植物生理学11第十章-植物对生物和非生物胁迫的反应课件

第十章植物对生物和非生物胁迫的反应第十章植物对生物和非生物胁迫的反应1YieldLossesFromBioticandabioticStresses

YieldLossesFromBioticanda2非生物胁迫（abioticstress)

：由过度或不足的物理或化学条件引发的对植物生长、发育或繁殖产生不利影响。胁迫可以引发植物从调节基因表达和细胞代谢到生长速率和产量变化等一系列反应。Introduction非生物胁迫（abioticstress)：由过度或不足的3植物抗胁迫的机制避逆性(stressavoidance):防止接触胁迫。抗逆性

(stresstolerance)：植物可以抵抗胁迫。Introduction植物抗胁迫的机制Introduction4非生物胁迫通常引起植物基因表达模式发生改变

Introduction

胁迫是可以接受和识别的环境信号；植物识别逆境信号后，该信号就在细胞之间和整株植物中传递；逆境信号的传递通常会导致细胞水平上的基因表达发生变化；它又接着影响到整株植物的代谢和发育。非生物胁迫通常引起植物基因表达模式发生改变Introduct51缺水胁迫

水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生产的一个全球性问题,全球20%的耕地受到盐害威胁,43%的耕地为干旱、半干旱地区。

引起植物缺水的环境条件干旱盐渍低温1缺水胁迫水资源短缺以及土壤盐渍化是目前制约农业生6DroughtStressDroughtstresstreateduntreatedDroughtStressDroughtstresst7

SaltstressAvarietyofsorghum,sensitivetosalinity,growinginsandcultureandwateredwithanutrientsolutioncontainingincreasingconcentrationsofsodiumchloride.Alltheplantshavegrownforthesamelengthoftime.SaltstressAvarietyofsor81.1渗透保护物质在抗旱耐盐中作用渗透调节（osmoticadjustment)指耐旱植物可以调节它们的溶质势以抵消暂时或长期的水分胁迫，是植物细胞中溶质颗粒数目净增加的结果。渗透调节在帮助植物顺应干旱或盐性环境中起到关键作用。1.1渗透保护物质在抗旱耐盐中作用渗透调节（osmotic9渗透保护物质(Osmoprotectant)为可混溶溶质，许多植物在水分胁迫条件下会积累小分子相溶性溶质或渗压剂，有效地提高植物的渗透调节能力、增强植物的抗逆性。可混溶溶质（compatiblesolute)是一小类化学性质各异的有机化合物，它们都具有高度可溶，而且在高浓度下也不影响细胞代谢。

二甲基磺基丙酸甜菜碱胆碱-磺酸松醇甘露醇脯氨酸

重要的渗透保护物质：

脯氨酸、甘氨酸甜菜碱、甘露醇、松醇渗透保护物质(Osmoprotectant)为可混溶溶质，许10渗透保护物质的生物合成脯氨酸合成关键酶P5CS

吡咯啉-5-羧酸合成酶P5CR

吡咯琳-5-羧酸还原酶L-谷氨酸L-鸟氨酸渗透保护物质的生物合成脯氨酸合成关键酶L-谷氨酸L-鸟氨酸11甘氨酸甜菜碱胆碱甘氨酸甜菜碱合成关键酶胆碱单加氧酶(Cholinemonooxygenase,CMO)甜菜醛脱氢酶(Betainaldehydedehydragenase,BADH)甘氨酸甜菜碱胆碱甘氨酸甜菜碱合成关键酶12甘露醇（mannitol)生物合成途径1-磷酸甘露醇脱氢酶（E.coli)使6-磷酸果糖转化为1-磷酸甘露醇，表达该酶基因的转基因植物可以积累甘露醇，提高耐盐性。甘露醇（mannitol)生物合成途径13松醇是一种环状的糖醇，是松科、豆科和竹科植物中的主要溶质，对盐胁迫做出反应。松醇是一种环状的糖醇，是松科、豆科和竹科植物中的主要溶质，对141.2缺水和盐分对跨膜运转的影响干旱和盐分胁迫都要求植物顺应低水势，对细胞内离子浓度、组分、及其分布的调控是渗透胁迫抗性的基本特征。Na+/H+反向运转蛋白（Na+/H+

antiporter)位于质膜和液泡膜上的Na+/H+反向运转蛋白在植物耐盐机制中起重要作用

水通道蛋白（aquaporin)

水通道蛋白可使质膜和液泡膜对水的通透性增加，通过水通道蛋白可以迅速调控细胞的水分流动。植物可以通过调控水通道蛋白等膜蛋白以加强细胞与环境的信息交流和物质交换,增强抗旱、耐盐能力。1.2缺水和盐分对跨膜运转的影响干旱和盐分胁迫都要求植物15拟南芥Na+/H+反向运转蛋白基因:AtNHX1SOS1

(saltoverlysensitive)

植物生理学1116SaltStressandtheSOSPathwayRegulationofNa+homeostasisbytheSOSpathwayinArabidopsis

SaltStressandtheSOSPathwa17植物水通道蛋白主要膜内蛋白(MIP)液泡膜内蛋白（TIP）质膜内蛋白（PIP）松叶菊根中MIP基因表达植物水通道蛋白松叶菊根中MIP基因表达181.3水分胁迫诱导的LEA基因LEA蛋白（lateembryogenesisabundantprotein)在种子发育后期和受到水分胁迫的植物营养组织中积累。LEA蛋白是一种脱水保护剂,能够在水分胁迫下保护生物大分子。LEA蛋白分为5组，其中第3组LEA基因转化水稻可以提高抗旱耐盐能力。

