念珠菌李若瑜课件

念珠菌病诊治与

念珠菌鉴定四川大学华西医院第16期国家级继续医学教育项目《皮肤真菌病基础和临床研究进展讲习班》mycolab@126.com北京大学第一医院、真菌和真菌病研究中心李若瑜2015.3.27念珠菌病诊治与

念珠菌鉴定mycolab@126.com北京1念珠菌感染概况念珠菌感染概况2浅部念珠菌病口腔念珠菌病念珠菌性女阴阴道炎念珠菌性龟头炎皮肤念珠菌病念珠菌性甲沟炎及甲床炎慢性粘膜皮肤念珠菌病念珠菌性角膜炎浅部念珠菌病口腔念珠菌病3念珠菌李若瑜课件4侵袭性念珠菌病支气管、肺念珠菌病消化道念珠菌病泌尿道念珠菌病念珠菌败血症念珠菌性心内膜炎念珠菌性脑膜炎侵袭性念珠菌病支气管、肺念珠菌病5不同部位念珠菌感染的高危因素白血病或长期粒细胞缺乏接受皮质激素治疗移植HIV感染头颈部照射AIDS重度免疫抑(包括肿瘤和器官移植)使用抗生素或皮质激素化疗血管内插管全胃肠外营养近期接受手术入住ICU恶性肿瘤粒细胞缺乏真菌定植口咽部念珠菌病食道念珠菌病念珠菌血症及播散性念珠菌病高危因素J.D.Sobeletal.SEMINARSINRESPIRATORYANDCRITICALCAREMEDICINE.2003;24:99-111.不同部位念珠菌感染的高危因素白血病或长期粒细胞缺乏AIDS使6JCM,2010,48(4):1366–1377念珠菌感染流行病学

—非白念珠菌感染比例升高全球念珠菌监测数据：分析1997年-2007年间全世界142个医学中心收集的来自患者各部位的256,882株念珠菌JCM,2010,48(4):1366–1377念珠菌感7%Int.JAntimicrobialAgents2009;34:205–209—亚洲部分地区念珠菌分布状况%Int.JAntimicrobialAgents28132C.glabrata42.3%C.parapsilosis21.1%C.tropicalis26.1%非白念念珠菌血症Edmondetal.ClinInfectDis1999;29:239-44.132C.glabrataC.parapsilosisC9ARTEMIS研究总体结果2001-2009年中国5家医院的念珠菌菌种分布(%)ARTEMIS研究总体结果2001-2009年中国5家医院的10念珠菌李若瑜课件11念珠菌李若瑜课件12念珠菌李若瑜课件13念珠菌病诊断与治疗原则念珠菌病诊断与治疗原则组织病理组织病理15直接镜检（LPCB）假菌丝和芽孢直接镜检（LPCB）假菌丝和芽孢16金标准血培养技术的改进敏感度：50%解离离心系统（Thelysiscentrifugationsystem）(WampoleLaboratories,USA)培养基成分：含树脂（resins）自动血培养系统：(BacT/ALERTorBACTEC9240）金标准血培养技术的改进敏感度：50%利用生物标记诊断抗原/抗体：免疫学方法细胞壁成分：凝集反应代谢产物：高效液相色谱DNAorRNA：分子生物学方法利用生物标记诊断抗原/抗体：免疫学方法Gtest可检测多种真菌感染念珠菌,曲霉,肺孢子菌,镰刀菌,地霉,组织胞浆菌,毛孢子菌等不能用于检测隐球菌和接合菌感染阳性结果代表存在侵袭性真菌感染真菌对数生长期释放量最大,可被体内葡聚糖酶降解(glucanase)推荐动态监测，每周检测2次Gtest可检测多种真菌感染Gtest诊断念珠菌血症敏感度为62%-100%，特异度为64%-88%不同种念珠菌感染对葡聚糖检测无明显影响白念珠菌,光滑念珠菌,热带念珠菌,克柔念珠菌,季也蒙念珠菌和葡萄牙念珠菌近平滑念珠菌BG水平较低BG检测敏感度明显高于Mannan检测79.6%vs42%阳性早于血培养阳性和临床症状出现Clin.Infect.Dis.2005.41:654–659.J.Clin.Microbiol.2005.43:5957–5962J.Clin.Microbiol.2008.46:1009–1013Gtest诊断念珠菌血症敏感度为62%-100%，特异度为2009IDSA指南

