蛋白质组学广州中医药大学课程课件

Proteome&ProteomicsProteome&Proteomics1Proteome&Proteomics定义Proteome：1994年，由澳大利亚Macguarie大学的Wilkins等首先提出：“蛋白质组指的是一个基因组所表达的全部蛋白质”(proteomeindicatestheproteinsexpressedbyagenome)“proteome”是由蛋白质一词的前几个字母“prote”和基因组一词的后几个字母“ome”拼接而成蛋白质组(Proteome):细胞内的全部蛋白质Proteome&Proteomics定义Proteo2Proteomics定义蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研究细胞内所有蛋白质及其动态变化规律的科学最早是在1995年提出的，它在本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质特征：表达水平（量）翻译后的修饰（成熟与调控）蛋白与蛋白相互作用（信号通路）等由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识Proteomics定义蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，研3Proteome与Genome关系互补的角度/空间来研究细胞的分子架构相辅相成Genome导演 RNome编剧 Proteome演员Proteome与Genome关系互补的角度/空间来研究4Proteome与Genome区别稳定性Proteome静态Genome动态修饰化程度Proteome高Genome底复杂程度Proteome高（20aa+高度多样性修饰）Genome底（4nt）特异性Proteome组织和细胞特异性Genome无组织和细胞特异性Proteome与Genome区别稳定性5功能蛋白质组(functionalproteome)1997年，由Cordwell和Humphery-Smith提出的，它指的是在特定时间、特定环境和实验条件下基因组活跃表达的蛋白质。功能蛋白质组只是总蛋白质组的一部分，通过对功能蛋白质组的研究，既能阐明某一群体蛋白质的功能，亦能丰富总蛋白质数据库，是从生物大分子(蛋白质、基因)水平到细胞水平研究的重要桥梁环节。功能蛋白质组(functionalproteome)1996功能蛋白质组功能蛋白质组7蛋白质组学研究思路与方法策略、技术、工具蛋白质组学研究思路与方法策略、技术、工具8蛋白质组研究相关网站蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术蛋白质组研究技术、信息等发现新蛋白及新作用(新药开发)蛋白质组研究相关企业、各种仪器来源、新闻等teome.co.uk各种蛋白质组研究相关信息http://www.micromass.co.uk介绍蛋白质鉴定的先进仪器http://www.expasy.ch

蛋白质鉴定专家系统，SwissInstituteofBioinformatics.au

蛋白质鉴定专家系统，AustralianProteomeAnalysisFacilityhttp://expasy.cbr.nrc.ca

蛋白质鉴定专家系统，CanadianBioinformaticsResours蛋白质组研究相关网站蛋白质组学研究依赖生物信息学和网络技术9主要专业术语及其英文对照和缩写IPG-IEF：固相pH梯度等电聚焦（immobilizedpHgradientsisoelectricfocusing）SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（Sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegelelectrophoresis）2-DE：双向电泳(TwoDimensionalElectrophoresis)HPLC：高效液相色谱（HighperformanceLiquidChromatography）MALDI-TOFMS：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MatrixAssistedLaserDesorption/IonizationTime-of-FlightMassSpectrometry)主要专业术语及其英文对照和缩写IPG-IEF：固相pH梯度等10研究策略与技术两条互补的实验流程基于凝胶的工作流程 （Gel-basedworkflow）基于液相色谱的工作流程 （LC-basedworkflow）研究策略与技术两条互补的实验流程11蛋白质组学实验室所需的条件蛋白质组学实验室所需的条件12双向凝胶电泳（2DE）是等电聚焦电泳和SDS的组合即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离）然后再进行SDS（按照分子大小）凝胶经染色得到二维分布的蛋白质图双向凝胶电泳（2DE）是等电聚焦电泳和SDS的组合13蛋白质组研究的基本技术2D-SDS：样品制备第一向IPG-IEF电泳IPG平衡第二向SDS电泳染色（银染）及图谱分析目标蛋白获取及其鉴定（MC分析）蛋白质组研究的基本技术2D-SDS：142DE结果图谱2DE结果图谱15蛋白质组研究的基本技术样品预分离样品的制备（预处理）：组织细胞细胞器（线粒体、叶绿体、细胞核）蛋白质组研究的基本技术样品预分离样品的制备（预处理）16蛋白质组研究的基本技术蛋白提取重要性：在制备时丢失的蛋白永远不能在后面实验中弥补把蛋白质看作具有独特而奇妙性质的实体原则：使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白蛋白质组研究的基本技术蛋白提取重要性：17蛋白质组研究的基本技术蛋白提取步骤：破碎沉淀蛋白去除杂质蛋白质组研究的基本技术蛋白提取步骤：18蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程破碎