1.3水分胁迫诱导的LEA基因LEA蛋白（lateemb19植物生理学11201.4ABA调控水分胁迫诱导基因的表达某些水分胁迫诱导基因受ABA调控，这些基因的启动子中存在ABA应答元件(ABRE)和偶联元件（CE),一起控制ABA应答基因的表达。1.4ABA调控水分胁迫诱导基因的表达某些水分胁迫诱导基因21DroughtandAbscisicAcidSignalingSelf-regulationandosmoticstressregulationofABAbiosynthesis

DroughtandAbscisicAcidSign222低温胁迫低温胁迫包括冷胁迫(chilling/coldstress)和冰冻胁迫(freezingstress)。冰点以上低温对植物的危害叫做冷害。冷害使植物膜透性增加，膜相由液晶态变为凝胶态，原生质流动减慢，代谢紊乱。冰点以下低温对植物的危害叫做冻害。冻害主要是冰晶的伤害，结冰会引起细胞质过度脱水，蛋白质空间结构破坏而使植物受害。2低温胁迫低温胁迫包括冷胁迫(chilling/cold23通过低温训化（coldacclimation)措施可提高植物的抗寒性。通过低温训化（coldacclimation)措施可提高植242.1冰冻胁迫(freezingstress)冰冻对细胞水分有显著的影响。细胞壁结冰时，细胞内的水分外流到胞外的冰上，致使细胞内缺水。植物抗冻机制

1）促进细胞外冰的形成，从而阻止细胞质中形成有破坏作用的冰晶；

2）通过使膜脂不饱和度等增加膜稳定性；3）抗冻蛋白在质外体中积累，以减缓结冰，延缓细胞脱水。2.1冰冻胁迫(freezingstress)冰冻对细胞25植物抗冻蛋白（Antifreezeproteins，AFP)DiagramofthepublishedcDNAsofplantantifreezeproteins植物抗冻蛋白（Antifreezeproteins，AF26植物生理学1127AFP的本质冬黑麦、小麦和大麦AFP有些是病程相关蛋白（PR):包括-1.3葡聚糖酶、几丁质酶和甜蛋白；所以认为具有抗冻和抗病双重功能。AFP的作用

AFP形成寡聚复合体，其表面与冰相互作用，有效抑制冰晶生长和在结晶。AFP的本质282.1低温胁迫的信号传导低温诱导一系列基因的表达，这些基因的表达产物可以帮助植物提高对冰冻胁迫的适应能力。许多低温调节蛋白（cold-regulatedprotein,COR)也可以被ABA或干旱单独诱导合成。这些蛋白包括第2组和第5组LEA蛋白及其它低温诱导蛋白。很多低温调节基因启动子中包含有DRE,其转录因子为CBF1.2.1低温胁迫的信号传导低温诱导一系列基因的表达，这些基因29ColdStressSignalingandToleranceCold-activatedtranscriptionalcascadeinArabidopsis.SNOWisapartnerproteinofICE1DRE（DEHYDRATIONRESPONSIVEELEMENT)/C-repeat(CRT),whichhasthecoresequenceCCGAC.CRT-bindingfactors(CBFs)orDRE-BINDINGFACTORS(DREBs)ColdStressSignalingandTole30HeatShockProteins在高于正常生长温度10～15℃以上的温度即热激(heatshock,HS)下,生物体大部分正常蛋白质的合成和mRNA的转录被抑制,同时迅速合成一些新的蛋白质称之为热激蛋白(heatshockproteins,HSPs),这种现象叫做热激反应(heatshockresponse,HSR)。HeatShockProteins在高于正常生31HeatShockResponse从细菌到人,所有生物都可对热激产生反应,而且除温度外,其它许多因子例如氨基酸类似物、高盐浓度、厌氧、水分胁迫、低温、重金属离子、亚砷酸盐、乙醇、营养饥饿、2,4-D、ABA等都可以诱导热激反应,合成的HSPs参与生物的许多代谢过程。HeatShockResponse从细菌到人32

HSPs的分类

HSP110sHSP90sHSP70sHSP60ssHSPs(smallHSPs),分子量在15～42

kD之间的LMWHSPs

HSPs的分类

HSP110s33热激蛋白定位热激蛋白定位于细胞的多种细胞器,包括细胞质、叶绿体、线粒体和内膜系统热激蛋白定位34HeatShockCognateProtein除热激外,正常生活的细胞中也有HSPs,这类HSPs是组成型表达的,称为HSC(heatshockcognateprotein)。HSC和诱导型HSP在结构和功能上都很难区分,统称HSP。HeatShockCognateProtein除35热激反应的特点热激反应的特点361）HSPs的保守性

亲缘关系很远的原核生物和真核生物的同种HSP的同源性很高。真核生物HSP70s和大肠杆菌的HSP70即DnaK蛋白的同源性大于65%。1）HSPs的保守性

亲缘关系很远的原核生物和真核生物的37不同物种相同细胞器之间的同源性比同一物种不同细胞器之间的同源性高。

玉米、矮牵牛、拟南芥、大豆、豌豆、绿藻等细胞质HSP70氨基酸的同源性达75.0%,但和番茄定位于内质网的HSP70比较,则同源性只有54.9%。不同物种相同细胞器之间的同源性比同一物种不同细胞器之间的同源38同种植物不同类型的HSPs的同源性较低

如豌豆HSP18.1、HSP17.7、HSP22.7和HSP21分别属于不同类型,它们之间的同源性低于50%。同种植物不同类型的HSPs的同源性较低39植物生理学1140植物生理学1141植物生理学1142SequencealignmentofthesignaturesequenceIpresentinN-terminalportionofplantHsp100.