确诊念珠菌病的治疗推荐：念珠菌血症念珠菌病类型首选用药替代用药备注念珠菌血症非中性粒细胞减少患者氟康唑(A-I)负荷剂量800mg(12mg/kg)，随后每日400mg(6mg/kg)棘白菌素类如卡泊芬净

(A-I)负荷剂量70mg，随后50mg/d脂质体剂型两性酶素B(LFAmB)3~5mg/kg/d两性酶素B脱氧胆酸(AmB-d)0.5~1.0mg/kg/d伏立康唑400mg(6mg/kg)，2次/d，共两剂；随后200mg(3mg/kg)，2次/d(A-I)对于近期有过唑类暴露史的中重度患者选择棘白菌素类;初始选择棘白菌素类治疗后可转换为氟康唑;尽可能把掉所有导管.念珠菌血症治疗疗程,等首次血培养阴性,和临床症状消失后再用14天所有病人推荐眼部检查念珠菌血症中性粒细胞减少患者棘白菌素类如卡泊芬净：负荷剂量70mg，随后50

mg/d(A-II)脂质体剂型两性霉素B(LFAmB)：3~5mg/kg/d(A-II)氟康唑(B-III)负荷剂量800mg(12mg/kg)随后400mg(6mg/kg/d)伏立康唑(B-III)400mg(6mg/kg)，2次/d，共2剂随后200mg(3mg/kg)，2次/d大部分患者优先考虑棘白菌素类或LFAmB;氟康唑用于病情不严重或者近期没有唑类暴露史的患者;伏立康唑推荐在需要额外覆盖曲霉时;建议拔掉导管但有争议.ClinicalInfectiousDiseases2009;48:000–0002009IDSA指南

确诊念珠菌病的治疗推荐：念珠菌血症念212009IDSA指南

可疑念珠菌病的治疗推荐：经验性治疗指南经验性抗真菌治疗推荐首选用药替代用药念珠菌病管理指南—可疑念珠菌病的经验性抗真菌治疗非中性粒细胞减少患者氟康唑：负荷剂量800mg(12mg/kg),随后每日400mg(6mg/kg)(B-III)棘白菌素类如卡泊芬净：负荷剂量70mg，随后50mg/d(B-III)如果患者对其他抗真菌药不耐受或无法获得其他抗真菌药，下列是替代选择：AmB-d(0.5~1.0mg/kg/d)或LFAmB(3~5mg/kg/d)(B-III)中性粒细胞减少患者LFAmB：3~5mg/kg/d(A-I)卡泊芬净：负荷剂量70mg，随后50mg/d(A-I)伏立康唑：6mg/kg，静脉2次/d，共两剂；随后3mg/kg，2次/d(B-I)氟康唑：负荷剂量800mg(12mg/kg),随后每日400mg(6mg/kg)(B-I)伊曲康唑：每日200mg(3mg/kg)，2次/dAmB-d：有效的替代选择，但是毒性危险高于LFAmB(A-I)ClinicalInfectiousDiseases2009;48:000–000*对于接受三唑类预防治疗的患者不应使用三唑类进行经验治疗(B-II)2009IDSA指南

可疑念珠菌病的治疗推荐：经验性治疗22酵母及酵母样真菌鉴定酵母及酵母样真菌鉴定23酵母定义酵母（yeast）是糊状或膜样发育形态菌群的总称菌落平滑湿润，乳酪状或薄膜样，无气生菌丝单细胞性真菌,无性繁殖多数为芽生，少数为裂殖有性繁殖不产生子实体酵母定义酵母（yeast）是糊状或膜样发育形态菌群的总称24酵母菌分类位置BaiFY，CBS-NanjingCourse酵母菌分类位置BaiFY，CBS-NanjingCour25酵母的无性繁殖主要是芽殖，少数为裂殖。芽殖：成熟的母细胞出芽，称芽孢，芽孢脱落后会继续生长形成新的个体，出芽部位固定在菌体一上的称一端芽殖，如花斑癣菌，出芽部位位于细胞两端称两端芽殖，如类酵母属，大多数酵母都是多边芽殖。裂殖：指细胞先出现横隔，继而断裂成新个体酵母的无性繁殖主要是芽殖，少数为裂殖。26念珠菌李若瑜课件27念珠菌李若瑜课件28假菌丝（pseudohyphae）链状排列的芽孢。酵母出芽，芽不脱落，继续出芽形成分枝状形似树枝。假菌丝与真菌丝不同之处在于假菌丝有许多缩窄，为芽颈所在处。为酵母样真菌念珠菌的特点。假菌丝（pseudohyphae）链状排列的芽孢。酵29医学上重要的酵母及酵母类真菌

