羟苯磺酸钙对2型糖尿病大鼠视网膜病变的干预作用

羟苯磺酸钙对2型糖尿病大鼠视网膜病变的干预作用

糖尿病性视网膜病变（parkinson）是糖尿病最常见、最严重的微血管并发症之一。这是世界上最常见和最严重的视觉缺陷和昏迷。1材料表面1.1实验动物SPF级SD大鼠72只,体重230~270g,安徽省实验动物中心,许可证号SCXK(皖)2005-001,室温20~26℃,相对湿度为40%~70%,昼夜明暗交替,自然通风加机械排风饲养。1.2试剂盒和试剂链脲佐菌素(STZ)购自Sigma公司,批号S8060;丙二醛(MDA,批号20101221)、超氧化物歧化酶(SOD,批号20101220)、谷胱甘肽(GSH,批号20101118)试剂盒购自南京建成生物工程研究所;血管内皮生长因子(VEGF)、糖基化产物(AGEs)一抗及SABC显色试剂盒均购自北京博奥森。日立7020全自动生化分析仪;岛津MK3酶标仪;BX51Olympus荧光显微镜;莱卡TP1020脱水机。2方法2.1高脂饲料+普通饲料低脂饲料适应性饲养3d后,72只大鼠随机分成2组,正常组22只,造模组50只,正常组普通饲料喂养,造模组高脂饲料(猪油、鸡蛋、蔗糖、胆固醇混合,2mL/只)+普通饲料喂养。3个月后,每只大鼠ipSTZ45mg·kg2.2指标测定2.2.1大鼠视网膜中sod,mda,gsh的检测实验动物于给药周期结束后摘除眼球,每组取10只大鼠的眼球做组织匀浆或离心后的上清液,紫外分光光度计法检测SOD,MDA,GSH的含量。2.2.2视网膜pas染色实验各组取4只大鼠眼球固定于10%甲醛溶液48h,去除眼前节成眼杯,桔瓣样将眼杯切成3块,分离出视网膜,水中冲洗24h,置入3%胰蛋白酶(Serva1:250)溶液中,于37℃条件下消化1~3h。当视网膜组织溶解后,将标本轻轻移入蒸馏水中,轻轻摇动,将视网膜内界膜及残存视网膜神经成分等组织完全脱去,仅剩下一层透明的视网膜血管网,水洗移至载玻片上平铺,自然干燥,常规PAS染色。显微镜观察,在400倍下每个标本任选一根视网膜主动脉干、从中心到外周成S形记数1000个毛细血管细胞(包括内皮细胞E与周细胞P)并计算其比值E/P。2.2.3用免疫组织化学法检测vegf和ages每组取8只大鼠眼球于40g·L2.2.4统计处理采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行处理,数据以x珋±s的形式表示,用t检验分析。P<0.05有统计学意义。3结果3.1两组含量比较模型组SOD的活力,GSH,MDA的含量与正常组比较有显著性差异。羟苯磺酸钙组SOD的活力与模型组相比有显著性差异,但GSH,MDA含量差异不明显。见表1。3.2糖尿病大鼠视网膜血管形态的变化正常大鼠视网膜血管网完整,视网膜毛细血管管径粗细均一,走向较直。毛细血管内由周细胞和内皮细胞2种细胞成分组成,内皮细胞,位于毛细血管中央,核较大,椭圆形或不规则形,染色稍浅;周细胞,多位于毛细血管一侧,核体积较小,染色深。糖尿病大鼠均出现了不同程度的视网膜血管形态改变,如毛细血管网排列紊乱,走向不规则,多根毛细血管扭曲成丛;毛细血管管腔粗细不等,或节段膨大,呈囊样扩张;周细胞核明显固缩,数目显著减少,内皮细胞明显增生。羟苯磺酸钙组治疗2个月后,视网膜A,V间毛细血管网排列非常紊乱,扭曲,局部无细胞毛细血管连成网,但整体血管改变较模型组明显减轻。见图1。3.3膜合板中皮细胞e和周细胞p的计数，以及网络消化试验中的e.p比较数量和e.p比较3.4免疫组织化学法检测vegf蛋白表达正常对照组VEGF免疫阳性反应分布于靠近视网膜内核层的少数神经节细胞的胞浆中;DM组内核层及神经节细胞层的表达增强,胞质呈棕黄色,且阳性反应细胞数增多。而羟苯磺酸钙灌胃组VEGF免疫阳性仅见神经节细胞胞质中,阳性细胞数明显少于DM组,且较正常对照组阳性细胞数增多。正常组AGEs免疫阳性反应分布于神经纤维层及神经节细胞层;DM组内核层及神经节细胞层的表达明显增强,胞质呈深棕黄色,阳性反应细胞数增多;羟苯磺酸钙灌胃组内核层及神经节细胞层的表达较模型组变化不大,较正常组阳性细胞数增多。见表3。4视网膜病变模型糖尿病视网膜病变(DR)是在糖尿病(DM)基础上发展而来的,但得到与人类2型糖尿病DR相同的动物模型却较困难。本研究将高脂高糖饲料与药物干预相结合,采用SD大鼠以高脂高糖饲料喂养一段时间后产生胰岛素抵抗,再给予的STZ,诱导出病理、生理改变都接近于人类2型DM的动物模型。最终形成DR。视网膜微循环内屏障的破坏和血管通透性增加是糖尿病视网膜病变的标志之一细胞因子VEGF是目前发现的最重要最直接的刺激血管因子氧自由基主要包括有超氧阴离子、过氧化氯和羟自由基等活性氧。本研究通过检测SOD,GSH,MDA,结果表明模型组视网膜氧自由基产生过多且机体清除自由基能力下降,这些指标的改变与2型糖尿病视网膜病变患者的生化特征类似。药物组SOD的活力与模型组比较增强,说明羟苯磺酸钙对SOD的活力可能存在一