At-A.thaliana

(U13949);Gm-G.max

(L35272);Nt-Nicotianatabacum

(AF083343);Os-O.sativa(AF332981);Ta-A-T.aestivumcloneA(AF083344);Zm-Z.mays

(AF077337);Ta-B-T.aestivumcloneB(AF097363)andTa-C-T.aestivumcloneC(AF174433).Sequencealignmentofthesign43SequencealignmentoftheWalkerconsensussequencepresentinNBD1ofplantHsp100

SequencealignmentoftheWalk44植物生理学1145植物生理学1146植物生理学1147植物生理学11482）热激反应的短时性

Northernblots分析表明,热激时3～5min就可检测到大豆幼苗HSPmRNAs的积累,1～2h达到高峰,6h后显著下降,12h就检测不出了。放射性标记显示,氨基酸渗入HSPs在4h达到高峰,随后下降。2）热激反应的短时性

Northernblots分析表明49RNAblothybridizationofRNAsamplesobtainedfromseedlingssubjectedtodifferentheatstresstreatmentstoanalyzemaizeHSP101

mRNAlevels.

RNAblothybridizationofRNA50植物生理学11513）热激蛋白的多样性

HSPs的种类很多,分子量从15kD～110kD或更高,定位于多种细胞器。大多数植物常见的大分子HSPs为68、70、83、92kD等。此外,分子量更大的如番茄的HSP95、大麦的HSP99、小麦的HSP103、棉花的HSP100、烟草的HSP100和120、以及大豆的HSP110等。植物热激蛋白的显著特点是smHSPs相当多,大多数植物sHSPs在20种左右。3）热激蛋白的多样性

HSPs的种类很多,分子量从15k52热激蛋白的主要功能

热激蛋白的主要功能

531）分子伴侣

分子伴侣(molecularchaperones)是指与新生肽链的折叠,寡聚蛋白质的组装和蛋白质的跨膜运输有关的一类特殊蛋白质分子。HSP60、HSP90、HSP70、smHSPs都具有分子伴侣作用。1）分子伴侣

分子伴侣(molecularchaperon54Severalclassesofmolecularchaperonesexistineukaryotes,includingHsp100/Clpproteins,Hsp90,Hsp70,Hsp60/chaperonins,sHspsandco-chaperonesHsp40/DnaJ,GrpE,andCpn60,whichareaccessoryproteinsmediatingactivityofspecificchaperones.Severalclassesofmolecularc55Membersfromdifferentfamiliesoftencooperateaschaperonemachines,forexampletheHsp70andHsp40.IncontrasttotheHsp60andHsp70,sHspchaperoneactivitiesareATPindependent.Membersfromdifferentfamilie56Functionofmt-hsp70Mitochondrialheatshockprotein70(mt-hsp70)functionsasamolecularchaperoneinmitochondrialbiogenesis.Thechaperoneinco-operationwithitsco-proteinsactsasatranslocationmotorpullingthemitochondrialprecursorintothematrix.Functionofmt-hsp70Mitochondr57Hsp70proteinscontaintwofunctionaldomains,anN-terminalATP-bindingdomain(44kDa)andaC-terminalsubstrate-bindingdomain(27kDa).TheATPbindingdomainishighlyconserved(>60%).Thesubstrate-bindingdomaindisplayslessidentitythantheATP-bindingdomain(45%).Hsp70proteinscontaintwofun58TheN-terminalsubdomainisfoldedintoacompact-sandwich,andtheC-terminalsubdomainiscomposedoffiveextended-helices.TheN-terminal

subdomainisresponsibleforsubstratebinding.TheN-terminalsubdomainisfo59Alignmentofthesubstrate-bindingdomainofDnaK(residues389-607)withfourmitochondrialhsp70sfromkidneybean(HS7MPHAVU),spinach(AF039084,Genebankaccessnumber),pea(HS7MPEA)(residues381-599)andpotato(HS7MSOLTU)(residues381-600).

Alignmentofthesubstrate-bin60Mt-hsp70modelThemt-hsp70(green)wasconstructedbyhomologymodelingbasedonthestructuralinformationofDnaK(red).Mt-hsp70modelThemt-hsp70(gr612）生物的耐热性

热激条件下,大豆中I类smHSPs的含量可达到总细胞蛋白的1%以上,并且和耐热性的获得一致。用生物工程技术使拟南芥的热激转录因子表达,并诱导细胞质I类smHSPs组成型表达,同时耐热力提高。2）生物的耐热性

热激条件下,大豆中I类smHSPs的含62植物生理学11633）在植物种子发育中的作用

Intheabsenceofenvironmentalstresses,synthesisofsHspsinplantsisrestrictedtocertainstagesofdevelopment,suchasembryogenesis,germination,pollendevelopment,andfruitmaturation.3）在植物种子发育中的作用

Intheabsenceo64InArabidopsis

embryos,cytosolicAtHsp17.4-CIandAtHsp17.6-CI(formernameAtHSP17.4andHSP17.6),andAtHsp17.7-CIIbegintoaccumulatewhenseedsentermid-maturationstageandareabundantthroughthelatematurationstageandindryseedsInArabidopsisembryos,cytoso65Inpeaandsunflower,bothcytosolicclassIandclassIIsHspsappearinembryosduringreservesynthesisandincreaseinabundanceinmatureseeds.Inpeaandsunflower,bothcyt66BiP在所有植物中含量丰富,受热激诱导不明显,主要受营养(葡萄糖饥饿)调节,和内质网上的束缚核糖体合成蛋白质有密切关系,可能参与种子贮藏蛋白的合成。BiP在所有植物中含量丰富,受热激诱导不明显,主要受营养(67ThesynthesisofHSPsalongwithseedmaturationsuggeststhatsHspsmightbeimportantforprotectionofcellularcomponentsagainstdesiccationThesynthesisofHSPsalongwi68Hsp70andHsp90changetheirexpressionandsubcellularlocalizationaftermicrosporeembryogenesisinductioninBrassicanapusL.

