菌和担子菌等真菌；Wu等在东北酸菜特别风味形成中觉察有乳杆菌属、明串菌属、芽孢杆菌、假单胞菌、酵母、念珠菌、展青霉菌等。将来借助宏基因组和宏转录组的深入争论将有利于我们对中国传统发酵蔬菜更多的了解和进一步的开发利用。发酵普洱普洱熟茶属典型的发酵茶，它区分于普洱生茶是在于经“渥堆”工艺制作而成。“渥堆”是多种微生物参与的以茶叶为基质的固态发酵过程，参与发酵的微生物种群构造对普洱熟茶的品质发挥着至关重要的作用。除了有不少基于分别培育或基于rRNA基因测序的“渥堆”过程微生物多样性的报道觉察黑曲霉等优势菌株，Lyu等首次应用宏基因组测序争论了普洱茶渥堆发酵过程中微生物的群落构造，结果显示为三个优势的细菌门〔变形菌门、放线菌门和厚壁菌门〕和一个处于主导地位的真菌门即子囊菌门；功能基因注释说明与萜类及酮类化合物的代谢以及其他次生代谢产物的合成相关的69种酶基因分布于16个代谢途径中。这些宏基因组数据说明普洱茶发酵的主要微生物包含细菌和酵母，功能基因的挖掘和代谢途径的分析有利于在分子水平上对普洱茶发酵机理的进一步争论。姜姝等对普洱茶发酵前期和中期的样本提取微生物菌群总 mRNA，进展了宏转录组比照分析。测序结果注释说明黑曲霉〔 Aspergillusniger〕在发酵前期和中期两个阶段都占有确定优势；对两个样本差异表达局部GO功能和KEGG通路的比照分析说明，适应渥堆发酵环境变化的微生物(如黑曲霉等)对普洱茶发酵过程起到了打算性的作用。发酵可可豆可可豆是生产巧克力的重要原材料，采收后的可可豆经发酵、枯燥和焙烤形成巧克力特有的风味和口感，其中发酵阶段主要是酵母菌、乳酸菌、醋酸菌参与的将糖转化为酸的一系列生化过程。近年来已有承受宏基因组学对可可豆发酵过程中微生物群落构造及功能的争论， Illeghems等于2023年首次报导了基于宏基因组学数据的可可豆发酵过程中微生物群落分析，相对于仅依靠于个别基因序列的分析，宏基因组数据提醒了更丰富的微生物多样性。此次觉察的细菌和真菌的种类比之前要多，优势菌株包括Hanseniasporauvarum,Hanseniasporaopuntiae,Saccharomycescerevisiae,Lactobacillusfermentum,和Acetobacterpasteurianus；病毒主要是Myoviridae和Siphoviridae，且乳杆菌是它们的主要宿主。随后Illeghems等基于宏基因组数据构建的多通路分析拓展了人们对可可豆发酵过程中主要微生物功能特性的认知，提醒了群落微生物间的代谢通路的分布。其中与乳酸菌代谢关系最亲热的是乳酸发酵和柠檬酸同化途径；而肠杆菌〔Enterobacteriaceae〕通过混合酸发酵和丙酮醛解毒途径参与底物转化，此外，肠杆菌还有降解果胶和同化柠檬酸的潜在功能。基于宏基因组数据重构了醋酸菌的局部代谢途径，尤其是胁迫应激响应，在酸胁迫下醋酸菌细胞内乙醇同化和乙酸过氧化通路活泼使得醋酸菌得以连续生存。还觉察了与细菌素生产相关的基因。Illeghems所在StefanWeckx带着的团队还间续对可可豆发酵过程中分别到的特定菌株，如 Acetobacterpasteurianus386B，Lactobacillusfermentum222、Lactobacillusplantarum80，Acetobacterghanensis、Acetobactersenegalensis等进展基因组和功能比较基因组的分析。这些争论深入剖析了可可豆发酵过程中微生物群落构造以及多种优势微生物的基因组和代谢途径特性，为今后可可豆发酵选取更优的发酵菌剂供给了有效的依据。其他宏基因组和宏转录组还应用在其它多种发酵食品争论中，如酱油和酒类等。酱油是亚洲食品中的一种重要的酿造调味品，其质量取决于发酵过程中微生物的种群构造及相互代谢调控。传统酱油的深厚风味依靠于自然微生物发酵，而非大规模工业生产中使用的特定发酵菌剂，因而明确传统酱油生产过程中微生物的种类及其群落演替和代谢机理对于中国传统酿造酱油工业的进展具有重要意义。在对酱油卤水发酵过程中微生物的演替及其功能的争论中，Sulaiman等运用宏基因组学对为期6个月的发酵卤水中微生物种群构造变化和功能做了争论。结果显示，发酵卤水是以魏斯菌属Weissella为主，后期的优势真菌为念珠菌属 Candida；通过宏基因组序列的代谢重建，提醒了蛋白质和碳水化合物异养发酵的特征，与检测到乙醇和pH下降相符。这是第一个通过宏基因组对传统酱油发酵过程的微生物演替和功能做的争论。在印度米酒酒曲〔Xaj-pitha〕的争论中，Bora等首次应用宏基因组学提醒了更为全面的微生物群落特征，包括产淀粉酶菌株如根霉、毛霉和曲霉；产乙醇菌株如 Meyerozymaguilliermondii,Wickerhamomycesciferrii,Saccharomycescerevisiae,等；细菌主要是各种乳酸菌。但对于所获宏基因组数据，作者仅报道了分类学争论局部的结果，功能基因组分析和代谢途径的重构仍未见报道。目前，对传统酿造酱油、酒类和醋的深入争论主要包括有应用代谢组学争论其发酵过程中风味物质形成与变化以及对优势菌株的基因组和比较基因组争论，而发酵过程中微生物种群争论中大多承受 rRNA基因片段测序的生物多样性分析，承受宏基因组或宏转录组系统争论发酵过程中微生物群落构造演替和功能基因的报道还很少。如整合代谢组与微生物多样性分析对镇江香醋、山西陈醋等食醋的争论；