蛋白质测定实验报告

蛋白质测定方法——化学报告蛋白质的检测酚试剂法 灵敏度较高费时20~250mg

蛋白质在碱性溶Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸复原，产生蓝色化合物

酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用由上表可大致了解五种检测蛋白质的方法，下面以试验的形式进展具体阐述：材料与方法仪器材料仪器:凯氏定氮仪、紫外分光光度计、可见光分光光度计、工作离心机、布氏漏斗、抽滤泵。试剂及原材料:牛奶、酸奶、豆浆、LpH=4.7醋酸-醋酸钠缓冲液、乙醇-乙H2SO4、40%氢氧化钠、30%过氧化氢、2%硼酸溶液、0.050molPL标准盐酸溶液、硫酸钾-硫酸铜接触剂、混合指示剂、标准蛋白溶液、G-250试验方法凯氏定氮法测定蛋白质含量成硫酸铵。为了加速消化,可以参加CuSO4作催化剂和参加K2SO4以提高溶液的沸点,而参加30%过氧化氢有利于消化溶液的澄清。消化好的样品在凯氏定氮仪内经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至定量硼酸溶液中,然后用标准盐酸溶液进展滴定,记录,计算出样品含氮量。每个样品做三次重复测定,取平均值。紫外吸取法测定蛋白质含量蛋白质分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键,使蛋白质具有吸取紫外光的性质,吸取峰在280nm处,其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外,蛋白质溶液在238nm的光吸取值与肽键含量成正比。利用肯定波长下,蛋白质溶液的光吸取值与蛋白质浓度的正比关系,可以进展蛋白质含量的测定。紫外吸取法简便、灵敏、快速,不消耗样品,测定后仍能回收使用。低浓度的盐,例如,生化制备中常用的(NH4)2SO4洗脱液的快速连续检测,由于此时只需测定蛋白质浓度的变化,而不需知道其确定值。此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差,干扰物质较多,在用标准曲线法测定蛋白质含量时,对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质有肯定的误差,故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相像的蛋白质。假设样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸取紫外光的物质,会消灭较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表,再进展计算的方法加以适当的校正。但是由于不同的蛋白质和核酸的紫外吸取是不一样的,虽然经过校正,测定的结果还是存在肯定的误差。此外,进展紫外吸取法测定时,由于蛋白质吸取顶峰常因pH的转变而有变化,因此要留意溶液的pH值,测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相全都。取待测样品制成蛋白浓度大约在0.1～1.0mgPmL色,比照标准曲线得出样品含氮量。每个样品做3双缩脲法测定蛋白质含量双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反响。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能够以一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反响。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。此法的优点是测定较快速,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少;主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要格外精确的蛋白质测定。取待测样品制成蛋白浓度大约在1～10mgPmL的蛋白质溶液,加双缩脲试剂染色30min,用可见光分光光度计进展比色,比照标准曲线得出样品蛋白质含量。每个3考马斯亮蓝法测定蛋白质含量由于双缩脲法(Biuret法)存在明显的缺点和很多限制,因此1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法(Bradford法),这是依据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点,因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。【Bradford法的突出优点是:c.干扰物质少。如干扰Lowry、离子、Tris缓冲液、糖和蔗灵敏度高。据估量,比Lowryc.干扰物质少。如干扰Lowry、离子、Tris缓冲液、糖和蔗吸取值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大得多。测定快速、简便,只需加一种试剂。完成一个样品的测定,只需要5min左右。由于染料与蛋白质结合的过程,大约只要2min即可完成,其颜色可以在1h内保持稳5～20min之间,颜色的稳定性最好,因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地掌握时间。糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是:由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,在制作标准曲线时通常选用γ蛋白质,以削减这方面的偏差。仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有:去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS0.1NNaOH0.1NLowry法一样)。标准曲线也有稍微的非线性,因而不能用Beer定律进展计算,而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。】取待测样品参加考马斯亮蓝G-250试剂放置5min后,用可见光分光光度计比色,3 结果与分析试验结果1样品蛋白质含量的测定结果试验结果分析凯氏定氮法可测出全部3种样品的蛋白含量,测试结果准确,只是蒸馏与吸取装置简单,不便于操作,试验过程所需时间较长,操作简单。紫外吸取法无法测出牛奶、酸奶的蛋白含量,测出的豆浆蛋白含量也与实际值相差较大,不具实际使用价值。此方法试验过程简洁,适用于测试无色样品,对于有色样品需进展预处理,排解颜色干扰后才适用于此方法。双缩脲法适用于被测的3种样品,试验操作简便快速,但其缺点是灵敏度较低,蛋白质量须在1～20mgPmL时测定结果较准确。因此试验前要估测被测样品的蛋白含量,把样品稀释至蛋白浓度为1～20mgPmL。考马斯亮蓝染色法可以测出被测的全部3种样品,此方法快速、灵敏,但只有作微量蛋白测定时的结果才准确,因此在试验前应将样品稀释至蛋白浓度为0.1～1mgPmL1h〔5〕酚试剂法原理：蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质一铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸复原，产生蓝色化合物，在肯定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。优点：操作简便，灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，样品中蛋白质含量高于5μg费时间较长，要准确掌握操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反响发生干扰的离子，同样简洁干扰lowry者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、tris类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素〔%〕，硫酸纳〔1%〕，硝酸纳〔1%〕，三氯乙酸〔%〕，乙醇〔5%〕，乙醚〔5%〕，丙酮〔%〕等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必需作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