Astresstreatmentof32Cforatleast8hwasabletochangethegametophyticprogramofthemicrospore,switchingittoembryogenesisinBrassicanapus,aninterestingmodelforstudyingthisprocessinvitro.

Hsp70andHsp90changetheire69Afterinduction,somemicrosporesstartedsymmetricdivisionsandbecamehaploidembryosafterafewdays,whereasothermicrospores,notsensitivetoinduction,followedtheiroriginalgametophyticdevelopment.Afterinduction,somemicrospo70BothHspproteinsarerapidlyinduced,localizinginthenucleusandthecytoplasm.Insidethenucleus,Hsp70wasfoundinassociationwithRNPstructuresintheinterchromatinregionandinthenucleolus,whereasnuclearHsp90wasmostlyfoundintheinterchromatinregion.BothHspproteinsarerapidly71植物生理学1172植物生理学1173植物生理学11744）在植物减数分裂中的作用

玉米受精时对热敏感,高温时导致减产,部分原因可能是成熟花粉不能合成HSPs。玉米花粉的热敏感性可能是从单核到双核花粉粒的转变开始,合成HSPs的能力逐渐下降,花粉成熟时完全丧失。从单核到双核花粉粒的转变是花粉发育的一个重要阶段,其特征是“早期”花粉基因表达关闭,“晚期”花粉基因开始表达。4）在植物减数分裂中的作用

玉米受精时对热敏感,高温时导致减75sHSPs的分类CⅠ类sHSPs(定位于胞质或细胞核）CⅡ类sHSPs(cytosolic/nuclear）质体(P)sHSPs线粒体(MT)sHSPs内质网(ER)sHSPssHSPs的分类CⅠ类sHSPs(定位于胞质或细胞核）76StructureofplantsHsp

TheArabidopsisgenomecontains19openreadingframes,whichcodeforsHsp-relatedproteins.ClassesCIandCIIofcytosolic/nuclearsHspsaregenerallyencodedbymultigenefamilies.AllsHspsshareaconserved90-aminoacidC-terminaldomaincalledthea-crystallin（晶体蛋白）domain(ACD)orheatshockdomain.

StructureofplantsHsp

The77TheplantsHsps,likethosefromotherorganisms,canformhomo-oligomerswithapparentmolecularmassesof200to350kDaTheC-terminalACDisinvolvedincontactwithsubunitsandmaintenanceofthetertiarystructureoftheoligomericcomplex.TheplantsHsps,likethosefr78AnalysisofthefirstcrystalstructureofasHspfromMethanococcusjannaschii

(Hsp16.5)revealedtheformationofahollowsphericalcomplexcomposedof24subunits.Usually,plantsHspsformhomo-oligomerswith12subunits.Analysisofthefirstcrystal79植物生理学1180AminoacidsequencealignmentofMTsHSPsfromdiverseplantspecies.

Aminoacidsequencealignment81AminoacidsequencealignmentofthewheatMTsHSPswithwheatcytosolicclassIandIIandchloroplast-localizedsHSPs.

Aminoacidsequencealignment82植物生理学1183热激基因表达的调节TheHSPgenesareexpressedunderthecontroloftheheatshocktranscriptionfactor(HSF).HSFactsthroughahighlyconservedupstreamresponseelement,theheatshock-responsiveelement(HSE),whichconsistsofthreecontiguousandinvertedrepeatsofa5-bpsequence,definedasnGAAn.热激基因表达的调节TheHSPgenesareexp84热激基因表达的调节模式

热激基因表达的调节模式

85K2植物抗寒基因冷害cold(chilling):零上低温冻害freezing：零下低温K2植物抗寒基因冷害cold(chilling):零86K2.1Coldstresssignaling

K2.1Coldstresssignaling

87植物生理学1188植物生理学1189植物生理学1190Lowtemperaturesinducetheexpressionofadiversearrayofplantgenes.Theproductsofthesegeneshelpplantsadapttosubsequentfreezingstress.Lowtemperaturesinducetheex91

cis-Elementincold-regulatedgenes(COR)Manycold-regulatedgeneshaveintheirpromotersoneorseveralcopiesoftheDEHYDRATIONRESPONSIVEELEMENT(DRE)/C-repeat(CRT)cis-element,whichhasthecoresequenceCCGAC.cis-Elementincold-regulated92TranscriptionfactorsCRT-bindingfactors(CBFs)orDRE-BINDINGFACTORS(DREBs)TranscriptionfactorsintheAP2/EREBP(APETALA2/ETHYLENERESPONSEELEMENTBINDINGPROTEIN)familybindtothiselementandactivatetranscriptionofthedownstreamgenes.TranscriptionfactorsCRT-bind93Importantly,theCBF/DREB1genesarethemselvesinducedbylowtemperature.Thisinductionistransientandprecedesthatofdownstreamcold-regulatedgenescontainingtheDRE/CRTcis-element.Therefore,thereisatranscriptionalcascadethatleadstotheexpressionoftheRD/COR/KIN/LTIgenesundercoldstress.Importantly,theCBF/DREB1gen94UsingcDNAmicroarraytechnology,12downstreamtargetgenesoftheCBF/DREB1regulonhavebeenidentified.ElevenofthesegeneshaveanobviousDRE/CRTcis-elementintheirpromoters.UsingcDNAmicroarraytechnolo95Floweringbehaviorofsummer-andwinter-annualtypesofArabidopsisthaliana.(a)Summer-annualtypesofArabidopsisflowerrapidlywithoutvernalizationtreatment.Incontrast,winter-annualtypes,whichhavefunctionalFRIandFLCalleles,(b)flowerverylatewithoutvernalizationand(c)flowerrapidly,likeasummerannual,ifvernalized.Floweringbehaviorofsummer-96FLOWERINGLOCUSC

