细菌内毒素测定技术-鲎试剂灵敏度复核和方法验证试验

知识点：鲎试剂灵敏度复核试验一、鲎试剂及鲎试剂灵敏度鲎血含铜蓝蛋白，呈蓝色。鲎试剂由鲎血制备而成，是从鲎血的变形细胞裂解物中提取制备而来。鲎试剂根据鲎的种类不同科分为美洲鲎试剂、中国鲎试剂、圆尾鲎试剂；根据鲎试剂和细菌内毒素反应的专一性不同，可分为普通鲎试剂和特异性鲎试剂。

知识点：鲎试剂灵敏度复核试验鲎试剂的规格指每支鲎试剂的装量，一般来说，规格是多少，就用多少细菌内毒素检查用水复溶试剂使用。在细菌内毒素检查的规定条件下使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。知识点：鲎试剂灵敏度复核试验

二、鲎试剂灵敏度的复核在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。复核的目的不仅是考察鲎试剂的灵敏度是否准确，也是考察检验人员操作方法是否正确及试验条件是否符合规定。知识点：鲎试剂灵敏度复核试验

（一）稀释标准内毒素根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作用细菌内毒素检查用水溶解，制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ四种浓度的内毒素标准溶液，每一浓度平行做4管，另外2管阴性对照（共18管）。37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否变形和滑落判断试验结果。注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果。知识点：鲎试剂灵敏度复核试验（二）结果判断：

若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。结果计算：

反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1（∑X/4）

式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。知识点：鲎试剂灵敏度复核试验当λc在0.5λ~2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于内毒素检查。但是注意要以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。

知识点：干扰试验一、干扰试验是为了确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和鲎试剂的反应不存在干扰作用，为产品能否用细菌内毒素检查法提供依据，并且验证供试品的配方和工艺有变化，鲎试剂来源改变或供试品阳性对照结果呈阴性时，供试品是否存在干扰作用。

使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过所使用的鲎试剂的最大有效稀释倍数的溶液。

知识点：干扰试验用内毒素检查用水和供试品将同一支内毒素标准品按下表制备溶液A、B、C和D。同时制备2支供试品阴性对照和2支阴性对照。二、凝胶法干扰实验溶液的制备知识点：干扰试验三、结果判断：

当供试品阴性对照和水阴性对照都为阴性，并且细菌内毒素检查用水溶解的内毒素系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度复核范围内时，试验方为有效。知识点：干扰试验

分别计算用检查用水制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es）和用供试品溶液或稀释液制成的内毒素标准溶液的反应终点浓度的几何平均值（Et）Es=lg-1(ΣXs/4)Et=lg-1(ΣXt/4)知识点：干扰试验

当Es在0.5λ和2λ（包括0.5λ和2λ）之间、Et在0.5Es至2Es(包括0.5Es和2Es）之间时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。三、光度测定法干扰试验选择标准曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度（设为λm），作为供试品干扰试验中添加的内毒素浓度。按表制备溶液A、B、C和D。编号内毒素浓度被加入内毒素的溶液平行管数A无供试品溶液至少2B标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm）供试品溶液至少2C至少3个浓度（最低一点设定为λ）检查用水每一浓度至少2D无检查用水至少2A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液。B为加入了标准曲线中点或靠近中点的一个已知浓度内毒素的，且与溶液A有相同稀释倍数的供试品溶液。C为如“标准曲线的可靠性试验”项下描述的，用于制备标准曲线的标准内毒素溶液。D为阴性对照。

知识点：干扰试验二、计算

按所得线性回归方程分别计算出供试品溶液和含标准内毒素的供试品溶液的内毒紊含量Ct计算该试验条件下的回收率（R）。

知识点：干扰试验三、结果判断：当内毒素的回收率在50％～200％之间，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。反之，须按“凝胶法干扰试验”中的方法去除干扰因素，并重复干扰试验。

技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程一、灵敏度复核的操作

1．

取分装有0.1ml鲎试剂溶液的l0mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管分别加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液，每一个内毒素浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程

2、将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放人37℃±1℃的恒温器中，保温60分钟±2分钟。

3、将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180度，从凝胶是否变形和滑落判断试验结果。注意保温和拿取试管的过程应避免受到振动造成假阴性结果。

技能点：鲎试剂灵敏度复核试验操作规程3、结果判断：

若最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照管为阴性，试验方为有效。4、结果计算：

反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的测定值（λc）。λc=lg-1（∑X/4）

式中X为反应终点浓度的对数值。反应终点浓度是指系列递减的内毒素