尽可能减少蛋白水解/其它形式蛋白降解原则机械法（超声波法、高压法、机械匀浆法）化学法（去污剂法、酶裂解法）物理法（液氮研磨法、循环冻融法、渗透 法、玻璃珠破碎法）蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程19蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程沉淀蛋白

去杂浓缩后蛋白可溶性是关键

TCA-丙酮沉淀法

三氯醋酸（TCA）沉淀法–引起降解/修饰丙酮沉淀法硫酸铵沉淀法–影响IEF醋酸铵沉淀法–步骤繁琐

蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程202D电泳结果影响因素分析2D电泳结果影响因素分析21蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程去除杂质

关键是尽量不丢失蛋白和减少蛋白修饰

核酸的清除（DNase/Rnase）多糖的清除（超离心、TCA沉淀等）去污剂的清除（丙酮沉淀法等）盐离子和外源带电小分子的清除（透析、TCA-丙酮沉淀法）蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备流程222D电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：TCA残留致使Pr丢失2D电泳结果影响因素分析可能原因：样品含高丰度Pr可能原因：232D电泳结果影响因素分析可能原因：Tris质量不好可能原因：Urea不纯2D电泳结果影响因素分析可能原因：Tris质量不好可能原因：24蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备注意事项：蛋白质水解蛋白酶抑制剂(PMSF等)特殊样品的制备(低丰度、强碱性蛋白质（核糖体）、极端分子量)样品定量重复性蛋白质组研究的基本技术蛋白提取样品制备注意事项：252D-SDS重复性Thesameprotocolandsample,howevernotthesameresultsRec:similar;cir:different2D-SDS重复性Thesameprotoco262-DE第一向IPG-IEF电泳IEF是一种根据样品的等电点不同而使它们在pH梯度中相互分离的一种电泳技术将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带从而得知其等电点信息2-DE第一向IPG-IEF电泳27IEF的基本条件step1step2step3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmstep1step2step3totaltotalstep1step2step311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapidIEF的基本条件step1step2step3tota28IPG-IEF电泳IPG-IEF电泳292-DE第二向垂直SDS电泳聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构，具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。SDS与蛋白质形成雪茄状带负电荷复合物，从而消除了蛋白间的电荷及形状差异，电泳速度仅与分子量有关

从而得知其分子量信息2-DE第二向垂直SDS电泳30第二向垂直SDS电泳凝胶浓度与其对应的分离范围胶浓度分离范围(KD)5%36-2007.5%24-200

10%14-20012.5%14-10015%14-60第二向垂直SDS电泳凝胶浓度与其对应的分离范围31第二向垂直SDS电泳步骤：溶液配置(Buffer、Bis-Acr、AP、TEMED)灌胶电泳EttanDalttwelve电泳系统第二向垂直SDS电泳步骤：EttanDaltt32第二向垂直SDS电泳EttanDaltsix电泳系统第二向垂直SDS电泳EttanDaltsix电332-DE凝胶蛋白质斑点的检测染色：

1）考马斯亮兰染色法；

2）银染法；3）负染法；4）荧光染色法；5）放射性同位素标记法等2-DE凝胶蛋白质斑点的检测染色：342-DE凝胶蛋白质斑点的检测图像扫描和分析——ImageScannerII2-DE凝胶蛋白质斑点的检测图像扫描和分析——Image352-DE凝胶蛋白质斑点的检测全自动斑点切取系统（EttanSpotPicker）

2-DE凝胶蛋白质斑点的检测全自动斑点切取系统（Ettan362-DE凝胶蛋白质斑点的检测质谱或MALDI-TOFMS质谱分析基本原理是使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器，利用电场和磁场使发生相反的速度色散——离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量。2-DE凝胶蛋白质斑点的检测质谱或MALDI-TOFMS372-DE凝胶蛋白质斑点的检测MALDI-TOFMS样品溶于固定的底物中形成晶体，用激光脉冲使其离子化，离子被加速后通过飞行管时分离，所有离子均可被检测，常用来测蛋白质、多肽、核酸和多糖等生物大分子2-DE凝胶蛋白质斑点的检测MALDI-TOFMS382-DE凝胶蛋白质斑点的检测通过质谱分析，可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息SARS病毒N蛋白整体分子量2-DE凝胶蛋白质斑点的检测通过质谱分析，可以获得分析样品39蛋白质功能研究技术蛋白质功能研究技术40蛋白质功能研究技术酵母双杂交蛋白质功能研究技术酵母双杂交41蛋白质功能研究技术Co-IP技术蛋白质功能研究技术Co-IP技术42蛋白质功能研究技术Co-IP&Pulldown蛋白质功能研究技术Co-IP&Pulldown43蛋白质组在医学研究中

的现状和前景蛋白质组在医学研究中

的现状和前景4