(FLC),thatswitchthisgeneintoarepressedstatethatismitoticallystable.FLOWERINGLOCUSC(FLC),that97HOS1(HIGHEXPRESSIONOFOSMOTICRESPONSIVE1)

HOS1encodesavariantRING-finger,whichnormallyexistsinthecytoplasmbutappearsinthenucleuswhenplantsaresubjectedtotemperaturesof0–4°C.HOS1(HIGHEXPRESSIONOFOSMOT98植物生理学1199抗冻蛋白

Antifreezeproteins(AFP)Overwinteringplantsproduceantifreezeproteins(AFPs)havingtheabilitytoadsorbontothesurfaceoficecrystalsandmodifytheirgrowth.抗冻蛋白

Antifreezeproteins(A100抗冻蛋白的分离和特性鉴定自1992年加拿大Griffith第一次从冬黑麦中获得植物AFP以来,已先后从冬大麦、小麦、燕麦、沙冬青和胡萝卜等质外体中获得AFP。AFP在体外水溶液中均表现出典型的热滞效应(降低冰点)和重结晶抑制活性。AFP主要通过重结晶抑制作用来避免冰晶体对细胞组织的伤害。抗冻蛋白的分离和特性鉴定自1992年加拿大Gr101植物生理学的研究结果揭示,植物抵御冻害的途径主要有2条:一是避免细胞内冰晶的形成和阻止冰晶的生长,二是维持细胞膜的结构稳定性和蛋白质核酸的生物活性。抗冻蛋白(antifreezeproteins,AFPs)及其基因的研究是其中的一项重要内容。植物生理学的研究结果揭示,植物抵御冻害的途径主要有2条:102抗冻蛋白的生化特征

现在,从极区鱼、昆虫到植物,不少具有AFP特性的蛋白质被发现,它们有糖蛋白,也有非糖基化蛋白,分子量大小不等,进一步的化学结构只有鱼类研究得比较清楚。总体上来看,鱼、昆虫和植物3类生物之间AFP的化学结构差异很大,同类生物之间的AFP同源性也不高。但在植物AFP中发现了一种有趣的现象,即AFP与某些抗病蛋白具有化学结构上的相似性。抗冻蛋白的生化特征

现在,从极区鱼、昆虫到植物,103Cloningandcharacterizationofplantantifreezeproteingenes

黑麦、小麦和大麦AFP中存在着-1.3葡聚糖酶,几丁质酶和甜蛋白结构与功能类似的多肽。胡萝卜AFP富含亮氨酸,与多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalacturonaseinhibitorproteins,PGIPs)的不少成员有很高的同源性。Cloningandcharacterizationo104胡萝卜AFP在胡萝卜直根中冷诱导表达,其cDNA全长1140bp,DNA全长1238bp,编码332个氨基酸。成熟糖蛋白的分子量为36kD,等电点5.0。胡萝卜AFP在胡萝卜直根中冷诱导表达,其cDNA全长105cDNAencodinganantifreezeproteinfromS.dulcamara(沙冬青),wasclonedbyusingapolyclonalantibody(HuangandDuman,2002).ThecDNAwasdeterminedas2137bpinlength,encodingofthe591aminoacidsofanantifreezeproteinof64kDa.

cDNAencodinganantifreezepr106DiagramofthepublishedcDNAsofplantantifreezeproteins

DiagramofthepublishedcDNAs107植物生理学11108植物生理学11109植物抗冻蛋白的

基因工程

1998年10月英国York大学的Dawn

Worrall等发表了胡萝卜AFP及其基因的论文,标志着第一个植物AFP基因的发现,对于植物抗冻基因工程具有非常重要的意义。在此之前,只有鱼类4种AFP的基因结构研究得较为清楚,昆虫和植物一无所知。因此,人们从事AFP基因工程的目的基因只有来源于鱼类。植物抗冻蛋白的

基因工程

1998年1110转化郁金香、烟草、油

菜、玉米1987年,Davies等将AFP基因整合在Ti质粒上,用叶盘法转化郁金香、烟草、油菜等,获得了一定的抗冻力。1990年Georges等合成了冬比目鱼AFP基因,构建了含35S启动子、AFP基因和CAT基因的表达载体,将其通过电击导入玉米原生质体,通过CAT分析以及用AFP和CAT的抗血清做的蛋白质印迹,检测到了融合肽的产生。转化郁金香、烟草、油

菜、玉米1987年,Davies111转化烟草和番茄1991年Hightower等将极区鱼的afa3AFP基因由农杆菌介导转入烟草和番茄,在二者的叶内均检测到了高水平表达的mRNA,但在组织提取物中未检测到重结晶抑制作用的活性。在另一组试验中,他们将截短了的葡萄球菌A蛋白基因与afa3

抗冻基因组成嵌合基因,结果在转基因番茄的组织中不仅检测到了mRNA,而且检测到了融合蛋白。在含有融合蛋白的组织提取物中检测到了重结晶抑制作用。据报道这种转基因番茄果实可经受冷冻不坏死。转化烟草和番茄1991年Hightower等将极区鱼的af112转化马铃薯1997年Wallis等按照Winterflounder

