典型产品的分离纯化工艺-盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定（药物分离纯化课件）

药物分离与纯化技术课程典型产品的分离纯化工艺--盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺大纲1.实验目的与要求2.实验原理3.仪器与试剂4.实验内容及步骤5.结果与分析盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（一）实验目的与要求1．学习生物碱的初步提取分离方法。2．掌握利用柱层析分离纯化、薄层层析鉴定药用植物成分的方法。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（二）实验原理

生物碱是植物中含氮的碱性有机化合物,大都有明显的生理活性,是许多中草药中的有效成分。生物碱在植物体内一般均与有机酸或无机酸结合成盐而存在,只有弱碱性生物碱呈游离状态,还有一些是与糖结合成苷而存在。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（二）实验原理小檗碱又名黄连素。黄连属植物的根茎、须根、叶中等都含有小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马亭等生物碱,我国黄连药材产量占世界第一位。本实验用小檗属植物三颗针或黄连属黄连作为提取小檗碱的原料;盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（二）实验原理小檗碱是一种季铵碱,其游离碱为黄色针晶,微溶于水,能溶于热水和乙醇中，难溶于苯、丙酮、氯仿，几乎不溶于石油醚。小檗碱与氯仿、丙酮、苯在碱性条件下均能形成加成物。

小檗碱盐酸盐难溶于冷水，易溶于热水；硫酸盐易溶于水。

溶解度分别为:小檗碱,1∶２０（冷水）,1∶100(冷乙醇);盐酸盐,1∶500(冷水);硫酸盐,1∶30(冷水),利用这些特性提取盐酸小檗碱。盐酸小檗碱盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺仪器：层析柱、研钵、烧杯、硅胶薄层板、滤纸、抽滤装置、紫外灯、层析缸等试剂与样品：黄连根粉,0.5%硫酸，石英砂，脱脂棉，石灰乳，10%盐酸，浓盐酸，氧化铝，95%乙醇，无水乙醇，10％氢氧化钠溶液,滤纸，硅胶，氯仿-氨-甲醇(30∶1∶8),氯仿-乙醇-0.1mol.L－1

盐酸(1∶1∶1，下层)（三）仪器与试剂盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤1.小檗碱粗品的制备方法一：

黄连根粉(过20目筛)20g,以0.5%硫酸适量润湿,拌以50g石英砂,混匀,装入底部塞有脱脂棉的层析柱中,关闭活塞。加入适量0.5%硫酸,使之浸没药面,浸泡一昼夜。逐渐加入0.5%硫酸即开始渗漉,约收集200mL溶液。再用150mL左右0.5%硫酸浸泡一天并渗滤。收集液用石灰乳中和多余硫酸,调pH＝7,滤除沉淀,向滤液中加5%量食盐至饱和,并以10%盐酸调至pH2-3,静置(过夜),滤出沉淀。并用少量水洗涤。向沉淀中加适量热水溶解,用石灰乳调节pH8.5-9.8,趁热滤除杂质,滤液在搅拌下加浓盐酸至pH2,冷却静置,滤取析出的沉淀,水洗涤至中性,抽干。50℃以下干燥,即为盐酸小檗碱粗品(成品)。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤1.小檗碱粗品的制备方法二：

取黄连根粉(过20目筛)20g,置于500mL烧杯中，加入8倍量0.5%硫酸水溶液使之浸没药面,浸泡24h，用脱脂棉过滤。滤液加石灰乳中和多余硫酸,调pH＝12,静置30min，滤除沉淀,滤液用10%盐酸调至pH2-3,再向滤液中加10%（W/V）量食盐,搅拌使完全溶解后，继续搅拌至溶液出现为混浊现象为止，静置(过夜),滤出沉淀。并用少量水洗涤至中性,抽干。50℃以下真空干燥,即为盐酸小檗碱粗品。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤1.小檗碱粗品的制备方法二：