酵母菌有100属、700种之多，医学重要的主要有：子囊菌酵母：念珠菌属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）及酵母属（Saccharomyces）；担子菌酵母：隐球菌属（Cryptococcus）、毛孢子菌属（Trichospron）和马拉色菌属（Malassezia）；地霉属（Geotrichum）虽不是酵母，但其产生的关节孢子与毛孢子菌十分相似。医学上重要的酵母及酵母类真菌

酵母菌有100属、7030酵母的生活史酵母的生活史31实验室鉴定基本流程临床标本PDA,SDA28度培养不能生长鼻孢子菌、肺孢子菌、马拉色菌（厚皮除外）芽孢和/或假菌丝关节孢子念珠菌、隐球菌、红酵母等毛孢子、地霉等有隔菌丝无隔菌丝担子菌、子囊菌接合菌等实验室鉴定基本流程临床标本PDA,SDA不能生长鼻孢子菌、32酵母菌分类依据

形态学特性+生理生化特性酵母菌分类依据

形态学特性+生理生化特性33种鉴定依据种鉴定依据34病原性酵母菌鉴定方法

鉴定目的：确定感染及传染源；选择敏感抗真菌药物；哪些酵母菌需要鉴定到种：所有分离自无菌体液，包括脑脊液、血液、尿液、穿刺液及其它体液的酵母菌；分离自所有严重疾患或免疫受损病人或怀疑真菌感染的病人的酵母菌；从任何临床标本中分离出大量的酵母菌；分自若干连续取材的标本，除呼吸道分泌物，也应鉴定至种的水平；病原性酵母菌鉴定方法

鉴定目的：确定感染及传染源；选择敏感抗35酵母菌的形态观察菌落观察培养基：麦芽汁液体或固体培养基、沙氏琼脂+氯霉素、含橄榄油琼脂；液基：观察有无菌醭，菌环和菌岛形成。

——菌醭为浮膜，圆而坚硬的菌醭多由有菌丝的酵母产生。

——菌环为酵母生长于管壁。

——菌岛是液面上飘浮的菌体。固基：观察菌落的形态、颜色、光泽、质地和边缘。米粉琼脂或玉米粉吐温琼脂划线接种2~3条，盖上灭菌盖玻片，培养3天。镜下观察假菌丝、真菌丝、厚膜孢子、关节孢子、荚膜有无出芽方式：单极、多级酵母菌的形态观察菌落观察36念珠菌属特性念珠菌属特性37简介念珠菌属约有150个种，65%以上不能在37℃生长，无致病性念珠菌可以感染皮肤、粘膜及内脏器官引起念珠菌病常见的致病性念珠菌白念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌、乳酒念珠菌简介念珠菌属约有150个种，65%以上不能在37℃生长，无致38生物学特性

在环境中和人体内均可寄生;