成熟AFP的氨基酸序列人工合成了一段基因,并接上信号肽,以使其定向表达于质外体。该基因被转入马铃薯后,用免疫杂交的方法检测到了表达产物AFP。对马铃薯叶片电解质释放量的分析表明,转基因蛋白表达水平与冰冻忍耐程度之间存在着相关性。转化马铃薯1997年Wallis等按照Winterf113胡萝卜AFP转化烟草

1998年，DawnWorrall等将胡萝卜AFPcDNA连接在表达载体的双CaMV35S启动子之后导入烟草,让其组成性表达。9个独立的转基因株系在温室条件下表现正常。用蛋白质免疫杂交法分析这些株系的叶提取物,有8个株系表达了36kD的多肽。这些含有胡萝卜AFP的烟草提取物可以抑制冰晶的生长。胡萝卜AFP转化烟草

1998年，DawnWorrall114植物抗氧化系统植物抗氧化系统115AntioxidantsOxidantsOxidativeDamageEnzymaticDefences–catalyticallyremoveROSMetalSequestrationProteinsLowMWAntioxidantsOtherProtectiveCompoundse.g.HSPs(RepairProcesses)AntioxidantsOxidantsOxidative116氧胁迫在温度（高温或低温）、水分、盐碱、UV、臭氧（ozone）等胁迫下,植物体内会产生一系列有害的活性氧（activeoxygenspecies，AOS；reactiveoxygenspecies,ROS)。氧胁迫在温度（高温或低温）、水分、盐碱、UV、臭氧（ozon117活性氧种类能导致氧化伤害的活性氧种类包括超氧自由基（O2¯•）、过氧化氢（H2O2）、羟自由基（OH•）。活性氧种类能导致氧化伤害的活性氧种类包括超氧自由118MolecularO2isreducedthroughfoursteps,thusgeneratingseveralO2radicalspeciesMolecularO2isreducedthroug119活性氧的毒性①活性氧能与酶的巯基或色氨酸残基反应，导致酶失活；②活性氧会破坏核酸结构，攻击核酸碱基，使嘌呤碱和嘧啶碱结构变化，导致变异出现或变异的积累；③DNA是蛋白质合成的信息，由于活性氧对DNA复制过程的损伤，从而妨碍蛋白质合成；④启动膜脂过氧化反应，使维持细胞区域化的膜系统受损或瓦解。

活性氧的毒性①活性氧能与酶的巯基或色氨酸残基反应，导致酶失活120植物抗氧化系统植物为保证各部分的正常功能，对潜在的活性氧伤害存在着精细而复杂的防御系统，以清除体内活性氧,使细胞免受毒害。其中最明显的是合成与清除活性氧有关的酶。植物抗氧化系包括抗氧化酶（antioxidativeenzyme）和抗氧化剂（antioxidant）。植物抗氧化系统植物为保证各部分的正常功能，对潜在的活性氧伤121抗氧化剂抗氧化剂主要包括维生素E、维生素C、类胡萝卜素和谷胱甘肽

抗氧化剂抗氧化剂主要包括维生素E、维生素C、类胡萝卜素和谷胱122抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)过氧化氢酶(catalase,CAT)抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbateperoxidase,APX)

谷胱甘肽还原酶（Glutathionereductase，GR）过氧化物酶(Peroxidase,POD)谷胱甘肽转移酶（GlutathioneS-transferase,

GST）抗氧化酶超氧化物歧化酶(Superoxidedismutas123超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（EC,1.15.1.1）是生物细胞普遍存在的金属酶，催化O2¯•的歧化反应，生成氧和H2O2。

超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（EC,1.1124SOD的类型Cu-Zn-SODMn-SODFe-SOD高等植物以Cu-Zn-SOD为主，也有部分的Mn-SOD。Fe-SOD在5个科的植物，如银杏科、睡莲科、芸香科、十字花科和茄科中被发现。Fe-SOD基因也从水稻、鼠耳芥、大豆和白花丹叶烟草中得到克隆。

SOD的类型Cu-Zn-SOD125SOD定位Cu-Zn-SOD主要定位叶绿体Mn-SOD主要存在于线粒体定位于细胞质SOD定位Cu-Zn-SOD主要定位叶绿体126过氧化氢酶

CAT存在过氧化物体和细胞质中CAT的主要作用是将不同过氧化过程，如光呼吸和脂肪酸β-氧化反应中产生的H2O2分解为H2O和O2。

CAT2H2O2

2H2O+O2

过氧化氢酶CAT存在过氧化物体和细胞质中127植物CAT具有多种同工酶，由一个多基因家族编码。在烟草和玉米，水稻，豌豆，拟南芥分离到CAT基因，cat1,cat2和cat3。CAT为由4个亚基与Fe（Ⅲ）血红素辅基组成的四聚体，分子量在225-269kD之间。不同来源的亚基分子量为60-80kD。血红素连接在酶的活性部位。

植物CAT具有多种同工酶，由一个多基因家族编码。在烟草和玉米128过氧化物酶POD和CAT有相似的作用

，清除生理系统的H2O2。

PODH2O2+R（OH）2H2O+RO2过氧化物酶POD和CAT有相似的作用，清除129大多数植物中存在大量的过氧化物酶同工酶，如烟草中存在至少12种过氧化物酶同工酶，大豆则有大约20种同工酶，由于过氧化物酶同工酶表达的多样性，因而难于研究其确切的功能。

