多聚酶链式反应扩增DNA片段

DNA多聚酶链式反应扩增DNA片断课题2目录上页下页习题参考书返回（一）PCR技术的概念目录上页下页习题参考书返回是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。（二）PCR技术的应用遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定。一、基础知识生物体内DNA分子复制的条件参与的组分在DNA复制中的左右解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸目录上页下页习题参考书返回基本单位目录上页下页习题参考书返回①②③④⑤目录上页下页习题参考书返回ATGCATGC5，端含磷酸基团3，端含羟基3，端5，端目录上页下页习题参考书返回DNA聚合酶的特性DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物。小资料：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。DNA的复制方向3’5’5’目录上页下页习题参考书返回目录上页下页习题参考书返回1、DNA

分子的热变性原理DNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物与两条单链结合在80~100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。(三）PCR原理目录上页下页习题参考书返回高温解决了打开双链的问题，但是，又导致DNA聚合酶失活的问题，耐高温的TaqDNA聚合酶解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化。2、TaqDNA聚合酶的应用目录上页下页习题参考书返回3、PCR反应的条件①DNA模板；②分别与两条模板链相结合的两种引物（引物Ⅰ和引物Ⅱ）；③四种脱氧核苷酸；④耐高温的聚合酶；⑤控制温度，但不需解旋酶；⑥需要在一定的缓冲液中进行。目录上页下页习题参考书返回（四）PCR的反应过程1、PCR的反应步骤

PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个步骤──变性、复性和延伸。循环之前的一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。目录上页下页习题参考书返回950C变性550C复性720C延伸PCR过程第一轮目录上页下页习题参考书返回②DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。①从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸2、PCR的反应结果目录上页下页习题参考书返回二、PCR的实验操作1、PCR仪（一）设备及用具实质上一台能够自动调控温度的仪器PCR仪目录上页下页习题参考书返回2、微量移液器用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次目录上页下页习题参考书返回3、微量离心管一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml目录上页下页习题参考书返回1、准备2、移液（二）实验操作步骤按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。目录上页下页习题参考书返回

盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。注意：3、混合B、手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。A、离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。目录上页下页习题参考书返回将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。

将微量离心管放在离心机上,离心约10s4、离心5、反应目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。目录上页下页习题参考书返回三、操作提示1．PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3．在微量离心管中添加反应成分时，使用一次性枪头。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中进行反应。目录上页下页习题参考书返回（一）理论上DNA扩增数目的计算四、课题成果评价1、一条DNA，复制n次，DNA为2n2、a条DNA，复制n次，DNA为ax2n（二）实验中DNA含量的测定1、原理可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。目录上页下页习题参考书返回2、过程①稀释2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。②对照调零以蒸馏水作为空白对照，在波长26