控制菌及螨类检查技术-药品中梭菌检查

项目九控制菌检查及螨类检查技术任务9药品中梭菌检查知识点9药品中梭菌检查方法9.1梭菌梭菌属去称为棱状芽孢杆菌属，菌体1µm×5µm左右，革兰阳性杆菌，能形成芽孢。芽孢多大于菌体的宽度，细菌膨胀呈梭型，故名梭状芽孢杆菌。该菌属中主要病原菌有产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌和艰难梭菌，均能产生强烈的外毒素使人和动物致病。因此，对于某些用于阴道、创伤、溃疡的药品，必须控制校菌。检查梭菌的方法主要是增菌产毒培养和镜检形态观察，必要时做分离培养后再行鉴定。9.1.1形态特征

梭菌属为革兰阳性菌，通常以周生鞭毛运动，个别种，如产气荚膜梭菌无鞭毛，不运动，但能形成荚膜。大部分菌体呈杆状或稍弯曲，两端钝圆或平直形成的芽孢比菌体宽，在菌体的中央或近端，少数菌种的芽孢在菌体顶端如鼓槌状，但多数芽孢使菌体中部膨大呈梭形。药品中梭菌检查方法9.1.2培养特征

大多数为专性厌氧，大多数种在pH6.5～7.0,30～37℃生长最快，在庖肉培养基中，肉汤浑浊，肉渣部分被消化，微变黑，产生气体，生成甲基硫醇及硫化氢。9.1.3生化反应

生化反应极不活泼，一般不发酵糖类，能液化明胶，产生硫化氢形成吲哚，不能还原硝酸盐为亚硝酸盐，对蛋白质有微弱消化作用。9.1.4抵抗力

对环境抵抗力很强，有的芽孢可以在土壤中存活数十年。多数菌对磺胺药、青霉素等较为敏感，但对新霉素，卡那霉素和多黏菌素等不敏感。药品中梭菌检查方法9.2检查程序供试液的制备见“药品中微生物总数的检查”。阳性对照试验：供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验，阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查。阳性对试验应检出相应的控制菌。阳性对照试验的目的：检查供试品是否有抑菌作用及培养条件是否适宜。阴性对照试验：取稀释剂10ml加入100ml(或200m1)相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。

阴性对照试验的目的：检查稀释剂是否满足无菌要求及培养条件是否适宜。药品中梭菌检查方法9.2.1厌氧培养装置的准备

除商品厌氧培养袋、箱、罐按使用要求准备外，试验室亦可用真空干燥器、标本瓶或其他适宜容器替代使用，可选用下列一种方法制备厌氧条件。9.2.1.1冷触酶法

临用前，取试管或其他适宜容器3支,1支称入硼酸氢钠0.22g(以厌氧培养容器容积1L计),1支称取枸橼酸0.33g、碳酸氢钠0.37g，另1支放入经活化的钯粒约1g，与接种后的供试品培养管(或平板)及厌氧指示剂管1支，同时置于厌氧培养容器，随即各加水5m1于前2支管(或容器)中，迅速密封容器盖。钯粒为覆盖钯的氧化铝的球状或条状颗粒(有商品出售)，用前须经160℃干烤2h，或在电炉上灼烧5min使其活化。由于每用一次便失去催化性，因此，再次使用时须按上法活化后方能使用。将钯粒若干置室温水中，附有大量气泡者为活性良好，可直接使用。此法可作为钯粒的活性检查。

药品中梭菌检查方法9.2.1.2焦性没食子酸法

用前取培养皿或其他适宜容器1支，加入焦性没食子酸10g及无水碳酸钠5g(以厌氧容器容积LL计)，与接种后的供试品培养管(或平板)及厌氧指示剂管1支同时置于厌氧容器内，迅速密封容器盖9.2.2增菌培养

取供试液10ml(相当于供试品1g或lm)4份，其中2份置80℃保温10min后迅速冷却。上述4份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中，其中2份(直接1份，处理后1份)校菌增菌培养管中分别加入阳性对照菌(10～100cfu)。置厌氧条件下培养48h。9.2.3分离培养

取上述每一培养物0.2ml，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养48～72h。若供试品平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若供试品平板上有菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。

药品中梭菌检查方法9.2.4革兰染色镜检

取疑似菌落涂片，作革兰染色、镜检，观察染色及菌体特征。本菌形态特征较为典型。培养后形成的芽孢，初呈“火柴头”状卵圆形，继而膨大呈球形，在菌体末端如鼓槌状。培养时间至72h以上时，菌体可自溶而消失，仅见游离的芽泡囊，一般染色时呈圆圈状。染色镜检有卵圆形至球形的芽孢，大于菌体，着生于菌体中央、次端或顶端，为梭菌典型形态。9.2.5过氧化氢酶试验

加一滴3%过氧化氢溶液至琼脂表面的单个分散的菌落，或转移至载玻片的菌落上。有气泡形成表示过氧化氢酶反应阳性，梭菌应成阴性结果，可用枯草芽孢杆菌作为阳性反应对照菌。9.3结果判断

若上述可疑落为革兰阳性棱菌，有或无卵圆形成球形的芽孢，过氧化氢酶试验阴性，判供试品检出梭菌，否