大多数植物中存在大量的过氧化物酶同工酶，如烟草中存在至少12130大豆过氧化物酶基因从大豆中分离到4中过氧化物酶基因，GmEpa1、GmEpa2、GmEpb1

和GmEpb2分别编码303，303，292，和292个氨基酸残基GmEpa1和GmEpa2的氨基酸同源性达97%GmEpb1和

GmEpb2的氨基酸同源性达93%GmEpa1和GmEpb1的氨基酸同源性仅为47%大豆过氧化物酶基因从大豆中分离到4中过氧化物酶基因，GmEp131抗坏血酸过氧化物酶（APX）抗坏血酸过氧化物酶（APX）以过氧化氢为氧化剂催化还原型抗坏血酸形成脱氢抗坏血酸（氧化型）。植物叶绿体和细胞质中过氧化氢脱毒主要途径为抗坏血酸谷胱甘肽循环中两个关键酶是抗坏血酸氧化酶和谷胱甘肽还原酶。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）抗坏血酸过氧化物酶（APX）以132APX约为30kD，一般以单体的形式存在，有些胞质APX也会出线二聚体。APX同工酶有多种类型，有12种在细胞质，2种在叶绿体膜上，1种在叶绿体类囊体基质中，此外还发现位于乙醛酸体和过氧化物体膜上的APX。拟南芥AVAPX1cDNA为1089bp，编码291氨基酸残基。

APX约为30kD，一般以单体的形式存在，有些胞质APX也会133谷胱甘肽还原酶（GR）GR是一种黄素蛋白氧化还原酶，在硫的贮藏和运输起重要作用，还参与多种细胞代谢过程。在氧胁迫反应中消除活性氧起关键作用。

谷胱甘肽还原酶（GR）GR是一种黄素蛋白氧化还原酶，在硫的贮134植物中存在多种GR同工酶油菜GRcDNA，编码502个氨基酸残基，分子量为54.5kD，与在拟南芥和豌豆的GR的氨基酸同源性分别达到92.2%和79.5%。

植物中存在多种GR同工酶135植物对病原体的反应Virus

Fungi

Bacteria

Generalelicitors

infectionInnateimmunity植物对病原体的反应GeneralinfectionInna136植物病原体(plantpathogens)

?在植物体内完成一部分或全部生活周期，并对植物造成有害影响的生物体。植物病原体有真菌、细菌、病毒等。植物病害?

植物受到病原体的侵染并使其生长发育受到抑制的现象。植物病原体(plantpathogens)?137致病真菌：已知真菌超过10万种，其中50种引起人的疾病，50种引起动物的疾病，主要是皮肤病或四肢病，但约2000种真菌引起植物病害。致病细菌：欧文氏菌属、假单胞杆菌属、黄单胞菌属、农杆菌属、棒杆菌属植物病毒：有DNA和RNA植物病毒，其中绝大多数是单链正义RNA病毒致病真菌：已知真菌超过10万种，其中50种引起人的疾病，501381植物病原体的致病机理病原体通过酶解、气孔、皮孔或损口侵入植物。大部分微生物只攻击植物的一个特定部位，而且产生特征性的病症（如花叶、坏死、斑点、枯萎、或根部膨大）。番茄植株可能受到100种以上的病原体微生物的攻击。粉霉细菌斑斑萎病炭疽病根瘤线虫冠瘿镰刀菌枯萎病番茄花叶病毒1植物病原体的致病机理病原体通过酶解、气孔、皮孔或损口侵139病原体利用植物的三种方式坏死营养型（necrotrophy）:该方式导致植物死亡。活体营养型（biotrophy）：植物细胞仍能生存。半活体营养型(hemitrophy)：病原体最初让细胞生存(活体营养型)，但在感染晚期杀死它们(坏死营养型)。病原体利用植物的三种方式1401.1真菌类植物病原体的致病策略(1)坏死营养型真菌分泌降解细胞壁的酶或毒素，或同时分泌两者。每种毒素都有高度专一的作用方式，特异地使植物中某一种酶失活。玉米病原真菌Cochlioboluscarbonum产生的HC-toxin抑制组蛋白脱酰酶的活性，该酶是激活植物防御基因所必需的。1.1真菌类植物病原体的致病策略(1)坏死营养型真菌分泌降1411.1真菌类植物病原体的致病策略(2)活体营养型的真菌让植物细胞保持存活。真菌穿过细胞壁，形成吸器（haustorium)，使细胞质膜内陷。真菌吸器增加了两种生物表面间的接触，从而增大水分和养料的流动，促进真菌的生长。吸器附着器孢子吸器1.1真菌类植物病原体的致病策略(2)活体营养型的真菌让植1421.1真菌类植物病原体的致病策略(3)半活体营养型病原体最初采用活体营养方式，然后采用坏死营养方式。真菌生物量的增加，进而触发由活体营养方式向坏死营养方式转变，在感染晚期杀死植物。有些世界上最具破坏力的病原菌就属于这一类。马铃薯晚疫病1.1真菌类植物病原体的致病策略(3)半活体营养型病原体最1431.2细菌类植物病原体的致病策略植物致病细菌定殖在质外体，造成烂口、斑点、维管萎缩、癌肿和枯萎。它们大多数属于橄榄上革兰氏阴性杆菌，欧文氏菌属、假单胞杆菌属或黄单胞菌属。黄单胞菌细菌在寄生阶段一般生活于各种植物器官的细胞间隙，或者生活在木质部中。许多细菌在致病的某一阶段会分泌毒素、胞外多糖(EPS)或降解细胞壁的酶。1.2细菌类植物病原体的致病策略植物致病细菌定殖在质外体，1441.3植物病毒的致病策略植物病毒通过胞间连丝和韧皮部移动。病毒感染的症状：黄化（黄萎）或褐化（枯死）、花斑和发育迟缓。植物病毒都是活体营养型的。病毒致病不是由于消耗细胞养分或通过毒素杀死细胞，而是利用细胞内物质进行增殖并占领整个植株。ssRNA病毒dsDNA病毒1.3植物病毒的致病策略植物病毒通过胞间连丝和韧皮部移动。145双链DNA花椰菜花叶病毒（CaMV)的基因组结构。含有7个ORF,负责病毒DNA的复制和运动、病症发作以及外壳包被。双链DNA花椰菜花叶病毒（CaMV)的基因组结构。含有7个O1462植物-病原体相互作用植物寄主的抗病基因和防御基因抗病基因（resistancegene,R)是抗病品种特有的，通常在植物-病原菌相互作用的早期识别反应中发生作用。通过保卫基因（defencegene）的协同配合达到抗病的目的。防御基因（defensegene）是抗、感品种共有的。抗性基因是组成型表达的，众多的保卫基因是诱导型的，可经病原体感染或其他因子的刺激而表达出来。2植物-病原体相互作用植物寄主的抗病基因和防御基因147病原体的无毒基因和致病基因无毒基因(avirulencegene,Avr)是病原体与植物特定基因型不相容的遗传决定因子。植物病毒的外壳蛋白、复制酶和运动蛋白都是无毒因子，但目前只知道少数几个真菌和细菌的无毒基因。致病基因（pathogenicitygene）是病原体编码与感染及在寄主内生长的有关信息的基因。包括吸着在植物表面，形成穿透结构，分泌降解寄主组织所需要的酶，合成毒素及使植保素脱毒的基因。

