蛋白酶活性电泳实验方案

蛋白酶活性电泳活性电泳(明胶酶谱法)一、试验原理里的明胶，最终用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可消灭白色条带，条带的强弱与酶的量和比活成正比。Triton中震荡洗脱时，由于SDS被Triton结合而去除，从而使酶恢复了活性，此步留意上样缓DTT等复原性物质。过对该位置酶的回收与质谱鉴定，得到该酶局部氨基酸序列。二、材料与方法试剂与溶液配制试剂和仪器：马斯亮蓝R250购自sigma公司，为电泳纯；TritonX-100，CaCl2·2H2O，Brij-3530%丙烯酰胺溶液〔29:1〕，5marker等购自康为世纪公司。水为去离子水或超纯水。milipore超滤管等溶液配制5×SDS-电泳缓冲液94gSDS5.0g，加11-2次，最好使用颖配制的电泳液。明胶储液〔10mg/ml〕10ml4℃。假设凝固成胶冻状可用温水浴解冻。10过硫酸铵〔W/V〕1g10ml442过期会凝胶效果会减弱，可适当增加用量。凝胶配制：10%SDS-凝胶之分别胶〔1.0mg/ml明胶〕dH2O30%丙烯酰胺溶液4×分别胶缓冲液TEMED10mg/ml明胶Total5%浓缩胶的配置dH2O30%丙烯酰胺溶液4×浓缩胶缓冲液TEMED

3ml3.3ml2.5ml0.1ml0.004ml1ml10ml4.56ml1.36ml2.0ml0.1ml0.008ml10mg/ml明胶 0ml Total 8ml配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶轻溶液〔5%〕dH2O30%丙烯酰胺溶液4×分别胶缓冲液TEMED10mg/ml明胶Total

7.25ml2.50ml3.75ml0.1ml0.008ml1.5ml15ml配制梯度胶的丙烯酰胺凝胶重溶液dH2O

15%1.0ml

20%030%丙烯酰胺溶液 7.50ml 10.04×分别胶缓冲液 3.75ml 3.75ml10%过硫酸铵

0.1ml

mlTEMED 0.01ml 0.01ml10mg/ml明胶 1.5ml 1.5ml Total

15ml

15ml1.2.5洗脱液〔1×〕25ml1000ml即可。1.2.6孵育液〔1×〕配法：1Tris6.06gCaCl2·2H2O0.74〔CaCl20.555gBrij-35g800mlHClpH7.61000ml。2)2)40gNaCH3COOH·3H2O溶于适量水，6molCH3COOH168mL，CaCl2·2H2O0.74g〔CaCl20.555g〕，Brij-350.2g，NaCl11.7g800，ml)2gR-2501L100ml异丙醇参加上260ml去离子水，搅拌溶解；用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。1.2.8考马斯亮蓝脱色液〔400ml〕配法：甲醇：乙酸：水=5：1：4。2试验方法蛋白酶样品制备3kD6500rpm浓缩，得到粗酶液，﹣20℃保存。样品液蛋白酶活性的测定〔福林一酚试剂法〕50mg0.2mol/L盐酸溶Tris-HCl(pH9.0)100mL，分别配成0-100l0.4mol/L5l波长比色，测光密度酸的微克数为横坐标，绘制标准曲线。同时作比照管。酶量定义为一个酶活力单位(U)。。F为酶液最终稀释倍数，15为反响时间(分钟)。调整样品液的浓度，计算出凝胶电泳所需酶量〔约200U〕，假设样品液比活不够高，须进一步浓缩以提高样品比活，或适当提高加样量。活性胶操作步骤〔gelatinzymogram〕配胶高浓度丙烯酰胺溶液内参加蔗糖可以稳定梯度的形成。操作步骤：可使用蠕动泵)。TEMED1mm厚的小板胶约需要轻重溶1mmTEMED并混匀。3〕关闭梯度混合器的输出阀和两液槽间的连通阀，在贮液槽中参加定量的凝胶轻溶防止堵塞。4〕在混合槽中参加等量凝胶重溶液，完全翻开连通阀，开启磁力搅拌器，调整转速至复性。5〕翻开几毫升轻溶液不致过快流入凝胶夹层影响梯度形成。1ml1h充分聚合。灌制浓缩胶，预备样品，加样进展电泳。留意：一次可同时跑两板胶，配胶时一板为添加明胶的活性胶，一板为无明胶的一般胶，配胶过程尽量全都，一般胶做比照。上样，样品与非复原性上样缓冲液混合，室温静置10min，不能加热。完毕。活性胶的处理直接酶谱法1)pH5%-20%，电泳完毕后，洗脱，漂洗；pH503h；考马斯亮蓝R-250染2〕活性胶孵育最正确时间最适pH孵育液内，分别孵育1h、3h、6h、12h。孵育完毕后操作同上。3〕蛋白酶电泳后位置的标定A111pH孵育液BC胶蛋白条带进展比照，确定ＡＢ胶亮带对应的蛋白酶在Ｃ胶中的或许位置。4〕将Ｃ胶中亮带对应的位置四周几条蛋白条带分别切下，回收。操作见表1。pHpH4.0pH7.0pH8.5pHpH4.0pH7.0pH8.53h3h3h浓SDS水漂洗度A5%-振荡洗脱20min〔明胶〕20%30min×2×21h1hA梯度活性凝胶5%-〔明胶〕 20%振荡洗脱20minpH8.53h6h12h〔明胶〕明胶〕明胶〕5%-20%5%-20%5%-20%振荡洗脱振荡洗脱20min20minpH8.53h2%2h，pH8.53h直接染色活性胶孵育最适pH由图1看出pH8.5的条件下，凝胶中的酶与底物明胶反响生成的条带数量最多，亮度最大。1pH孵育条件下明胶活性电泳的差异1、2、3pH4.0、7.0、8.53小时的条带活性胶孵育最正确时间2得出，在pH8.5条件下，随孵育时间延长条带数增多，孵育4h后，条带3h效果最好，条带数最多且条带清楚。2pH8.5孵育不同时间下明胶活性电泳的差异1、2、3、48.51h、2h、3h、4h的条带 A B3SDS-结果BSDS-复性浸泡酪蛋白孵育结果争论从明胶活性电泳结果可以看出，粗酶液中含有多种蛋白酶，但大局部条带结果〔3A〕看，对应位置上并无蛋白亮带，复性后浸泡酪蛋白孵育也无亮带。References:JE.科林根等，精编蛋白质科学试验指南,Dass,S.B.andC.G.Dosoretz,etal.(1995).“Extracellularproteasesproducedbythewood-degradingfungusPhanerochaetechrysosporiumunderligninolyticandnon-ligninolyticconditions.“Archivesofmicrobiology163(4):254-258.Liota,L.A.andW.G.Stetler-Stevenson(1990)CancerBiology,1,96-106Mitsuhashi,W.andA.Oaks(1994).“Developmentofendopeptidaseactivitiesinmaize(ZeamaysL.)endosperms.“Plantphysiology104(2):401-407.Morikawa,M.andY.Izawa,etal.(1994).“Purif