正常人皮肤、口腔、肠道、肛门、阴道中均可分离出本菌;可以芽孢和假菌丝两种形式存在；芽孢一般为寄生形式，假菌丝多与致病相关；生物学特性

在环境中和人体内均可寄生;39致病性

条件致病菌

白念珠菌致病力强

菌体形态转换、黏附性和分泌水解酶等因素与其致病性密切相关致病性条件致病菌40常见病原性念珠菌白念珠菌（Candidaalbicans）热带念珠菌（C.tropicalis）克柔念珠菌（C.krusei）近平滑念珠菌（C.parapsilosis)光滑念珠菌（C.glabrata)乳酒念珠菌（C.kefyr）季也蒙念珠菌（C.guilliermondii）常见病原性念珠菌白念珠菌（Candidaalbicans）41少见病原性念珠菌链状念珠菌（C.catenulata）西弗念珠菌（C.ciferrii）海默郎尼念珠菌（C.haemulonii）解脂念珠菌（C.lipolytica）葡萄牙念珠菌（C.lusitaniae）挪威念珠菌（C.norvegensis）铁红念珠菌（C.pulcherrima）皱落念珠菌（C.rugosa）产朊念珠菌（C.utilis）维丝念珠菌（C.viswanathii）涎沫念珠菌（C.zeylanoides）少见病原性念珠菌链状念珠菌（C.catenulata）42芽管试验（Germ-tubetest）原理：白念珠菌在有营养的液体环境中35℃培养，可从酵母细胞生出芽管。结果：白念珠菌可在2h内生成芽管，热带念珠菌和其他念珠菌则否。芽管试验（Germ-tubetest）原理：白念珠菌在有营43米粉琼脂形态学-菌丝、假菌丝、

厚膜孢子原理：米粉琼脂中加入吐温80可降低表面张力，有利于酵母形成假菌丝，菌丝和芽生孢子。某些种可形成特征性的形态学结构。方法：从原代培养基取单菌落；划线接种至含1%吐温80和台盼蓝的米粉琼脂平板上；盖一张无菌盖玻片于划线层；30℃培养2~3天。结果：48h后直接镜检划线区，观察芽生孢子、关节孢子、假菌丝、菌丝或厚膜孢子。白念珠菌可产生厚膜孢子和在假菌丝上规则排列成簇的芽生孢子。米粉琼脂形态学-菌丝、假菌丝、

厚膜孢子原理：米粉琼脂中加入44厚膜孢子形成试验（Dalmoplatetest）厚膜孢子形成试验（Dalmoplatetest）45碳源同化和发酵酵母对碳源的利用有2种方式：同化和发酵。同化是指酵母菌在有氧条件下利用碳源进行代谢，将糖类完全分解至最终产物二氧化碳和水。发酵是无氧代谢，糖类分解后的最终产物为乙醇和二氧化碳，酵母利用同化或发酵方式来获取生命活动所必需的能量。一种酵母可能同时存在2种代谢方式，也可能只有同化而没有发酵，但只要能发酵就必定能同化，故同化试验只需选择该酵母不能发酵的碳源。碳源同化和发酵酵母对碳源的利用有2种方式：同化和发酵。46碳源的同化和发酵试验发酵试验采用液体培养基，观察有无二氧化碳气泡的产生，产气是发酵试验阳性的唯一标志。同化试验采用生长图谱法，在无碳源固体培养基，均匀混入待检菌种，再在培养基表面直接放上待检碳源或含此碳源的纸片，培养后观察碳源周围有无菌落形成。发酵与同化试验培养温度都为25℃~28℃，不能置37℃培养。碳源的同化和发酵试验发酵试验采用液体培养基，观察有无二氧47尿素酶试验新生隐球菌等隐球菌和一些酵母菌能够产生尿素酶。常用Christensenureaagar培基。尿素酶可水解尿素产生氨和二氧化碳，氨使培养基呈碱性进而使酚红指示剂由黄变红。红酵母、念珠菌和毛孢子菌偶尔也可水解尿素，故在检出隐球菌属进应结合显微镜镜下形态。尿素酶试验新生隐球菌等隐球菌和一些酵母菌能够产生尿素酶。常用48放线菌酮耐受试验念珠菌属的一些种对放线酮敏感，利用这一特性可有助于鉴别念珠菌属中的种。在含放线菌酮的培养基上能够生长的念珠菌为白念珠菌（99%）、乳酒念珠菌、季也蒙念珠菌；不能生长（即敏感）的念珠菌为近平滑念珠菌、热带念珠菌和克柔念珠菌。放线菌酮耐受试验念珠菌属的一些种对放线酮敏感，利用这一特性可49酵母菌鉴定—生理生化方法CHROMagarCandida(48hr)API20CAUX(48-72hr)RapIDYeastPlusSystem(4-5hr)自动生化系统ID32Cstripsystem(24-48hr)VitekYeastBiochemicalCardsystemVitek2ID-YSTcardsystem(24hr)QuantumIIBiologYTMicroPlatesystem(Biolog,USA)酵母菌鉴定—生理生化方法CHROMagarCandida(50念珠菌显色培养基