病原体的无毒基因和致病基因无毒基因(avirulenceg148基因对基因模型（geneforgenemodel)活体营养病原体与植物的相互作用：只有当植物有显性抗病基因（R)并且病原体表达互补的显性无毒基因(Avr)时，植物才会表现出抗性。基因对基因模型（geneforgenemodel)活体149基因对基因模型（geneforgenemodel)植物与依赖毒素完成致病作用的病原体的相互作用：病原体的毒素必须是显性的，只有产生有功能的毒素或酶（或两者都有）才能引起疾病；植物的抗性是通过酶的解毒作用或病原体的毒素丧失或发生改变而产生的。基因对基因模型（geneforgenemodel)植物1503R基因和R基因介导的植物抗性植物抗性基因克隆的策略用转座子失活的方法鉴定R基因用图位克隆法鉴定R基因3R基因和R基因介导的植物抗性植物抗性基因克隆的策略151植物生理学11152植物生理学11153R蛋白的种类分离到6类R蛋白，其中1-4类具有富含亮氨酸的重复序列（leucine-richrepeat,LRR).这种基序大约有24个氨基酸残基。这种基序在参与信号传导途径的蛋白中也存在。R蛋白的功能识别无毒基因依赖性的配基并在识别后激活下游信号以迅速诱导多种防御反应。哺乳植物抗性蛋白植物果蝇动物R蛋白的种类154植物R-蛋白的结构特点Class1:LZ-NBS-LRRTIR-NBS-LRR

NBS-LRRClass2:蛋白激酶PtoClass3:eLRR-TM(Cf2,5,4,9)Class4:LRR(Xa21)Class5:毒素还原酶Class6:G-蛋白偶联受体(e.胞外;TM跨）植物R-蛋白的结构特点Class1:LZ-NBS-LRR155R基因与无毒基因产物激活植物防御反应的机制番茄Pto激酶介导的信号途径模型。Pti转录因子；Avr9肽和Cf9蛋白激活番茄中防御反应方式的3种解释R基因与无毒基因产物激活植物防御反应的机制番茄Pto激酶介导1564植物的防御系统植物对病原菌侵染有多方面的抵抗能力。寄主植物的抵抗机制（防御反应）可分为两类：静止型抵抗诱发型抵抗（防御反应）4植物的防御系统植物对病原菌侵染有多方面157(1)静止型抵抗

是指植物受病原菌侵染之前已存在的抗性，包括物理障碍和抗菌物质。物理障碍如细胞壁的角质、腊质、木质素及表皮坚硬度，气孔结构等物理构造，许多植物外部都有角质层保护，坚厚的角质层能阻止病菌侵入机体组织。植物抗菌物质对病菌有抑制作用，使病菌无法在寄主中生长，包括酚类、萜类、黄酮类、含氰化合物、生物碱、单宁等小分子物质。(2)诱发型抵抗（防御反应）是指植物组织或细胞受病原微生物侵染时被诱发产生的一系列防卫性反应。这种激活反应涉及到大量防御相关基因（defense-relativegene)的激活、离子通道的开放、蛋白质磷酸化状态的改变、酶前体的激活，同时产生一系列次生信号分子在时空上保证防御反应的协同性，从而迅速遏制病原体。(1)静止型抵抗1584.1植物防御反应的类型直接防御反应(immediatedefenseresponse)

特征是受侵染部位的细胞及其近邻细胞中累积抗病物质，既限制或杀死病原，又破坏自身细胞结构，形成坏死斑(necrosislesion)。局部防御反应(local

defenseresponse)

特征是植物在受侵染部位的细胞及其近邻细胞壁加厚度，局部的HR处产生一类信号分子（包括水杨酸、苯甲酸、茉莉酸类、乙烯等），激活植物防御基因表达。系统防御反应（systemicdefenser