微生物数量检验技术-计数方法的验证

项目八微生物数量检查技术任务4计数方法的验证技能点3更年宁微生物总数检查方法验证3更年宁微生物总数检查方法验证3.1实训目的了解供试品特性及其微生物总数限度标准。熟悉微生物总数检查方法验证用菌液的制备方法。掌握方法验证的操作步骤并能对验证结果做出准确判断。3.2实训要求严格遵守实训室管理规章制度。按照实训计划进行操作。认真分析和讨论实训中出现的问题。尊重实训结果的科学性。完成实训任务,达到实训目的。

更年宁微生物总数检查方法验证3.3实训内容3.3.1实验环境无菌室、超净工作台。3.3.2设备、仪器仪器、试剂、菌种及培养基设备恒温培养箱30～35℃、生化培养箱23～28℃、匀浆杯。仪器菌落计数器、锥形瓶(250～300ml,500ml,1000ml)、培养皿(直径

9cm)、带塞试管(18mmx180mm,28mm×198mm)、吸管(1ml分度0.01,10ml分度0.1)。玻璃器皿均于高压蒸汽121℃灭菌30min,烘干。用具白金耳、酒精灯、灭菌剪刀和镊子、试管架、火柴、记号笔、白瓷盆、实验记录纸

更年宁微生物总数检查方法验证3.3.3试剂0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、靛基质试液3.3.4验证用菌种及培养基大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念球菌、黑曲霉菌;营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖增菌液、乳糖胆盐发酵培养基、MUG培养基、甘露醇氯化钠琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、改良马丁琼脂培养基

更年宁微生物总数检查方法验证3.4实验步骤3.4.1菌液制备取经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物2～3白金耳加入9ml0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数用。取经25℃培养18～24h的白色念珠菌液体培养物2～3白金耳加入9m10.9%

氯化钠溶液中,10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数备用。取经培养1周的黑曲霉斜面培养物,加0.9%氯化钠溶液3ml,洗下霉菌孢

子,取0.1ml加入9ml0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-3～10-7约为50～100cfu/ml,做活菌计数备用。更年宁微生物总数检查方法验证3.4.2操作方法供试液制备取本品10g置匀浆杯中，加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、靛基质试液100ml,以4000r/min开机2min,即为1:10的供试液。验证方法采用常规法。验证试验分4组,至少应进行3次独立的平行试验,并分别计算供试品组和对照组试验的菌回收率。菌液组:分别取上述5种菌液1ml,注入平皿中,倾注培养基,待凝后,置规定温度培养24～72h,观察结果并计数。供试品对照组:取1：10供试液1m注入平皿中,倾注培养基,待凝后,置规定温度培养24～72h,观察结果并计数。

更年宁微生物总数检查方法验证试验组:取供试液1ml按供试品对照组同法操作,同时每个平皿加入50～100cfu相应试验菌1ml,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24～72h,观察结果并计数。稀释剂对照组:取相应的稀释剂1ml注入每个平皿中,并加入50~100cfu相应

试验菌1ml,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24～72h,观察结果并计数。3.5注意事项检验全过程要严格遵守无菌操作。吸取供试液时要先摇匀。供试液从制备到加入培养基不能超过1小时。更年宁微生物总数检查方法验证项目八微生物数量检查技术任务4计数方法的验证知识点4计数方法的验证步骤4计数方法的验证步骤4.1验证目的为了使微生物学检验方法的结果准确可靠，需要对每个品种的具体检验方法进行验证。

计数方法的验证步骤4.2验证的影响因素：药品本身的抑菌性药品中防腐剂的抑菌性培养基的促菌生长能力培养条件（温度、湿度及需氧或厌氧）过滤系统的材质计数方法的验证步骤4.3验证用菌试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌种为第0代)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。大肠埃希菌(

Eerhenichin

co)；金黄色葡萄球菌(

Staphylococcus

aureus)；乙型副伤寒沙门菌(

Salmonella

paratyphi

B)；枯草芽泡杆菌(

Bocillus

subtilis)；白色念珠菌(

Candida

albicans)；黑曲霉(

Spergillus

niger)。

计数方法的验证步骤4.4菌液制备接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，培养24～48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1m含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养5-7天，加入3～5ml含0.05%(m/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2h内使用；若保存在2～8℃，可在24h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2~8℃，在验证过的贮存期内使用。计数方法的验证步骤4.5验证方法验证试验分4组，至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算供试品组对照组和试验组的菌回收率。4.5.1试验组

取最低稀释级的供试液，按每1ml供试液加入50～100cfu试验菌，按菌落计数方法定其菌数。平皿法计数时，取试验菌液、供试液各1m分别注入平皿中，立即倾注球脂培养基：薄膜过滤法计数时，取供试液2ml过滤，冲洗液冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入试验菌。4.5.2菌液组取上述试验菌液，测定其加入的试验菌菌数。4.5.3供试品对照组取最低稀释级的供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

计数方法的验证步骤4.5.4稀释剂对照组为考察供试液制备过程中对微生物影响的程度，可用相应的稀液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml含50～100cfu，按供试品组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。4.6回收率计算计数方法的验证步骤4.7结果判定在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌数回收率(稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率)应均不低于70%。若试验组的菌数回收率(试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率)均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌数回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。计数方法的验证步骤4.7结果判定若没有适宜的方法消除供试品的抑菌活性，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规