（CHROMagarCandida）原理：几种常见念珠菌独特的酶底物与显色基团化学结合既可用于检测，又可根据菌落颜色用于鉴定95%以上的白念珠菌（绿、翠绿）、热带念珠菌（蓝）、克柔念珠菌（粉红，模糊有微毛），85%的光滑念珠菌（紫），其它念珠菌呈白色。。30~37℃培养48h后观察结果。念珠菌显色培养基

（CHROMagarCandida）原理51念珠菌李若瑜课件52API—20C酵母鉴定系统为目前所用的已商品化的系统中应用最广泛的酵母鉴定系统。含有20个微小杯形池，其中19个含有脱水的底物，第一个为空白对照，判读反应后结果转为7位数的生物型数码，然后查对数码表做出鉴定。大多数酵母48小时内可鉴定，新生隐球菌和毛孢子菌则需72小时。API—20C象其他商品化的产品一样，需辅以在含1%Tween80和台盼蓝的玉米粉琼脂上生长酵母的显微镜形态。可鉴定16种念珠菌，6种隐球菌和3种毛孢子菌及其它酵母菌共42种。API—20C酵母鉴定系统为目前所用的已商品化的系统中应用最53API—20C酵母鉴定系统API—20C酵母鉴定系统54Vitek2ID-YSTcardsystemVitek2ID-YSTcardsystem55Germtube4hC.albicansC.dubliniensis2-4daysincubation24h48h48hInvitrosusceptibilitytesting经典方法7daysGermtubeC.albicans2-4days562-4天24h48h培养解离离心83%较血培养更早期JClinMicrobiol1984;19:126-8.鉴别培养基2-4天24h48h培养解离离心鉴别培养基57酵母菌鉴定基本流程

酵母纯培养

玉米粉吐温琼脂培养基(25℃)‘

假菌丝（+）假菌丝（-）

厚壁孢子（+）厚壁孢子（-）尿素酶试验（+）尿素酶试验（-）白念珠菌

光滑念珠菌关节孢子（+）关节孢子（-）酵母属芽孢（+）菌落无胡萝卜色菌落呈胡萝卜色芽孢（+）芽孢（-）念珠菌属

红酵母属

毛孢子菌属地霉属咖啡酸试验

有棕色色素无棕色色素

新生隐球菌隐球菌属酵母菌鉴定基本流程

58PCR检测和鉴定多引物多样本制备高敏感度:1-100cells/mlpan-fungalPCR敏感度：100%(多个标本)与治疗一致JClinMicrobiol1997;35:1353-60SPEEDPCR检测和鉴定JClinMicrobiol199759培养后鉴定—分子鉴定PCR-EIARLB,AFLP,SSCP,RAPD基因芯片PNA-FISH(fluorescein-labeledpeptidenucleicacidfluorescentin-situhybridization)26SrRNA,Candidaalbicans,C.glabratasensitivity:100%,specificity:100%

JCM,2002,40:2182-2186培养后鉴定—分子鉴定PCR-EIA60核糖体基因SSU5.8SITS2LSUITS1D1/D2

IGS2IGS15S-Generalpresence(involvedincellreplication).-Notprotein-coding,noevolutionarypressure.-Multicopy.-Nogenefamily.-(Very)variableand(very)conserveddomains.rRNA(rDNA)gene-SmallSubunit(SSU)rDNA(18S)-LargeSubunit(LSU)rDNA(26S,28S)-InternalTranscribedSpacer(ITS)-IntergenicSpacer(IGS)常选用的基因核糖体基因SSU5.8SITS2LSUITS1D1/D2I61HybridizationBufferwithPNAprobe90min.at55℃HybridizationWashsolution30min.at55℃1×WashMountingmedium2min.atRTMounting2min.atRTExaminationPNA-FISHprocedureHybridizationHybridizationBufferwithPNA62Candidaalbicans---

fluoresent(insitu)hybridization(FISH)withSSUrDNAprobeCandidaalbicans---63Zhuetal.AAA.SanFrancisco,9-12thSeptember2004Chipandprobe:Candidaspp.Aspergillusspp.Clinicalsamples:10-20cfu/mlbodyfl