取黄连根粉(过20目筛)20g,置于500mL烧杯中，加入8倍量0.5%硫酸水溶液使之浸没药面,浸泡24h，用脱脂棉过滤。滤液加石灰乳中和多余硫酸,调pH＝12,静置30min，滤除沉淀,滤液用10%盐酸调至pH2-3,再向滤液中加10%（W/V）量食盐,搅拌使完全溶解后，继续搅拌至溶液出现为混浊现象为止，静置(过夜),滤出沉淀。并用少量水洗涤至中性,抽干。50℃以下真空干燥,即为盐酸小檗碱粗品。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤2.盐酸小檗碱精制方法二所得小檗碱还需精制。取所得粗品(未干燥)放入20倍量沸水中，搅拌溶解后，继续加热数分钟，趁热过滤。滤液滴加一滴浓盐酸，静置(过夜),滤取结晶，用蒸馏水洗数次,抽干，50℃以下真空干燥，即为精制盐酸小檗碱。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤3.氧化铝柱层析分离纯化盐酸小檗碱①氧化铝层析柱制备:取一支2.0cm×30cm层析柱,柱底覆盖少许脱脂棉,柱内加入一定体积95%乙醇,打开活塞,让溶液慢慢流出。此时将已搅拌混均的氧化铝95%乙醇悬液(层析氧化铝120-140目,25-30g)不断加入层析柱内,至加完后,轻敲柱体,使各部分氧化铝均匀紧密一致。待氧化铝沉降稳定(表面应平整),表面保持有少量溶剂(0.5cm左右)，关闭活塞。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤3.氧化铝柱层析分离纯化盐酸小檗碱②进样:取约50mg左右的盐酸小檗碱粗品，用尽量少的无水乙醇溶解制成溶液。用吸管吸取样液沿柱壁四周小心加入,打开层析柱活塞使有溶剂滴下,待液面近与氧化铝表面相平,迅速用少量无水乙醇将柱壁样液洗下,待液面下降后再洗,反复多次,直至表面溶剂无色,让样品完全持留于氧化铝中,并保留有1cm左右溶剂,此时加入少许石英砂覆盖氧化铝表面,并沿管壁加入足量洗脱剂。在此过程中要准确迅速,洗涤溶剂尽量少并尽可能不要扰动,氧化铝表面平整。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤3.氧化铝柱层析分离纯化盐酸小檗碱③洗脱:使溶剂继续滴下,(注意向柱内添加无水乙醇,保持柱体湿润),洗脱样品。按每流分5-10mL收集洗脱液,并着重收集各个色段(从下至上):鲜黄色、桔红色(棕色段可不再洗脱),收集到的洗脱液经浓缩后进行检测鉴定。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤3.氧化铝柱层析分离纯化盐酸小檗碱④氧化铝再生回收:层析后弃去氧化铝柱上端带深色部分,取出剩余氧化铝,依次用10％氢氧化钠溶液和水洗涤,晾干后经400℃烘4-6小时活化再生即可备用。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤4.盐酸小檗碱的鉴定（1）

纸层析鉴定:样品:柱层析分离出的鲜黄色段及桔红色段醇液标准品:盐酸小檗碱醇液展开剂:氯仿-乙醇-0.1mol.L－1盐酸(1∶1∶1，下层)显色方法:自然光或紫外灯下观察,计算各样点Rf值并对各点归属作出判断。纸色谱盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤4.盐酸小檗碱的鉴定（2）

硅胶薄层层析鉴定:样品、标准品、显色方法均同上展开剂:氯仿-氨-甲醇(30∶1∶8)薄层层析盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤4.盐酸小檗碱的鉴定薄层色谱操作:①制板(以硅胶板为例)选择合适的玻璃板(经常使用显微镜上的载玻片)，依次用水和乙醇洗净，晾干。取适量薄层色谱用的硅胶，加适量蒸馏水(最好用5-8/1000的羧甲基纤维素溶液。称取5g羧甲基纤维素在1000ml水中加热至完全溶解，冷却备用)调成糊。调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。将糊倒在玻璃板上，摇动摊平，晾干。使用前放入烘箱内，在105-115oC左右烘干40-50分钟。冷却后使用。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤4.盐酸小檗碱的鉴定薄层色谱操作:②点样将试样用最少量展开剂溶解，用毛细管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量过多。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤4.盐酸小檗碱的鉴定③展开

吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖展开瓶中。展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点。盖上盖子，展开。待展开剂上行到一定高度(由试验确定适当的展开高度)，取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤4.盐酸小檗碱的鉴定④显色，计算Rf值挥发干展开剂，选择合适的显色方法显色。量出展开剂和各组分的移动距离，计算各组分的相对移动值。Rf值指薄层色谱法中原点到斑点中心的距离与原点到溶剂前沿的距离的比值。Rf=溶质移动的距离/溶液移动的距离。各种物质的Rf随要分离化合物的结构，滤纸或薄层板的种类、溶剂、温度等不同而不同，但在条件固定的情况下，Rf对每一种化合物来说是一个特定数值。Rf合适的范围为：0.2<Rf<0.8。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤实验注意事项：1．各地产黄连根茎小檗碱及总生物碱含量分别为4.2-6.7%，6.6-9.6%；栽培种比野生种含量少20％左右。黄连除根茎作药材外，各部位均含小檗碱，黄连须根0.8-5.5％，叶为1.49％，老叶为2.5-2.8％，花为0.56％，种子为0.23％.2．浸泡药材粗粉的硫酸水溶液，浓度不宜过高，一般为0．2-0．3％为宜。若硫酸水溶液浓度过高，小檗碱可成为硫酸氢小檗碱，其溶解度（1：100）明显较硫酸小檗碱（1：30）为小，降低提取效率。硫酸水溶液浸出效果与浸泡时间有关，浸泡12小时约可浸出小檗碱80％，浸泡24小时，可浸出92％。常规浸出应浸泡多次，使小檗碱提取完全，本实验中浸出液只收集第1次的浸泡液。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤实验注意事项：3．盐析时，加入氯化钠的量，以提取液量的10％计算，即可达到析出盐酸小檗碱的目的。氯化钠的用量不宜过多，否则溶液的相对密度增大，造成盐酸小檗碱微细结晶呈悬浮态难以下沉。4．在精制盐酸小檗碱过程中，因盐酸小檗碱放冷极易析出结晶，所以加热煮沸后，应迅速抽滤或保温过滤，防止溶液在过滤过程中冷却，析出盐酸小檗碱结晶，过滤困难，降低收率。盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定—典型产品的分离纯化工艺（四）实验内容及步骤实验注意事项：5．进行柱层析分离时,洗脱过程中需及时补加洗脱剂保持柱体润湿均匀;若柱体干裂,